Kwasy nukleinowe

Biosynteza składników kwasów nukleinowych,

podstawy genetyki, replikacja, transkrypcja i

translacja

Rola nukleotydów

1. Są one aktywowanymi prekursorami

DNA

RNA

2. Pochodne nukleotydów są aktywowanymi związkami pośrednimi w wielu

biosyntezach, np.:

UDP-glukoza

jest prekursorem glikogenu,

S-adenozylometionina

przenosi aktywowany metyl.

3. ATP jest uniwersalną substancją napędową w układach biologicznych.

GTP

bierze udział w przemieszczaniu makrocząsteczek, takich jak powstające
łańcuchy peptydowe na rybosomach, i w aktywacji białek związanych z
kaskada przenoszenia sygnałów.

4. Nukleotydy adeninowe są składnikami trzech głównych koenzymów:

NAD

, FAD

CoA

5. Nukleotydy są regulatorami przemiany materii. Najczęstszym z nich

jest

cykliczny AMP

, który pośredniczy w działaniu wielu hormonów.

Kowalencyjne modyfikacje wprowadzone przez

ATP

zmieniają aktywności

niektórych enzymów, czego przykładem jest np.:

fosforylacja syntazy glikogenowej i adenylacja syntetazy glutaminowej.

Zasady purynowe i pirymidynowe

Nukleozydy i nukleotydy

•Część rybozofosforanowa z zasadach

purynowych i pirymidynowych pochodzi z PRPP

•Biosynteza de-novo

Pierwszy etap biosyntezy puryny:

tworzenie się rybonukleotydu 5-aminoimidazolu z PRPP.

Istotą tych reakcji jest:

1 - zamiana PP

na grupę aminowa pochodzącą z glutaminy,

2 - przyłączenie glicyny,
3 - formylacja przez N

-formylotetrahydrofolian,

4 - przeniesienie atomu azotu z glutaminy,
5 - odszczepienie H

O oraz zamknięcie pierścienia.

U kręgowców enzymy katalizujące reakcje 2, 3 i 5 są zawarte w jednym
łańcuchu polipeptydowym

Drugi etap biosyntezy puryny

: tworzenie inozynianu z rybonukleotydu

5-aminoimidazolu. Istotą tych reakcji jest:

6 - karboksylacja, 7 – dołączenie asparaginianu, 8 - eliminacja fumaranu (pozostawienie grupy
aminowej asparaginianu), 9 - formylacja przez N

-formylotetrahydrofolian, 10 – odszczepienie

cząsteczki wody oraz zamkniecie pierścienia.

U kręgowców enzymy katalizujące etap 6 i 7 są zawarte w jednym łańcuchu polipeptydowym,
podobnie jak te, które katalizują etap 9 i 10

Reakcje te są katalizowane przez dwa enzymy o różnej specyficzności.

Fosforybozylotransferaza adeninowa

katalizuje powstawanie

adenylanu

adenina + PRPP → adenylan + PP

natomiast

fosforybozylotransferaza hipoksantynowa

katalizuje tworzenie

inozynianu

guanylanu

hipoksantyna + PRPP → inozynian + PP

guanina+ PRPP → guanylan + PP

• Trifosforan cytydyny (cytydynotrifosforan, CTP) powstaje z
trifosforanu urydyny (UTP), innego głównego rybonukleotydu
pirymidynowego. Tlen karbonylowy przy C-4 zostaje
zastąpiony przez grupę aminowa. U ssaków donorem grupy
aminowej jest grupa amidowa glutaminy.

• Ssaki, unikając dużego stężenia NH

w osoczu,

wytwarzają go

in situ

z donora grupy aminowej,

którym jest boczny łańcuch glutaminy.

Regulacja biosyntezy pirymidyn
u Escherichia coli

Syntezę deoksyrybonukleotydów

katalizuje reduktaza rybonukleotydowa,

enzym rodnikowy

Syntaza tymidylanowa

katalizuje metylację dUMP do dTMP

dihydrofolian + NADPH + H

→ tetrahydrofolian + NADP

• Przenośnikami fragmentów jednowęglowych są pochodne

tetrahydrofolianu

, a

nie

dihydrofolianu

• Tetrahydrofolian musi być regenerowany z dihydrofolianu, powstającego
podczas syntezy deoksytymidylanu.

• Reakcje te katalizuje

reduktaza dihydrofolianowa

(dehydrogenaza

tetrahydrofolianowa) z udziałem NADPH jako reduktora.

NADP

(

kolor niebieski

) kontaktuje się z folianem (

czerwony

) w miejscu aktywnym reduktazy

dihydrofolianowej (DHFR). NADPH oddziałuje bardzo podobnie z dihydrofolianem w fizjologicznej
reakcji.

• Biosynteza

dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego

(NAD

) zaczyna się od

utworzenia

rybonukleotydu nikotynowego

z nikotynianu i PRPP, Nikotynian

(nazywany również

niacyną

) powstaje z

tryptofanu

• Człowiek może syntetyzować potrzebną ilość nikotynianu, jeśli w diecie otrzyma
odpowiednia dawkę tryptofanu.

• Kiedy ilość tryptofanu w pożywieniu jest niewielka, konieczne jest egzogenne
podawanie nikotynianu.

• Pelagra

jest choroba spowodowaną niedoborem tryptofanu i nikotynianu w

pożywieniu, charakteryzująca się zapaleniem skóry, biegunką i zaburzeniami
psychicznymi.

Dinukleotyd flawinoadeninowy

(FAD) jest

syntetyzowany z ryboflawiny i dwóch cząsteczek ATP.

• Nukleotydy ulęgają w komórkach stałym przemianom.

Nukleotydazy

rozkładają hydrolitycznie

nukleotydy do nukleozydów.

Fosforylazy

nukleozydowe katalizują fosforolityczne rozszczepienie

nukleozydów na wolne zasady i rybozo-1-fosforan (lub deoksyrybozo-1-fosforan).

Fosforybomutaza

izomeryzuje rybozo-1-fosforan do rybozo-5-fosforanu, substratu w syntezie PRPP.

U ludzi

moczan

stanowi końcowy produkt rozkładu

puryn

i jest wydalany z moczem.

•

Moczan sodu

, forma dominująca w obojętnym pH, jest bardziej rozpuszczalny niż

kwas moczowy. Granica jego rozpuszczalności wynosi 7 mg/dl (7 mg/100 mI) w temp.
37°C, stanowi problem dla ludzi, którzy mają w surowicy zwiększone stężenie tego
produktu rozkładu puryny.
•

Hiperurikemia

, nadmierne wytwarzanie moczanu może indukować

dnę

, chorobę

atakującą stawy i nerki. Stan zapalny stawów i uszkodzenie nerek wywołane jest przez
wytrącanie się kryształów moczanu sodu.

• Moczan ma również wyraźnie korzystne działanie. Jest on bardzo wydajnym związkiem
usuwającym wysoce reaktywne i szkodliwe formy tlenu, mianowicie rodniki
hydroksylowe, aniony ponadtlenkowe, tlen singletowy i utlenione związki pośrednie
hemu z Fe o wysokich stanach wartościowości ( + 4 i + 5).

• Moczan jako

przeciwutleniacz

jest równie skuteczny jak askorbinian i może

wydatnie przyczyniać się do przedłużenia życia ludzkiego i do zmniejszenia
zapadalności na choroby nowotworowe.

DNA – składniki i budowa

W 1950 roku

Erwin Chargaff

stwierdził, ze stosunki ilościowe

adeniny do tyminy i guaniny do cytozyny są bliskie 1,0 dla DNA
wszystkich badanych gatunków.

Reguła Chargaff’a:

[A]=[T]; [C]=[G];
[pirymidyny]=[puryny]

Nośnikiem informacji genetycznej
są zasady zawarte w cząsteczkach
DNA, podczas gdy reszty cukrowe i
fosforanowe pełnią rolę
strukturalną.

Kolejność zasad w łańcuchu
polinukleotydowym nie jest w
żaden sposób ograniczona.

Ściśle określona sekwencja

zasad niesie informacje

genetyczną.

• James D. Watson, Biologia molekularna genu (1965, 2 wyd. pol., PWN, Warszawa 1975)
• James D. Watson, Podwójna spirala: relacja naoczna o wykryciu struktury DNA

(1968, wyd. pol., Wiedza Powszechna, Warszawa 1975).

• James D. Watson, DNA pasją mojego życia, Amber, Warszawa 2001,
• James D. Watson oraz Andrew Berry, DNA: tajemnica życia , Warszawa 2005

J.D. Watson, F.H.C. Crick

Nature, 23.04.1953

Molecular Structure

of Nucleic Acids

• W 1953 roku James Watson i Francis Crick

wydedukowali przestrzenną strukturę DNA i

bezpośrednio z niej wnioskowali o

mechanizmie replikacji DNA.

• To błyskotliwe osiągnięcie uznano za jedno z

najznakomitszych w historii biologii, ponieważ

otworzyło drogę do zrozumienia działania genu

na poziomie molekularnym.

J.D. Watson, F.H.C. Crick

Nature, 30.05.1953

Genetical Implications

of the Structure

of Deoxyribonucleic acid

• Watson i Crick analizowali obrazy
dyfrakcji promieni rentgenowskich na
DNA uzyskane przez

Rosalind Franklin

Maurice'a Wilkinsa

i na tej podstawie

zaproponowali model DNA.

"Jeżeli znana jest kolejność zasad jednego łańcucha,

dzięki specyficzności parowania zasad można podać dokładny

porządek zasad drugiego łańcucha. A wiec jeden łańcuch jest

komplementarny do drugiego i właśnie ta cecha sugeruje, w jaki

sposób cząsteczka DNA może się powielać.

Wcześniejsze dyskusje o samopowielaniu zawierały

zwykle koncepcje matrycy, czyli formy. Koncepcja matrycy

zakładała albo jej bezpośrednie kopiowanie, albo tworzenie

"negatywu" , który następnie stanowił matryce dla tworzenia

"pozytywu”. Nigdy dokładnie nie wyjaśniono, w jaki sposób

proces ten zachodzi na poziomie atomowym i cząsteczkowym.

Nasz model DNA stanowi parę matryc, przy czym każda

jest komplementarna do drugiej. Wyobrazimy sobie, ze przed

duplikacja wiązania wodorowe ulęgają zerwaniu. a dwa łańcuchy

rozpłatają się i rozdzielają. Każdy łańcuch może wtedy działać jako

matryca dla tworzenia nowego łańcucha, tak ze ostatecznie

powinniśmy mieć dwie pary łańcuchów tam, gdzie przedtem była

tylko jedna. Sekwencje zasad zostaną w ten sposób dokładnie

podwojone”.

J.D. Watson, F.H.C. Crick
Nature, 1953 r.

i stała się jasność…..

Rozdzielanie

N-DNA i

N-DNA metoda wirowania

w gradiencie gęstości.
A - zdjęcie kuwety ultrawirówkowej w ultrafiolecie
(UV); B - densytometryczny wykres zdjecia w UV.

Watson i Crick zaproponowali, że jedna z nici
każdej potomnej cząsteczki DNA jest
syntetyzowana de novo, a druga pochodzi z
rodzicielskiej cząsteczki DNA. Takie rozdzielenie
rodzicielskich atomów nazywamy

semikonserwatywnym

Meselson i Stahl stwierdzili, „że azot cząsteczki DNA jest równo dzielony miedzy dwie fizycznie
ciągle podjednostki, że w wyniku duplikacji każda z cząsteczek potomnych otrzymuje po
jednej podjednostce i ze podjednostki te są zachowywane przez wiele duplikacji".

Model struktury DNA

•

Dwa łańcuchy polinukleotydowe,
biegnące w przeciwnych kierunkach,
okrecają się wokół wspólnej osi
tworząc

prawoskretną, dwuniciową

helisę

•

Zasady purynowe i pirymidynowe
znajdują się wewnątrz helisy,
natomiast reszty fosforanowe i
deoksyrybozowe są na zewnątrz.

• Para (

A=T

) połączona jest przez dwa precyzyjnie

skierowane wiązania wodorowe, a para (

G≡C

) przez

trzy takie wiązania.

• Struktura dwuniciowej helisy jest także stabilizowana
oddziaływaniami miedzy zasadami jednej nici, które
określa się mianem asocjacji warstwowej.

• Średnica helisy wynosi 2,0 nm.

• Odległość między sąsiednimi zasadami,
mierzona wzdłuż osi helisy, wynosi 0,34 nm.

• Zasady te są skręcone względem siebie
pod kątem 36°.

• Na całkowity skręt helisy przypada wiec
po 10 nukleotydów w każdym łańcuchu, co
daje okres powtarzalności równy 3,4 nm.

•

Animacja struktury DNA

Pierścienie zasad azotowych jednej pary zasad DNA nie leża dokładnie
w jednej płaszczyźnie. Są one skręcone względem siebie jak łopaty śmigła.

Nakładanie się pary zasad G-C (

kolor niebieski

) na parę A-T (

czerwony

). Położenie

wiązań glikozydowych (

zielony

) oraz atomów C

1’

deoksyrybozy w obu parach zasad jest

prawie identyczne

Centralny dogmat biologii molekularnej

•Animacja – centralny dogmat
biologii

molekularnej

Replikacja DNA

•

W roku 1958 Arthur Kornberg i jego współpracownicy

wyizolowali z E. coli enzym, który katalizuje syntezę DNA. Enzym
ten nazwali

polimeraza DNA

; obecnie enzym ten nazywa się

polimerazą DNA l W replikacji DNA uczestniczy więcej niż 20
białek wzajemnie oddziałujących w bardzo skomplikowany i
skoordynowany sposób.
• Polimeraza DNA l jest pojedynczym łańcuchem
polipeptydowym o masie
cząsteczkowej 103 kDa.

Do syntezy łańcucha DNA polimeraza DNA l potrzebuje następujących
składników:

Wszystkich czterech aktywowanych prekursorów - 5'-trifosforanów deoksyrybo-

nukleozydów: dATP, dGTP, dTTP i dCTP; konieczna jest też obecność jonów Mg

• Odcinka starterowego (primera), gdyż polimeraza DNA l dołącza
deoksyrybonukleotydy do wolnej grupy 3'-hydroksylowej juz istniejącego odcinka DNA.

Matrycy DNA jako istotnego składnika układu. Matryca może być DNA jedno- lub

dwuniciowy. Dwuniciowy DNA jest efektywną matrycą tylko wtedy, gdy jego rdzeń
fosforanowo-rybozowy ulegnie zerwaniu co najmniej w jednym miejscu.

Elongacja łańcucha

DNA odbywa się w

kierunku 5' →3'

Polimeraza DNA katalizuje tworzenie się wiązań fosfodiestrowych tylko

wtedy, gdy zasada przyłączanego nukleotydu jest komplementarna do zasady w
łańcuchu stanowiącym matryce, tj. gdy tworzy z nią parę typu Watsona-Cricka.

•

Polimeraza DNA jest

enzymem

instruowanym przez

matrycę

•

Dzięki tej właściwości polimerazy DNA I replikacja DNA

przebiega bardzo wiernie, a błędy pojawiają się nie częściej niż

jedna zasada mylna na 10

zasad poprawnych

•

Polimeraza DNA I może prowadzić hydrolizę DNA z podobną efektywnością jak

jego syntezę. Enzym katalizuje hydrolizę nukleotydów, które

nie tworzą pary

typu

Watsona-Cricka poczynając od końca 3' łańcucha DNA.

• Innymi słowy polimeraza DNA I jest

egzonukleazą

3'→ 5'.

•Inna właściwością polimerazy DNA I jest jej zdolność do korygowania
pomyłek przez eliminację nukleotydów nie dopasowanych do matrycy.

Polimeraza DNA I jako egzonukleaza 3'→ 5'

•

Polimeraza DNA I usuwa niesparowane

nukleotydy na końcu odcinka starterowego
przed rozpoczęciem polimeryzacji.

• Polimeryzacja zwykle nie zachodzi dopóki
para zasad nie jest dopasowana do helisy.
Jakikolwiek błąd popełniony na tym etapie jest
niemalże zawsze poprawiany przed dodaniem
kolejnego nukleotydu.

• W efekcie polimeraza DNA I sprawdza wynik
każdego przyłączenia nukleotydu
przed przystąpieniem do następnego cyklu
katalitycznego.

•

Polimeraza DNA I może także hydrolizować

DNA poczynając od końca 5‘ łańcucha.

•

Ta aktywność egzonukleazowa 5'→3' jest

zupełnie inna od omawianej poprzednio
aktywności egzonukleazowej 3'→5'.

•

Cięcie może zachodzić na końcowym
wiązaniu fosfodiestrowym lub na wiązaniu
oddalonym o kilka reszt od końca 5'.

•

Przecinane wiązanie musi znajdować się w
rejonie dwuniciowym.

•

Aktywność egzonukleazowa 5' → 3‘
wzmagana jest przez towarzyszącą jej
syntezę DNA.

•

Miejsce katalityczne odpowiedzialne za te
aktywność w enzymie jest wyraźnie
oddzielone od miejsca aktywnego
polimeryzacji i hydrolizy 3' → 5'.

Aktywność egzonukleazowa 5'→3‘ polimerazy I

Polimerazy II i III

Polimerazy DNA II i III są podobne do polimerazy I:

•

Katalizują syntezę DNA sterowana przez matryce, wykorzystując jako

substraty trifosforany deoksyrybonukleozydów.

•

Wymagają odcinka starterowego z wolna grupa 3'-OH.

•

Synteza łańcucha DNA zachodzi w kierunku 5' → 3'.

•

Posiadają one aktywność egzonukleazową 3' → 5'.

Kompleks zawieraj

polimeraz

DNA III syntetyzuje wi

kszo

ść

nowego DNA, natomiast

polimeraza

I usuwa startery i uzupe

nia

niewype

nione przerwy.

Polimeraza

DNA II wsp

dzia

a podczas

naprawy DNA, lecz nie jest potrzebna do replikacji DNA.

Autoradiografia replikującego DNA z E. coli.

•

Replikujący DNA u E. coli ma kształt

zamkniętego koła z wewnętrzną pętlą . Ten
ksztalt, zwany

strukturą theta

, ponieważ

przypomina grecka literę

• Synteza nowego DNA związana jest ściśle z
rozwijaniem się rodzicielskiego DNA. Miejsce
jednoczesnego rozwijania i syntezy DNA nazywa
się

widełkami replikacyjnymi

•

Wszystkie znane polimerazy DNA

syntetyzują DNA w kierunku 5' →3',

•nigdy natomiast w kierunku 3' →5'.

Fragmenty Okazaki

•

Część nowo syntetyzowanego DNA występuje w postaci krótkich

fragmentów (zwanych fragmentami Okazaki). Te jednostki o długości ok. 1000
nukleotydów występują w sąsiedztwie widełek replikacyjnych.

Podczas replikacji fragmenty te są łączone przez

ligazę DNA

tworząc nic

potomną.
• Druga nić jest syntetyzowana w sposób ciągły.
•Nić powstająca z fragmentów Okazaki nazywa się

nicią opóźnioną

, natomiast

syntetyzowana bez przerw -

nicią prowadzącą

•Zarówno fragmenty Okazaki, jak i nić prowadząca są syntetyzowane w
kierunku 5' →3'.

Ligaza DNA

to enzym. który katalizuje

tworzenie się wiązania
fosfodiestrowego między grupą 3'-OH
jednego końca nici DNA i grupą 5'-
fosforanową drugiego końca cząsteczki
DNA

•

Replikacja DNA rozpoczyna się od

krótkiego odcinka RNA, który jest
syntetyzowany przez

polimerazę RNA -

prymazę

. Ten odcinek starterowy jest

usuwany w dalszym etapie replikacji DNA

Mutacje

Znanych jest kilka typów mutacji:
1.

Substytucja

(podstawienie) jednej pary zasad zamiast innej;

Delecja

(usunięcie) jednej lub większej liczby par zasad;

Insercja

(wstawienie) jednej lub większej liczby par zasad.

Tworzenie pary przez rzadki tautomer adeniny (A *) z cytozyna prowadzi w
następnym pokoleniu do powstania pary G.C

5-Bromouracyl, analog tyminy, czasem
tworzy parę z guanina zamiast z adenina.

• Grupa metylowa tyminy jest znacznikiem różniącym te zasadę od deaminowanej cytozyny.

• Gdyby tymina nie była składnikiem DNA, prawidłowo wbudowany uracyl byłby
nieodróżnialny od uracylu powstałego przez deaminację cytozyny.

• Uszkodzenie mogłoby pozostać nie zauważone, co spowodowałoby mutacje G-C do A-U w
jednej z nici potomnych.

• Mutacja taka nie zachodzi, gdyż system naprawy poszukuje w cząsteczkach DNA reszt
uracylu, natomiast pozostawia nietknięte reszty tyminy.

• Tymina występuje w DNA zamiast uracylu, gdyż zwiększa wierność zapisu genetycznego.

• RNA, w przeciwieństwie do DNA, nie podlega naprawie, dlatego tez do jego syntezy
zużywany jest uracyl jako element, którego synteza wymaga mniejszego nakładu energii.

RNA – składniki i budowa

RNA

• Cząsteczki RNA zwykle są zbudowane z pojedynczej nici, wyjątek
stanowa dwuniciowe RNA niektórych wirusów.

• Proporcje stężeń poszczególnych zasad nie spełniają reguł
komplementarności. W większości cząsteczek RNA zawartość
adeniny różni się od zawartości uracylu, a stężenie guaniny jest inne
niż stężenie cytozyny.

•

Cząsteczki RNA zawierają jednak rejony o

budowie dwuniciowej helisy, tworzące
struktury określane jako spinki do włosów.
W rejonach tych A tworzy pary z U, a G z C.

• Często jednak w spinkach RNA zasady
nie tworzą idealnych par typu Watsona-
Cricka

•

Informacyjny RNA

(

mRNA

) stanowi matryce do syntezy białek.

•

Transferowy RNA

(

tRNA

) przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów, gdzie dochodzi

do połączenia sieę wiązaniami peptydowymi w kolejności determinowanej przez matryce mRNA.
Dla każdego z 20 aminokwasów istnieje co najmniej jeden rodzaj tRNA.

•Rybosomowy RNA

(

rRNA

), główny składnik rybosomów, pełni podczas biosyntezy białka

funkcje zarówno katalityczne, jak i strukturalne.

•

Komórki eukariotyczne

dodatkowo zawierają

niskocząsteczkowe RNA

, np.

niskocząsteczkowe jądrowe RNA (ang. smalt nuclear RNA - snRNA), biorące udział w usuwaniu
intronów i łączeniu eksonów RNA (tj. uczestniczące w splicingu RNA).
•

Niskocząsteczkowe RNA

w cytozolu odgrywają role w kierowaniu nowo syntetyzowanych

wewnątrzkomórkowych białek na zewnątrz komórki lub do określonych przedziałów
wewnątrzkomórkowych.

Doświadczenie Jacoba i Monoda

E. coli zainfekowana bakteriofagami T2

• Prawie wszystkie białka produkowane w
zainfekowanych bakteriach są genetycznie
zdeterminowane przez infekującego faga.

• Syntezie tych białek nie towarzyszy
ogólna synteza RNA, a w szczególności po
zainfekowaniu bakterii nie zachodzi
synteza rybosomowych RNA lub
transferowych RNA.

• Wkrótce po infekcji pojawia się jednak w
niewielkich stężeniach frakcja RNA o
krótkim czasie półtrwania, a skład
nukleotydowy tego RNA jest podobny do
składu DNA fagowego

Doświadczenie Jacoba i Monoda

Doświadczenie wykazało, że:

Rybosomy nie były syntetyzowane po infekcji, czego

dowodził brak "lekkich" rybosomów.

• Po infekcji zachodziła synteza RNA. Większość
RNA znakowanego izotopem

P pojawiała się we

frakcji "ciężkich" rybosomów. Znaczyło to, że
większość nowo syntetyzowanego RNA była
zasocjowania z rybosomami powstałymi przed
infekcją. Nowo syntetyzowany RNA ulegał podczas
namazania fagów bardzo szybkiej przemianie.

• Radioizotop

S przejściowo pojawiał się we frakcji

"ciężkich" rybosomów, co wskazuje, ze nowe białka
są syntetyzowane na starych rybosomach.

Rybosomy są niewyspecjalizowanymi
strukturami syntetyzującymi białko zgodnie
z instrukcją zawarta w informacyjnym RNA,
który w danym momencie znalazł sie na
rybosomie.
Informacyjny RNA przenosi informacje
genetyczną z genu do białka.

• Polimeraza RNA, podobnie jak polimerazy DNA czerpie instrukcje
z matrycy DNA.

• Jeśli RNA i DNA maja sekwencje komplementarne, to może
utworzyć się hybryd RNA-DNA.

•

Sekwencje zasad w mRNA i jego matrycowym DNA są

komplementarne.

Transkrypcja

Polimeraza RNA potrzebuje następujących składników:

Matrycy.

Optymalną matryca jest dwuniciowy DNA. Jako matryca może także służyć

jednoniciowy DNA. Jedno- lub dwuniciowy RNA nie jest efektywną matrycą, podobnie jak
hybrydy DNA-RNA.
2.

Aktywowanych prekursorów

. Konieczne są wszystkie cztery trifosforany

rybonukleozydów: ATP, GTP, UTP i CTP.
3.

Dwuwartościowego jonu metalu

. Efektywne są Mg

lub Mn2+. In vivo wymagania te

spełnia Mg

Polimeraza RNA

Synteza RNA prowadzona przez polimerazę RNA z E. coli, podobnie jak prawie
wszystkie biologiczne reakcje polimeryzacji, zachodzi w trzech etapach:

inicjacji,

elongacji, terminacji

Polimeraza RNA pełni wiele funkcji w tym procesie:

• Poszukuje na DNA miejsc inicjacji transkrypcji. DNA E. coli ma około 2000 miejsc
promotorowych w genomie o wielkości około 4. 10

par zasad.

• Rozwija krótki odcinek dwuniciowego DNA tworząc jednoniciową matryce, z której
czerpie instrukcje.

• Selekcjonuje odpowiedni trifosran rybonukleozydu i katalizuje tworzenie wiązania
fosfodiestrowego. Proces ten powtarzany jest wielokrotnie w trakcie
jednokierunkowego przesuwania się enzymu wzdłuż matrycowego DNA.

• Polimeraza RNA jest enzymem procesywnym - transkrypt jest syntetyzowany od
początku do końca przez pojedyncza cząsteczkę enzymu.

• Wykrywa sygnały terminacji, wyznaczające koniec transkrypcji.

• Oddziałuje z białkami represorowymi i aktywującymi, które w szerokim, zakresie
dynamicznym modulują szybkość transkrypcji. Ekspresja genów jest kontrolowana
głównie na poziomie transkrypcji.

•

Animacja transkrypcji

Start transkrypcji

Matryce DNA zawierają rejony, zwane

promotorami

, które w specyficzny sposób

wiążą polimerazy RNA i determinują miejsca startu transkrypcji.

Elongacja

Model bąbla transkrypcyjnego w trakcie wydłużania transkryptu RNA (elongacji).
Dupleks DNA rozplatany jest na początku polimerazy RNA i ponownie zaplatany
na końcu enzymu. Hybryd RNA-DNA obraca się synchronicznie.

Polimeraza RNA nie ma aktywności nukleazowej.

W przeciwieństwie do polimerazy DNA, polimeraza RNA nie sprawdza nowo
podczas syntezy RNA to średnio jedna pomyłka na 10

-10

, około 10

razy częściej niż w

trakcie syntezy DNA. Znacznie mniejsza dokładność syntezy RNA może być jednak
tolerowana, ponieważ pomyłki te nie są przekazywane potomstwu.

Transkrypcja i translacja są ściśle powiązane ze sobą u prokariotów,

natomiast u eukariotów są przestrzennie i czasowo rozdzielone.

Przestrzenne i czasowe rozdzielenie transkrypcji i translacji umożliwia
organizmom eukariotycznym wielostopniowa i precyzyjna regulacje ekspresji
genów. Wpływa to na bogactwo eukariotycznych form i funkcji.

Modyfikacje potranskrypcyjne

Po syntezie przeprowadzonej przez polimerazę RNA u prokariotów cząsteczki mRNA
podlegają niewielkiej modyfikacji lub nie ulęgają jej wcale. W istocie wiele z nich ulega
juz translacji, choć nie jest jeszcze zakończoną transkrypcja.

•

Natomiast cząsteczki transportujących i

rybosomowych RNA wytwarzane są
przez rozcięcie i inne modyfikacje nowo
powstałych łańcuchów RNA.

• Na przyklad u E. coli trzy rodzaje
rybosomowego RNA oraz cząsteczka
transportującego RNA są wycinane z
pojedynczego pierwotnego transkryptu
zawierającego również rejony rozdzielające
(ang. spacer).

• Drugim rodzajem dojrzewania jest dodawanie nukleotydów do końców niektórych
łańcuchów RNA.

• Trzecią grupą reakcji dojrzewania RNA są modyfikacje zasad i reszt rybozy
rybosomowych RNA.

• Nietypowe zasady znajduje się we wszystkich cząsteczkach tRNA.

•

Dojrzewanie prekursora tRNA tyrozynowego drożdży. 14-nukleotydowy intron

(

kolor żółty

) jest usuwany, a niektóre zasady ulęgają modyfikacji. Sekwencja liderowa 5‘

(

zielony

) zostaje odcięta, do końca 3' zostaje dołączona sekwencja CCA (

czerwony

• Animacja

modyfikacji

• Splicing

jest bardzo skomplikowanym procesem, przeprowadzonym przez

spliceosomy

, zbudowane z wielu białek i niewielkich cząsteczek RNA.

• Ten skomplikowany aparat enzymatyczny rozpoznaje sygnały w nowo powstałym
RNA, które wyznaczają miejsca

wycięcia intronów

połączenia eksonów

• Prawie zawsze introny rozpoczynają się od

i kończą na sekwencji

poprzedzanej przez

ciąg bogaty w pirymidyny

. Ta sekwencja, wykazującą dużą

zgodność dla różnych genów, jest częścią

sygnału splicingu

• Gen łańcucha

hemoglobiny w obrębie

sekwencji kodującej aminokwasy jest
przerwany przez dwie sekwencje intronowe:
długa (550 zasad) i krótka (120 zasad). Tak
wiec gen łańcucha

globiny jest

rozszczepiony na trzy sekwencje kodujące.

Odcinki ulęgające usunięciu z pierwotnego
transkryptu są nazywane

intronami

, a odcinki

zachowywane w dojrzałym mRNA

eksonami

t-RNA i translacja

•

Aktywacja aminokwasów

oraz ich związanie z tRNA jest katalizowane przez specyficzne

syntetazy aminoacylo-tRNA

, zwane również enzymami aktywującymi. Pierwszym etapem

reakcji jest tworzenie

aminoacyloadenylanu

z aminokwasu i ATP.

• Związek ten jest mieszanym bezwodnikiem, w którym grupa karboksylowa aminokwasu
jest związaną z grupa fosforylową AMP; stąd związek ten nazywa się również

aminoacylo-

AMP

• Kolejnym etapem jest przeniesienie grupy aminoacylowej aminoacylo-AMP na cząsteczkę
tRNA z utworzeniem

aminoacylo-tRNA

Suma obu reakcji aktywacji i przeniesienia jest równanie:

Reakcja sumaryczna trzech reakcji cząstkowych jest silnie egzoergiczna:

Wszystkie znane tRNA maja następujące
cechy wspólne:

• Ich pojedynczy łańcuch zawiera 73-93
rybonukleotydów (okolo 25 kDa).

• Zawierają wiele nietypowych zasad,
zazwyczaj 7-15 na cząsteczkę.

• Koniec 5' wszystkich tRNA jest
fosforylowany.

• Nukleotydem końcowym jest zwykle pG.

• Na końcu 3' wszystkich tRNA znajduje się
sekwencja CCA.

• Aktywowany aminokwas jest przyłączony do grupy 3'-hydroksylowej
ostatniej adenozyny.

• Mniej więcej połowa nukleotydów tRNA jest sparowana i tworzy dwuniciowe helisy. Można
wyróżnić pięć grup nieparujących się zasad: sekwencja CCA na końcu 3'; pętla TΨC,; ramię
dodatkowe, pętla DHU, pętla antykodonowa.

• Pętla antykodonowa zawiera siedem zasad o następującej sekwencji:

• Na etapie terminacji transkrypcji formowanie wiązań fosfodiestrowych ustaje, z
hybrydu RNA-DNA oddysocjowuje RNA, stopiony rejon DNA ponownie się splata, a
polimeraza RNA uwalnia DNA.

•

Terminacja

transkrypcji jest równie dokładnie kontrolowana jak inicjacja syntezy

RNA. Transkrybowane rejony

matrycy DNA zawierają sygnały stop

•

Najprostszy z nich to palindromowy rejon bogaty w pary G-C, za którym występuje

rejon bogaty w A-T. RNA transkrybowany z takiego palindromowego DNA zawiera
rejony wzajemnie komplementarne.
•

Stąd właśnie zasady RNA mogą parować się tworząc strukturę spinki do

włosów, zawierająca ramie i pętlę.

Terminacja

•

Antykodon tRNA jest odpowiedzialny za rozpoznanie kodonu na mRNA.

• Istota tego rozpoznania jest tworzenie się komplementarnych par zasad
kodonu i antykodonu.

• Który z kodonów jest rozpoznawany przez ten hybrydowy tRNA: alaninowy
czy cysteinowy?

Aminokwas związany w aminoacylo-tRNA nie gra żadnej roli w
rozpoznawaniu kodonów .

Niektóre cząsteczki tRNA mogą rozpoznawać więcej niż jeden kodon

•

Dwie pierwsze zasady kodonu

tworzą pary z zasadami antykodonu w

sposób standardowy

Rozpoznanie jest precyzyjne. Wynika stąd, że kodony różniące się zasadami w jednej z
pierwszych dwóch pozycji muszą być rozpoznawane przez różne cząsteczki tRNA.

• Pierwsza zasada antykodonu decyduje o tym, czy dany tRNA rozpoznaje jeden, dwa czy
trzy rodzaje kodonów:

lub

w tej pozycji umożliwia rozpoznanie jednego kodonu,

lub

dwóch, zaś

– trzech kodonów.

•

Degeneracja kodu genetycznego

wynika po części ze swobodniejszego parowania się

trzeciej zasady kodonu z pierwszą zasada antykodonu.

•

Inozyna

umożliwia cząsteczce tRNA odczytanie maksymalnej liczby trzech kodonów.

Inozyna jest tworzona w tRNA w reakcji deaminacji adenozyny na poziomie transkryptu.

Mikrografie elektronowe: A podjednostek 30S; B - podjednostek 50S, C - rybosomów 70S.

• Białka są syntetyzowane w kierunku od końca aminowego do karboksylowego

• Translacja informacyjnego RNA przebiega w kierunku 5’ → 3’

• Informacyjny RNA ulega translacji prowadzonej
równocześnie przez kilka rybosomów

Etap inicjacji biosyntezy białka:
po utworzeniu kompleksu inicjującego
30S formuje się kompleks inicjujący 70S

Tworzenie wiązania peptydowego zachodzi w centrum katalitycznym
peptydylotransferazy w rybosomie

Wydłużający się łańcuch peptydowy jest przenoszony na grupę aminowa wprowadzonego
aminoacylo-tRNA. Reakcja ta zachodzi przez atak nukleofilowy atomu azotu grupy aminowej
aminoacylo-tRNA na atom węgla tworzący wiązanie estrowe fMet-tRNA

(lub peptydylo-tRNA)

Cykl elongacyjny syntezy białka: wiązanie aminoacylo-tRNA, tworzenie wiązania peptydowego i translokacja.

Miejsce A

(aminoacylowe) - kolor zielony,

miejsce P

(peptydylowe)- żółty,

miejsce E

(wyjścia) - niebieski.

Po utworzeniu wiązania peptydowego, lecz przed translokacja, dwa tRNA zajmują inne miejsca w obrębie podjednostki 50S niż w
obrębie podjednostki 30S. Taki stan hybrydowy może powstać na skutek przechylenia się cząsteczek tRNA (jak przedstawiono na
rysunku) lub wskutek ruchu podjednostki 50S względem podjednostki 30S

Document Outline