Ćwiczenia 6                  14,11,12

T : Barwienie proste

BARWIENIE

                                BARWNIKI STOSOWANE W MIKROBIOLOGII :

W mikrobiologii najczęściej stosuje się barwniki anilinowe, składające się z:
                 * grupy chromoforowej (jon barwny)
                 * grupy auksochromowej (jon bezbarwny), tworzącej sole z różnymi substratami i 
wiążącej barwnik z komórką. 

Ze względu na ładunek grupy chromoforowej wyróżniamy:

1) barwniki zasadowe
sole, w których jonem barwnym jest kation, np.: 
- błękit metylenowy, 
- fiolet krystaliczny, 
- fiolet goryczki, 
- fuksyna zasadowa, 
- safranina, 
-zieleń malachitowa

2) barwniki kwaśne
sole, w których jonem barwnym jest anion, np.: 
- eozyna alkoholowa, 
- fuksyna kwaśna,
- kwas pikrynowy, 
- zieleń metylowa, 
- czerwień Kongo

                              INNE ZWIĄZKI WYMAGAJĄCE BARWLIWOŚCI :

* Związki wzmagające barwliwość
              - kwas octowy i szczawiowy
              - fenol
              - KOH
              - anilina
              - formaldechyd
              - płyn Lugola

* Związki ułatwiajace barwienie (bejce, zaprawy)
           + bejce proste ---> ułatwiają przenikanie barwników do wnętrza komórek bakterii
           + bejce właściwe ---> wiążą się z barwnikiem i substancjami barwionymi

                                                     CEL BARWIENIA :

1) uwidocznienie kształtu komórki bakteryjnej
2) uwidocznienie układu komórki bakteryjnej
3) uwidocznienie części składowych komórki bakteryjnej
4) rozróżnienie bakterii G+ i G-
5) określenie stopnia czystości hodowli bakteryjnej

Dlaczego większość mikroorganizmów wykazuje powinowactwo do barwników zasadowych ? 

                          budowa i skład chemiczny struktur powierzchniowych komórek  :

* obecność dużej ilości kwasów nukleinowych, które nadają komórkom mikroorganizmów kwaśny 
odczyn
* wiele związków chemicznych występujących w ścianie i błonie komórkowej oraz w cytoplazmie 
mikroorganizmów ma charakter amfoteryczny - w określonym pH (punkt izoelektryczny), mają 
odczyn obojętny
* punkt izoelektryczny dla związków chemicznych w komórkach bakterii przypada w zakresie od 
pH 2 - 3 (Gram-dodatnie) do pH 4 - 5 (Gram-ujemne). Większość mikroorganizmów żyje i są 
barwione w środowisku o pH bliskim obojętnemu lub lekko zasadowym - w wartościach pH 
powyżej ich punktu izoelektrycznego, czyli w roztworze bardziej zasadowym. Następuje wówczas 
dysocjacja grup kwasowych związków amfoterycznych (odłączenie protonu; cząsteczki są 
anionami), co zwiększa ich powinowactwo do barwników zasadowych.

                       BARWIENIE PREPARATÓW PRZYŻYCIOWYCH :

Na szkiełku podstawowym - obok kropli z materiałem badanym (kropla hodowli płynnej lub 

część kolonii z hodowli na podłożu stałym zawieszona w 0,85% NaCl) umieszcza się kroplę 
barwnika, łączy ezą i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. 

* Cel barwienia:
+ barwienie błękitem metylenowym - pozwala ocenić żywotność komórek. Barwnik przenika do 
wnętrza martwej komórki, która barwi się na ciemnoniebiesko. Obliczając procent komórek 
żywych określamy ich żywotność, np. przydatność spożywczą drożdży 
+ barwienie płynem Lugola - umożliwia wykrycie w komórkach drożdży substancji zapasowych – 
glikogenu. Glikogen barwi się na brunatno-czerwono, a cytoplazma komórki na jasno-żółto-zielono
barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków beztlenowych wykryć granulozę - cukier 
stanowiący substancję zapasową tych bakterii.

                                  METODY BARWIENIA PREPERETÓW :

1) proste
        jeden barwnik (uwidacznia kształt i ułożenie komórek bakterii)
2) złożone
        wiele barwników (pozwala na zróznicowanie bakterii na podstawie ich morfologii oraz
odmiennych struktur komórkowych).
3) pozytywne
         zabarwienie komórek bakterii, przy niezabarwionym otoczzeniu (tle) komórki
                        * suprawitalne ---> barwnik zabija bakterie
                        * intrawitalne ---> barwnik nie zabija bakterii
4) negatywne
         na zabarwionym tle uwidaczniane są niezabarwione bakterie (np.: barwienie otoczek,
komórki trudnobarwliwe, delikatne)
5) negatywno-pozytywne 
            

                              PRZYGOTOWANIE PREPARATÓW :

1) wykonanie rozmazu
wykonuje się na środowisku szkiełka podstawowego na 1/2 jego powierzchni. 
Rozmaz z hodowli na podłożu płynnym, wykonuje się poprzez rozprowadzenie jałową ezą
2 - 3 krople hodowli na powierzchni szkiełka podstawowego.
Z hodowli na podłożu stałym , należy fragment kolonii mikroorganizmów rozprowadzić na szkiełku 
podstawowym, w 2 - 3 kroplach 0,85% roztworu NaCl (soli fizjologicznej)
2) utrwalenie preparatu             
metodą fizyczną (ogrzanie nad płomieniem palnika)
                              lub
metodą chemiczna (alkohol : metylowy, etylowy; mieszaniny alkoholu lub eteru w stosunku 1 : 1).

W  wyniku utrwalenia preparatu następuje :
* zabicie komórek
* częściowa denaturacja struktur
*przytwierdzenie komórek do powierzchni szkiełka, co zapobiega ich usunięcie w trakcie barwienia
* bardziej efektowne wnikanie barwnika do wnętrza komórki i jego łączenie się z grupami 
czynnymi struktur wewnątrzkomórkowych

3) zabarwienia komórek wybrana techniką barwienia

                                          BARWIENIE PROSTE :

to technika barwienia w której stosuje się jeden barwnik. 
Stosuje się :
- błękit metylowy
- płyn Lofflera
- fiolet krystaliczny
- fuksynę karbolową