Biochemia dla Biologii nr ETCS
Badanie właściwości białek
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
1
ZADANIE 2
TYTUŁ: BADANIE WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK
Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć
wiczeń
Materiały i urządzenia:
• Materiały
1. roztwór kazeiny
2. roztwory odpowiednich białek
3. białko jaja kurzego
4. CuSO
4
10%
5. NaOH 0,01M
6. HCl 0,01M
7. chlorek cyny (II)
8. octan ołowiu (II)
9. bufor octanowy, pH=7,4
10. stężony kwas azotowy
11. żelazocyjnek potasu
12. kwas trójchlorooctowy 6%
• Urządzenia
1. probówki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
5. łaźnie wodne
INFORMACJE TEORETYCZNE:.
Przy pewnej określonej wartości pH cząsteczki białka obdarzone są jednakowa liczba
ładunków elektrycznych dodatnich i ujemnych, czyli są elektrycznie obojętne. Takie pH
roztworu nazywa się punktem izoelektrycznym danego białka. Oznaczanie oparte jest na
najmniejszej rozpuszczalności kazeiny w punkcie izoelektrycznym. Przez dobór
odpowiednich stężeń kwasu octowego i octanu sodu w poszczególnych probówkach, uzyskuje
się roztwory o różnych wartościach pH. Wartość pH w probówce, w której wystąpi
najobfitszy osad odpowiada punktowi izoelektrycznemu kazeiny.
Białka, ze względu na charakter amfoteryczny, mogą reagować zarówno z kationami
jak też anionami tworząc odpowiednie sole. Z kationami metali alkalicznych dają sole dobrze
dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast z kationami metali ciężkich tworzą sole
nierozpuszczalne. Aniony białkowe tworzą nierozpuszczalne białczany z metalami ciężkimi,
natomiast kationy białkowe dają nierozpuszczalne sole z anionami kwasowymi
Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie,
wysychanie, ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe i wstrząsanie wodnych roztworów
białka w atmosferze powietrza. Denaturacja cieplna prowadzi do koagulacji, której istota jest
rozwiniecie łańcuchów polipeptydowych i zlepienie ich w duże agregaty. Denaturacja białek
nie jest równoznaczna z koagulacja, ponieważ wiele białek zdenaturowanych pozostaje
w roztworze. Spowodowane to jest odpowiednim pH środowiska, różnym od pH
punktuizoelektrycznego. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady, jony metali
ciężkich, detergenty, fenol, chloroform, alkohol i aceton.
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Badanie właściwości białek
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
2
Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1:
oznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
Przygotować 9 suchych i czystych probówek, oznaczyć je kolejno numerami. Do
pierwszej odmierzyć 3,2 ml l M roztworu CH
2
COOH i 6,8 ml wody destylowanej, a
do pozostałych ośmiu - po 5 ml wody. Zawartość pierwszej probówki dokładnie
wymieszać, następnie pobrać z niej 5 ml roztworu i przenieść do drugiej probówki.
Z tej, po dokładnym wymieszaniu 5 ml do probówki trzeciej. Czynność te powtarzać
dochodząc kolejno do probówki dziewiątej, z której po zmieszaniu zawartości
odrzucić 5 ml roztworu.. Do każdej probówki wprowadzić l ml roztworu kazeiny
dokładnie wymieszać zawartość. Odstawić i po 20 minutach odczytać wynik. Brak
zmętnienia (-) lub różne stopnie zmętnienia (+, ++, +++) wpisać do tabelki. Podać
punkt izoelektryczny kazeiny.
Nr probówki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Liczba ml 1 M
CH
3
COOH
1,6
0,8
0,4
0,2
0,1
0,05
0,025
0,012
0,006
pH roztworu
3,5
3,8
4,1
4,4
4,7
5,0
5,3
5,6
5,9
Zmętnienie
Podzadanie 2: strącanie białek kationami metali ciężkich i anionami kwasowymi
Do trzech probówek odmierzyć po 2 ml białka kationowego, anionowego lub
obojnaczego. Do każdej probówki dodać ostrożnie po l kropli 10% CuS04.
Obserwować czy powstaje osad. Unikać nadmiaru odczynnika, gdy_ stracony osad
rozpuszcza się w nim. Wynik zanotować w tabelce oznaczając powstanie osadu (+)
lub brak osadu (-). Doświadczenie powtórzyć z pozostałymi odczynnikami.
Odczynnik
Białko anionowe
Białko obojnacze
Białko kationowe
Siarczan miedzi (II)
Chlorek cyny (II)
Octan ołowiu (II)
Żelazocyjanek potasu
Wyjaśnij:
1. Czy białka w punkcie izoelektrycznym reagują z kationami metali i anionami kwasowymi?
2. Jaka forma białka wytraca się w obecności kationów a jaka w obecności anionów?
3. Czy białko kationowe reaguje z kationami metali?
4. Dlaczego w zatruciach metalami ciężkimi podaje się mleko lub białko jaja?
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Badanie właściwości białek
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
3
Podzadanie 3:
Cieplna denaturacja i koagulacja białka
Do probówek odmierzyć po 2 ml 1% roztworu białka jaja kurzego i dodać kolejno:
do pierwszej probówki 0,2 ml 0,01 M roztworu HC1 (pH 3), do drugiej - 0,2 ml
buforu octanowego o pH 4,7, do trzeciej - 0,2 ml 0,01 M roztworu NaOH (pH 11).
Wszystkie probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Oziębić.
Zapisać wynik obserwacji. Następnie do probówek l i 3 dodać po 2 ml 0,01 M
buforu octanowego o pH 4,7. Zaobserwować wynik doświadczenia.
Podzadanie 4: Chemiczna denaturacja białka – wpływ kwasu trójchlorooctowego
Do l ml roztworu białka jaja kurzego dodać 10 ml 6% kwasu trójchlorooctowego.
Szklana bagietka przenieść stracony osad białkowy do probówki z woda lub zasada.
Zapisać wyniki obserwacji i podać odpowiednie wnioski.
Podzadanie 5: Chemiczna denaturacja białka – odczyn Hellera
Wlać do probówki l ml stężonego kwasu azotowego, następnie próbówkę nachylić i
wolno po ściance wprowadzić l ml białka jaja kurzego, tak aby płyny nie zmieszały
się. Wyjaśnić wynik obserwacji oraz porównać próbę Hellera z próbą
ksantoproteinową.
LITERATURA
1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze
2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze
3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002
4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002
5. Zarys Biochemii Cz.1, Karlson P., Pwn W-Wa 1987
6. Biochemia kręgowców”, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 1998, 2004
7. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003
8. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997
9. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997