09 Replikacja DNA i powstawanie mutacji

REPLIKACJA DNA I POWSTAWANIE MUTACJI

1) Replikacja DNA

2) Telomery

3) Cykl komórkowy

4) Mutacje jako skutek braku naprawy replikowanego DNA

5) Rodzaje mutacji

6) Mutacje a funkcje białek

7) Naprawa DNA – wybrane mechanizmy

8) Mutacje jako zmiany duŜych odcinków DNA

9) Mutacje liczby chromosomów

1) Replikacja DNA – konieczność odsłonięcia jednoniciowego DNA

Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłonięcie ‘lepkich’ pojedynczych nici, które

maja tendencję do ponownego łączenia się. Zapobiegają temu białka SSBs (single strand
binding).

1) Replikacja DNA – inna przeszkodą jest skręcenie helisy

Nić helisy jest skręcona i to skręcenie się nasila w miarę przesuwania się kompleksu

replikacyjnego. Rozwiązaniem jest działanie topoizomerazy, która nacina jedną z nici,
przepuszcza drugą przez powstałą przerwę i doprowadza do powtórnego złączenia.

1) Replikacja – jeszcze inny problem, przeciwbieŜność nici DNA

- Kopiowanie musi przebiegać w jednym kierunku podwójnej nici DNA (od 5’ do 3’ nowej

nici), ale dwie nici składowe są przeciwbieŜne

1) Replikacja DNA

– rozwiązaniem jest „normalna”

replikacja w przypadku nici
“wiodącej” i odcinkowa replikacja
(fragmenty Okazaki) “spóźniającej
się” nici DNA

1) Replikacja DNA
- helikaza – rozdziela starą podwójną nić DNA umoŜliwiając przyłączenie się polimerazy DNA do

nici pojedynczych

- polimeraza DNA – odpowiedzialna jest za dokładanie komplementarnych zasad do starych nici

DNA, czyli powstawanie nowych

- topoizomeraza – likwiduje napręŜenia powstające w rozplątywanej podwójnej nici DNA poprzez

nacinanie pojedynczych nici, co pozwala na ich przeplecenie się, a następnie połączenie

- primaza RNA – tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA na spóźniającej się nici DNA, które

słuŜą za startery (ang. primers) do syntetyzowania fragmentów Okazaki

- ligaza DNA – łączy fragmenty Okazaki w ciągłą nową nić

1) Replikacja DNA - inicjacja

- chromosomy bakterii (a takŜe plazmidy i koliste genomy wirusów) mają jeden początek replikacji:

odwijanie nici zachodzi w obu kierunkach co prowadzi do tworzenia się charakterystycznej
„struktury teta” (θ)

- u organizmów eukariotycznych występuje wiele początków replikacji w kaŜdym z chromosomów

bakterie

eukarionty

1) Replikacja DNA - kohezyny
By zapobiec splątywaniu się dwóch siostrzanych nici (chromatyd)u eukariontów, są one

natychmiast po replikacji łączone równolegle przez białka kohezyny. Kohezyny są rozszczepiane
dopiero przy rozchodzeniu się chromatyd w anafazie.

1) Replikacja DNA – terminacja
Koniec replikacji kolistego DNA to dwa identyczne koła. Problem pojawia się przy zakończeniu

replikacji liniowych chromosomów eukariontów. Na ostatnim fragmencie nici opóźniającej się
(lagging) nie moŜna utworzyć starteru RNA i dlatego ta nić jest krótsza po replikacji.

2) Telomery

Końce chromosomów to telomery. Są to

odcinki gdzie w kilkuset kopiach występuje
sekwencja 5’-TTAGGG-3’. Okazuje się, Ŝe
jest to wynik działania telomerazy, enzymu
mającego za zadanie wydłuŜanie końca
chromosmu. Jest to białko o aktywności
odwrotnej transkryptazy do którego
doczepiona jest cząsteczka RNA (z sekwencją
5’-CUAACCCUAAC-3’) słuŜąca za
przesuwającą się matrycę.

2) Telomery a starzenie się komórek

Telomeraza jest aktywna w komórkach

lini generatywnej i komórkach
progenitorowych (stem cells). W tkankach
normalnie nie działa. Telomery się
skracają i to jest ich ‘zegarem’ starzenia
się. Po odliczonej liczbie podziałów, np.
kilkudziesięciu, komórka nie moŜe się
dalej dzielić. W hodowli komórek to
sytuacja niepoŜądana. Dlatego nieraz
aktywuje się telomerazę sztucznie.
Spontaniczne wznowienie aktywności
telomerazy obserwuje się w komórkach
rakowych.

3) Cykl komórkowy

Komórka musi zgrać podział DNA z podziałem komórki. Cykl komórkowy składa się z faz: M

(mitoza, podział komórki), G1 (gap 1, normalny metabolizm), S (synthesis, replikacja DNA), G2
(gap 2, okres oczekiwania na podzial komórki). Za punkty kontrolne cyklu uwaŜa się moment
wejścia w fazę S i w fazę M. Przejście w te fazy jest rządzone przez skomplikowane procesy, ale
jednymi z elemetów kontroli są białka cykliny, których ilości zmieniają się w trakcie cyklu. Dla
przykładu, cykliny mitozy są szczególnie obfite w tej fazie. Aktywują one mitozę, ale i
powstrzymują replikację (fazę S). Gdy je zablokowano, uniemoŜliwiono wejście w fazę M i
spowodowano nadreplikację DNA.

4) Mutacje jako skutek braku

naprawy replikowanego DNA

Mutacje powstają gdy do DNA

wstawiony zostanie
niekomplementarny nukleotyd (górny
rysunek). Jeśli niekomplementarny
nukleotyd zostanie odowiednio szybko
wymieniony (naprawa DNA, repair) to
mutacji jako dziedzicznej zmiany nie
będzie (dolny rysunek).

Mutacje punktowe (substytucje)

dzielimy na tranzycje (puryna do
puryny, pirimidyna do pirymidyny;
A→G, G →A, T →C, C →T) i
transwersje (puryny w pirymidyny i na
odwrót; A→C, A →T, G →C, G →T
C→A, C →G, T →A, T →G).

Inne typowe mutacje powstające przy

replikacji to delecje lub insercje
jednego lub kilku nukleotydów.

4) Mutacje jako skutek braku

naprawy replikowanego DNA

Błąd w replikacji powoduje powstanie

niedopasowania nukleotydu
(mismatch), jeśli się on utrwali, powiela
się dalej jako zmieniona ale
komplementarna para nukleotydów.

4) Mutacje jako skutek braku

naprawy replikowanego DNA

Polimeraza DNA działa tak by nie

popelniać błędów. Selekcja
nukleotydów jest imponująco dokładna,
pomyłki wystepuja raz na 10,000
sparowań.

4) Mutacje jako skutek braku

naprawy replikowanego DNA

Jeśli polimeraza DNA się pomyli, to

potrafi sama naprawić swój błąd
poniewaŜ oprócz aktywności
polimerazy ma teŜ aktywność
egzonukleazy. Gdy wstawi się
poprawny nukleotyd, aktywność
polimerazy wygrywa i kompleks
posuwa się dalej. Gdy powstaje para
niekomplementarna, następuje
powstrzymanie polimeryzacji, co
pozwala zadziałać egzonukleazie i
wyciąć nieodpowiedni nukleotyd. Ta
forma naprawy nazywana jest naprawą
korekcyjną (proofreading). Pomyłki
następują tu zaledwie około raz na
1000.

5) Rodzaje mutacji – zmiany

tautomeryczne

Nie zawsze gdy powstaje substytucja

jest ona skutkiem pomyłki polimerazy
DNA. Niekiedy prawidłowy nukleotyd
przybiera ‘nieprawidłową formę’ (np.
bardziej stabilna forma ketonowa
przechodzi chwilowo w mniej stabilną
formę enolową). Gdy stanie się to w
momencie syntezy, forma enol
przywoła nieprawidłową zasadę
komplementarną. Później powróci
jednak do formy keto i powstanie
niedopasowanie. Powodem niektórych
mutacji jest więc nieuchronne
przeskakiwanie między alternatywnymi
tautomerami zasad azotowych.

5) Rodzaje mutacji – poślizg replikacyjny

Gdy w DNA mamy ciągi powtórzeń, takich jak dwójki CA, polimeraza DNA dość często ślizga

się i dodaje kolejna parę CA. Jest to poślig replikacyjny Wynikiem jest mutacja zmiany fazy
odczytu (frameshift). Zmiana fazy powstaje przy wszelkich insercjach/delecjach nie-trójkowych.
Jest często bardzo szkodliwa, bo po punkcie mutacji pojawiają się nieprawidłowe kodony i
zmienia się pozycja kodonu STOP.

5) Rodzaje mutacji – poślizg replikacyjny
Najprawdopodobniej poślizg replikacyjny jest odpowiedzialny za ekspansję powtórzeń

trójkowych. Nie ma wtedy zmiany fazy odczytu ale powstają białka, które mają zaburzoną
strukturę trzeciorzędową i nieprawidłowo zachowują się w komórce (np. koagulują). Są znane jako
przyczyny wielu chorób genetycznych.

5) Rodzaje mutacji –

mutacje indukowane
chemicznie

Częstym sposobem

wywoływania mutacji jest
uŜycie analogów
nukleotydów. Na przykład,
bromouracyl jest podobny do
tyminy, moŜe być wstawiony
na jej miejsce i w formie keto
sparowałby się z adeniną.
Jednak, znacznie częściej niŜ
tymina przechodzi w formę
enol i wtedy paruje się z
guaniną. Powstaje mutacja, bo
wykorzystano zjawisko
tautomerii. (Tego typu
mutacje są losowo
umieszczane w ciągu DNA, to
znaczy, badacz nie potrafi
przewidzieć ich pozycji.)

5) Rodzaje mutacji –

mutacje wywołane
promieniami UV

wiatło długości 260 nm

powoduje powstanie
podwójnego lub
pojedynczego wiązania
kowalencyjnego pomiędzy
sąsiadującymi (w tej samej
nici) pirymidynami
(najczęściej tyminami),
powstaje dimer tyminowy.

6) Mutacje a funkcje białek

Mutacje mogą prowadzić do

utraty funkcji genu, jej
osłabienia, lub zmiany funkcji
na inną

całkowita utrata
funkcji – null mutation

częściowa utrata funkcji
– leaky mutation

zmiana (nabycie) funkcji
– gain of mutation

6) Mutacje a funkcje białek
Mutacje bywają najbardziej szkodliwe gdy „trafią” w miejsca kodujące centra aktywne enzymów
lub promotor, mniej gdy w mniej waŜny obszar egzonów, najmniej gdy w introny, chyba, Ŝe
uniemoŜliwiają wycinanie tych ostatnich

promotor

intron

typ dziki

null – brak funkcji

neutral – funkcja zostaje

null – brak funkcji

leaky – osłabienie

miejsce
aktywne

mutacja

egzon

7) Naprawa DNA – naprawa bezpośrednia

Naprawa bezpośrednia to np. naprawa pęknięcia (nick) nici DNA przez ligazę (rycina), lub

naprawa struktury nukleotydu, taka jak odcięcie grupy alkilowej, która niekiedy zostaje błędnie
doczepiona do nukleotydu.

7) Naprawa DNA – naprawa z wycinaniem zasady (base excision)

Uszkodzona zasada jest odnajdywana przez glikozylazę DNA i odcinana od cukru. Następnie

cały nukleotyd, ale tylko ten jeden, jest usuwany a potem zapełniany prawidłowym.

7) Naprawa DNA – naprawa z wycinaniem nukleotydów (nucleotide excision)

Gdy uszkodzenie powoduje lokalne zaburzenie struktury helisy, najpierw następuje rozdzielenie

nici (melting) prawdopodobnie przez helikazę. Potem nić zawierająca uszkodzenie jest wycinana
(u eukariontów 24-29 nukleotydów), polimeraza dobudowuje drugą nić, a ligaza włącza ją do
starej nici kowalencyjnie.

7) Naprawa DNA – naprawa poreplikacyjna niedopasowań nukleotydów (mismatch repair)

U bakterii nić rodzicielska jest zmetylowana, a nic potomna przez pewien czas nie. To pozwala

na ich rozróŜnienie i wycinanie tylko nowej nici przy natknięciu się na niedopasowanie.

7) Naprawa DNA – naprawa poreplikacyjna niedopasowań nukleotydów (mismatch repair)

U bakterii białko MutS stale

skanuje nić i rozpoznaje
niedopasowania. Przywołuje
MutH, która przyłacza się do
nici niezmetylowanej (nowej).
Ta z kolei przywołuje helikazę i
endonukleazę by usunąć odcinek
nowej nici z niedopasowaniem.
Potem polimeraza i ligaza
kończą naprawę.

U eukariontów jest podobny

system, ale brakuje MutH i
metylowania jako znacznika
starej nici. Kompleks naprawy
niedopasowań jest
prawdopodobnie związany z
kompleksem replikacyjnym i w
ten sposób jest zapewnione
rozróŜnianie nici starej i nowej.

7) Naprawa DNA – łączenie końców nie-homologicznych (czyli dowolnych)

Gdy podwójna nić pęknie w

czasie mitozy, część
chromosomu bez centromeru
zostanie utracona. Istnieją
jednak systemy szybkiego
łączenia wolnych końców. U
eukariontów pośredniczy w tym
białko Ku i szereg innych białek.
W ten sposób złączeniu ulec
mogą końce, które niedawno się
przełamały jak i zupełnie nie
niehomologiczne łańcuchy
DNA.

7) Naprawa DNA – bakteryjny system SOS

Gdy w czasie replikacji ‘normalna’

polimeraza DNA III natrafi na zbyt
uszkodzone DNA nie moŜe posuwać
się dalej. Wtedy włączany jest system
SOS, które ma uchronić komórkę
bakterii przed załamaniem się
replikacji jej chromosomu.
Przywoływane są między innymi
białka RecA, które pozwalają na
odłączenie polimerazy III i
umoŜliwiają pracę polimerazie V. Ta
ostatnia potrafi syntetyzować na
matrycy DNA z uszkodzeniami, choć
skutkuje to wieloma błędami w nowej
nici. Potem RecA i polimeraza V są
zastępowane przez normalną
polimerazę III.

U eukariontów takŜe istnieją takie

‘ratunkowe’ polimerazy pomostowe
(bypass), zdolne do przejścia przez
określone uszkodzenia DNA.