Biochemia
KWASY NUKLEINOWE
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
wykład 4
Biochemia
KWASY NUKLEINOWE
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
wykład 4
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Cząsteczka rybozy i deoksyrybozy pochodzi z przemian glukozy
Cząsteczka rybozy i deoksyrybozy pochodzi z przemian glukozy
Atomy azotu i węgla zasad purynowych i pirymidynowych
Atomy azotu i węgla zasad purynowych i pirymidynowych pochodzą
pochodzą
z aminokwasów
z aminokwasów
INFORMACJA GENETYCZNA
Informacja genetyczna przechowywana
jest w komórkach w postaci
cząsteczek
DNA
, tylko u niektórych
wirusów w postaci RNA (retrowirusy).
Informacja jest zaszyfrowana
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Informacja jest zaszyfrowana
w sekwencji deoksyrybonukleotydów
zawierających zasady A, G, C, T.
Kod jest trójkowy: trzy kolejne
nukleotydy kodują określony
aminokwas.
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
STRUKTURA DNA
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
5
`
-ACGT-3
`
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
53
54
DNA
DNA
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
52
51
Rosalind Franklin
Pracowała w King
,
s College wraz z
Mauricem Wilkinsem.Jej autorstwa
był dokładny rentegenogram
sodowej soli DNA, który legł u
podstaw pracy Jamesa Watsona i
Francisa Cricka (laureaci wraz
Maurice Wilkinsem Nagrody
Nobla).
DNA
DNA
DNA
DNA
DNA
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Nobla).
Mimo iŜ była ona niewątpliwie
współtwórcą odkrycia struktury
DNA, jej nazwisko nie zostało
uwzględnione w werdykcie Komitetu
Noblowskiego, gdyŜ nie Ŝyła juŜ
w momencie przyznania nagrody
Crickowi, Watsonowi i Wilkinsowi.
53
Molecular structure of Nucleic Acids:
A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid –
James Watson, Francis Crick;
Nature, 25 April, 1953
Była to pierwsza publikacja opisująca odkrycie
struktury podwójnej spirali DNA .
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Większość danych, na których się oparli
pochodziła od Maurice`a Wilkinsa
i Rosalind Franklin z King`s College w Londynie
.
PODSTAWOWY DOGMAT GENETYKI
DNA → RNA → Białko
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
RNA
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
RNA
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Synteza białka wymaga przetłumaczenia
Synteza białka wymaga przetłumaczenia
języka kwasów nukleinowych na język białka
języka kwasów nukleinowych na język białka
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
języka kwasów nukleinowych na język białka
języka kwasów nukleinowych na język białka
INFORMACJA GENETYCZNA
Informacja genetyczna przechowywana
jest w komórkach w postaci
cząsteczek
DNA
, tylko u niektórych
wirusów w postaci RNA (retrowirusy).
Informacja jest zaszyfrowana
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Informacja jest zaszyfrowana
w sekwencji deoksyrybonukleotydów
zawierających zasady A, G, C, T.
Kod jest trójkowy: trzy kolejne
nukleotydy kodują określony
aminokwas.
Kod genetyczny
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Translacja
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Translacja
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
MUTACJE
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
HbA
DNA
GTG CAC CTG ACT CCT
GAG
GAG AAG
mRNA
GUG CAC CUG ACU CCU
GAG
GAG AAG
białko
Val
His
Leu Thr
Pro
Glu
Glu
Lys
Analiza genu HbA i HbS
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
HbS
DNA
GTG CAC CTG ACT CCT
GTG
GAG AAG
mRNA GUG CAC CUG ACU CCU
GUG
GAG AAG
białko
Val
His
Leu Thr
Pro
Val
Glu
Lys
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Wpływ delecji w genie na sekwencję nukleotydów
w transkrypcie mRNA i na sekwencje
aminokwasów w białku
Stan normalny
UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU UAG
Met-Ala- Ser- Cys- Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser –STOP
Delecja (-1)
(-1 U)
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Delecja (-1)
(-1 U)
↓
↓
↓
↓
UAG UUUG AUG GCC CUU GCA AAG GCU AUA GUA GUU AG..
Met-Ala-Leu- Ala- Lys – Ala –Thr – Val –Val -Ser
Delecja (-3)
(-3 UGC)
↓
↓
↓
↓
UAG UUUG AUG GCC UCU AAA GGC UAU AGU AGU UAG
Met-Ala- Ser-Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser –STOP
Wpływ insercji w genie na sekwencję
nukleotydów w transkrypcie mRNA i na
sekwencje aminokwasów w białku
Stan normalny
UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU
UAG
Met-Ala- Ser- Cys- Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser
STOP
Insercja (+1)
(+1 C)
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Insercja (+1)
(+1 C)
↓
↓
↓
↓
UAG UUUG AUG GCC CUC UUG CAA AGG CUA
UAG
UAG UUAG
Met-Ala- Leu- Leu -GLn Arg – Leu
STOP
Wpływ delecji i insercji w genie na sekwencję
nukleotydów w transkrypcie mRNA i na
sekwencje aminokwasów w białku
Stan normalny
UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU
UAG
Met-Ala- Ser- Cys- Lys –Gly –Tyr -Ser-Ser
STOP
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Insercja (+1)
Delecja (-1)
(+1 U) (-1 C)
↓
↓
↓
↓
↓
↓
↓
↓
UAG UUUG AUG GCC UCU UUG CAA AGG UAU AGU AGU
UAG
Met-Ala- Ser- Leu- Gln –Arg –Tyr -Ser- Ser
STOP
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Mukowiscydoza naleŜy do najczęstszych chorób dziedzicznych
Mukowiscydoza naleŜy do najczęstszych chorób dziedzicznych
występujących u rasy białej. Co 25 Europejczyk jest nosicielem
występujących u rasy białej. Co 25 Europejczyk jest nosicielem
patologicznego genu. Kodowane przez ten gen białko pełni rolę w
patologicznego genu. Kodowane przez ten gen białko pełni rolę w
regulacji funkcji kanału chlorkowego w drogach oddechowych.
regulacji funkcji kanału chlorkowego w drogach oddechowych.
Przyczyną ponad 90% przypadków upośledzenia funkcji Ŝyciowych
Przyczyną ponad 90% przypadków upośledzenia funkcji Ŝyciowych
i śmierci chorych są zmiany oskrzelowo płucne.
i śmierci chorych są zmiany oskrzelowo płucne.
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
sekwencja nukleotydów w DNA
prawidłowa
prawidłowa
prawidłowa
prawidłowa
prawidłowa
prawidłowa
prawidłowa
prawidłowa
5
5
5
5
5
5
5
5
````````
--------
ATC ATC TTT GGT
ATC ATC TTT GGT
ATC ATC TTT GGT
ATC ATC TTT GGT
---- 3
3
3
3
````
nieprawidłowa
nieprawidłowa
nieprawidłowa
nieprawidłowa
5
5
5
5
5
5
5
5
````````
--------
ATC ATT GGT GTT
ATC ATT GGT GTT
ATC ATT GGT GTT
ATC ATT GGT GTT
---- 3
3
3
3
````
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Rasa biała
1:2500
Rasa Ŝółta
1:90 000
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Rasa czarna
1:17 000
Wydzielanie bardzo słonego potu jest wczesnym
objawem chorobowym, a pomiar stęŜenia chlorków w wydalanym
pocie jest jednym z kryteriów diagnostycznych choroby
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
TECHNIKI BIOLOGII
TECHNIKI BIOLOGII
MOLEKULARNEJ
MOLEKULARNEJ
RFLP
RFLP -
- POLIMORFIZM DŁUGOŚCI
POLIMORFIZM DŁUGOŚCI
FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNYCH
FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNYCH
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
PCR
PCR -
- POLIMERAZOWA REAKCJA
POLIMERAZOWA REAKCJA
ŁAŃCUCHOWA
ŁAŃCUCHOWA
POLIMORFIZM DŁUGOŚCI FRAGMENTÓW
RESTRYKCYJNYCH RFLP
(
Restriction fragment length polymorphism)
•
Jest wynikiem punktowych mutacji, występujących
w obrębie genu.
•
Mutacje mogą powodować albo powstawanie nowych
albo utratę istniejących miejsc rozpoznawanych przez
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
albo utratę istniejących miejsc rozpoznawanych przez
enzymy restrykcyjne.
•
Enzymy restrykcyjne tną DNA na fragmenty
o zróŜnicowanej długości.
•
Rozdział elektroforetyczny tych fragmentów pozwala
na wykrywanie róŜnic występujących pomiędzy
róŜnymi cząsteczkami DNA.
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Madam I
Madam I
`
`
am Adam
am Adam
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Analiza długości fragmentów restrykcyjnych
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
POLIMORFIZM DŁUGOŚCI FRAGMENTÓW
RESTRYKCYJNYCH (RFLP)
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
DIAGNOSTYKA GENETYCZNA
FENYLOKETONURII
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
1
2
3
4
5
30 kpz
20 kpz
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
1.
ojciec chorej
2. matka chorej
3. chora na
fenyloketonurię.
4. brat chorej;
5. siostra chorej.
W badanej rodzinie występuje
polimorfizm fragmentów restrykcyjnych
DNA (o wielkości 30 kpz i 20 kpz),
obejmujący odcinek kodujący
hydroksylazę fenyloalaninową (HPA),
wywołany zmianą miejsca
rozpoznawanego przez enzym
restrykcyjny [dziedziczenie
autosomalne recesywne (HPA)]
1
2
3
4
5
30 kpz
20 kpz
Chora odziedziczyła od ojca i matki zmutowany allel 20
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Chora odziedziczyła od ojca i matki zmutowany allel 20
kpz, ale brak jej prąŜka 30 kpz warunkującego
występowanie prawidłowego genu HPA;
jej brat odziedziczył allel zmutowany 20 kpz i allel
prawidłowy 30 kpz, jest więc heterozygotą
(nosicielem);
siostra chorej odziedziczyła dwa prawidłowe allele
.
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Praktyczne wykorzystanie wła
ś
ciwo
ś
ci
Praktyczne wykorzystanie wła
ś
ciwo
ś
ci
fizyko
fizyko--chemicznych białek
chemicznych białek -- PODSUMOWANIE
PODSUMOWANIE
∙
Cz
ą
steczki obdarzone ładunkiem maj
ą
zdolno
ść
poruszania si
ę
w polu elektrycznym: aniony w
ę
druj
ą
do anody, kationy do
katody. Zjawisko to nazywamy elektroforez
ą
.
∙
Mutacje mog
ą
prowadzi
ć
do zmiany składu aminokwasowego
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
∙
Mutacje mog
ą
prowadzi
ć
do zmiany składu aminokwasowego
białek. To powoduje,
Ŝ
e białko zmutowane mo
Ŝ
e mie
ć
inny
ładunek ni
Ŝ
białko natywne. Oba białka (natywne i zmutowane)
b
ę
d
ą
si
ę
wi
ę
c ró
Ŝ
ni
ć
szybko
ś
ci
ą
(a czasem i kierunkiem)
w
ę
drówki w polu elektrycznym.
∙
Elektroforez
ę
białek mo
Ŝ
na wi
ę
c wykorzystywa
ć
do celów
diagnostyki klinicznej (np.HbA i HbS)
POLIMERAZOWA REAKCJA ŁAŃCUCHOWA
- PCR (
Polymerase Chain Reaction
)
„molekularna kserokopiarka”
•
metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach
laboratoryjnych;
•
do reakcji wprowadza się: matrycowy DNA, który
chcemy powielić (amplifikacja), trifosforany
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
chcemy powielić (amplifikacja), trifosforany
deoksyrybonukleotydów: dATP, dGTP, dCTP, dTTP,
startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20
nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do
fragmentów matrycy, termostabilną polimerazę
DNA;
•
Cykl: denaturacja, przyłączenie starterów, elongacja
•
Cykl się powtarza, przyrost DNA w postępie
geometrycznym; po n cyklach otrzymujemy 2
n
cząsteczek.
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
PCR
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Analiza genu dystrofiny, największy opisany gen
(75 eksonów i 74 introny). Defekt tego białka
prowadzi do dystrofii mięśni. 1:3500; płeć męska.
Defekt jest spowodowany delecją egzonów genu.
Zasada wykrywania delecji egzonów w genie
dystrofiny metodą PCR.Amplifikacja kilku do kilkunastu
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
dystrofiny metodą PCR.Amplifikacja kilku do kilkunastu
wybranych egzonów z regionów genu,w których
najczęściej występuje mutacja. JeŜeli brak egzonu, to
nie nastąpi jego powielenie i nie pojawi się ten
fragment w obrazie elektroforetycznym
1:3500
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Jest to letalna postać zaników mięśniowych. Objawy
choroby są zauwaŜalne dopiero w wieku 3-5 lat. Zmiany
dotyczą równieŜ mięśnia sercowego. Do niedawna chorzy
umierali w wieku około 10 lat. Obecnie dzięki postępom
medycyny doŜywają do 20-30 lat
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ
Zdrowy
Badany -
chory
Zdrowy
Badany -
zdrowy
Anna Bilsk
Anna Bilsk
a
a
CM UJ
CM UJ