BiolMol8

Zasady, które stosują się do wszystkich lub niemal wszystkich

replikacji DNA:

* 2-niciowe DNA replikuje w sposób semikonserwatywny

(gdy nici rodzicielskie rozdzielają się, każda służy jako

matryca do utworzenia nowej komplementarnej nici)

* replikacja 2-niciowego DNA jest połowicznie nieciągła

(jedna nić – wiodąca - jest replikowana w sposób ciągły w

kierunku posuwania się widełek replikacyjnych,

druga – opóźniona - replikuje w sposób nieciągły w postaci 1-2

kpz fragmentów Okazaki tworzonych w kierunku przeciwnym

do ruchu widełek replikacyjnych; dzięki temu obie nici są

replikowane w kierunku 5’→3’)

* inicjacja replikacji DNA wymaga primera (pojedynczego na

nici wiodącej, osobnego dla każdego fragmentu Okazaki nici

opóźnionej; u

E.coli

primerami są 10-12 nt RNA)

* większość pro- i eukariotycznych DNA replikuje

dwukierunkowo, plazmid colE1 replikuje jednokierunkowo.

koliste DNA może replikować zgodnie z mechanizmem

toczącego się kółka – jedna nić 2-niciowego DNA jest
nacinana i koniec 3’ ulega wydłużaniu na matrycy nici
nienaruszonej, co oddziela od niej koniec 5’

• w replikacji φX174 – odseparowany od nici ciągłej koniec 5’

jest wiązany przez fagowe białko gpA, które wypętla go z
widełek replikacyjnych, po zakończeniu pełnej rundy replika-
cyjnej uwalniane jest pełnej długości 1-niciowe koliste DNA,

• u faga λ odseparowana nić służy jako matryca do nieciągłej

syntezy nici opóźnionej

3’

5’

3’

5’

* M13

używa

pol RNA gospodarza

jako

prymazy

* G4

używa

bakteryjnej

prymazy DnaG

* φX174

używa prymosomu złożonego z

DnaG

oraz

bakteryjnych białek

PriA, PriB, PriC

DnaB, DnaC i DnaT

– prymosom jest mobilny i może syntetyzować primery w
kilku miejscach kolistej 1-niciowej cząsteczki DNA

strategie inicjacji replikacji DNA kolifagów o 1-niciowym DNA:

prymosom

E.coli

tworzy się w miejscu startu replikacji

oriC

białko

DnaA

(zastępuje kompleks [PriA, PriB, PriC, DnaT] inicjujący

tworzenie prymosomu φX174) wiąże się do

oriC

w miejscach zw.

kasetami dnaA

i kooperuje z pol RNA i białkiem HU w rozpleceniu

bogatego w AT regionu

DNA przyległego do najbardziej na lewo

położonej

kasety dnaA

do tak utworzonych widełek replikacyjnych dołączają się

SSB

i helikaza

DnaB

związana z

DnaC

i ułatwiają przyłączenie

prymazy DnaG

kompletuje prymosom

prymosom pozostaje w replisomie i w powtarzalny sposób inicjuje syntezę

fragmentów Okazaki na nici opóźnionej

• z 3 pol DNA

E.coli

tylko

pol III

jest niezbędna do replikacji

DNA

• holoenzym pol III

zawiera

10 podjednostek

• rdzeń

pol III DNA składa się z podjednostek:

– o aktywności polimerazy

– o aktywności korygującej egzonukleazy 3’→5’

- ?

[pol I jest pojedynczym polipeptydem o aktywności polimerazy

i egzonukleazy 5’→3’ (obie w dużej domenie - fragmencie

Klenowa) oraz egzonukleazy 3’→5’ (w małej oddzielnej

domenie)]

• sam rdzeń pol III DNA może replikować jedynie

krótkie ciągi DNA i odpada od matrycy;

rdzeń +

podjedn. β

syntetyzują w sposób ciągły

(500 pz/s)

podjednostkę β

tworzy dimer w kształcie pierścienia opasującego DNA

i oddziałującego z

podjedn. α

rdzenia sprzęgając razem całą polimerazę

i matrycę; [eukariotyczny czynnik PCNA tworzy trimer o podobnym
pierścieniowatym kształcie]

holoenzym jest „dwugłowy”
z dwoma rdzeniami przyłączonymi
poprzez

dimer podjedn. τ

kompleksu γ

jeden rdzeń odpowiada za ciągłą
syntezę nici wiodącej, drugi za
nieciągłą nici opóźnionej

kompleks γ

ładuje

klamrę β

matrycę z primerem

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0
http://www.youtube.com/watch?v=4jtmOZaIvS0&NR=1

podjedn. β

tworzy dimer w kształcie pierścienia opasującego

DNA i oddziałującego z

podjedn. α

rdzenia sprzęgając

razem całą polimerazę i matrycę; [eukariotyczny czynnik
PCNA tworzy trimer o podobnym pierścieniowatym
kształcie]

holoenzym jest „dwugłowy”
z dwoma rdzeniami przyłączonymi
poprzez

dimer podjedn. τ

kompleksu γ

;

jeden rdzeń odpowiada za ciągłą
syntezę nici wiodącej, drugi za
nieciągłą nici opóźnionej;

kompleks γ

ładuje

klamrę β

matrycę z primerem;

podjedn. β

(

clamp

) by objąć DNA klamrą wymaga pomocy

kompleksu γ

(

clamp loader:

γ, δ, δ’, χ, ψ)

kompleks γ

działa katalitycznie tworząc postępujący kompleks

rdzeń+

ale nie pozostaje z nim związany podczas replikacji

ładowanie

na DNA wymaga ATP

raz załadowana na DNA

klamra β

traci powinowactwo do

kompleksu

i asocjuje z

rdzeniem

pomagając mu w postępującej syntezie

fragmentu Okazaki

gdy fragment Okazaki jest ukończony,

klamra β

traci

powinowactwo do rdzenia i asocjuje z

kompleksem γ

, który ją

„odpina” od DNA

proces powtarza się na następnym primerze

http://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0&NR=1

w ssaczych komórkach istnieje 5 różnych polimeraz:

- uczestniczą w

replikacji DNA

rozpoczyna, a

wydłuża syntezę każdej z nici

- biorą udział w

naprawie DNA

- prawdopodobnie replikuje

mitochondrialne DNA

replikacja jądrowego eukariotycznego DNA (50 pz/s)

rozpoczyna się z wielu miejsc startu replikacji
jednocześnie - istnieją dwa mechanizmy, pozytywny
i negatywny, kontrolujące, które z nich już zostały
zreplikowane, a które oczekują na replikację

mechanizm pozytywny – licencjonowanie

* do każdego m-sca startu replikacji jest stale przyłączony

funkcjonalny analog DnaA –

kompleks białek ORC

(

rigin

ecognition

omplex of proteins)

* w fazie G

w jądrze kumulują się białka

Cdc-6

Cdt-1

zw.

czynnikami licencyjnymi

, które

wiążą się do

ORC

i są

istotne dla opłaszczenia DNA

białkami MCM2-7

o aktyw-

ności helikazy

* tylko DNA pokryte

białkami MCM

może zostać zreplikowane

* gdy replikacja się rozpoczyna

Cdc-6

Cdt-1

opuszczają

ORC

(

Cdt-1

ulega ubikwitynacji i rozpadowi w proteosomie),

zaś

białka MCM

rozpraszają się tuż przed postępującymi

widełkami replikacyjnymi

mechanizm negatywny –

jądra G

zawierają przynajmniej

jedno białko zw.

gemininą

, które uniemożliwia

(prawdopodobnie przez blokowanie działania

Cdt-1

)

wiązanie się

białek MCM

do świeżo zreplikowanego DNA –

- gdy komórka kończy proces mitozy

geminina

jest

degradowana i obie komórki potomne są zdolne do reakcji
na

czynniki licencyjne

i do replikacji swojego DNA w

następnej fazie S

Montanari i in. 2006 Cell Death and Differentiation 13, 1052–1056

rola

chromatyny

w replikacji DNA - czas replikacji danego ori koreluje

z typem jego chromatyny i jest regulowany przez

deacetylazę

histonów HDAC2

oraz

kompleks remodelujący chromatynę WICH

specyficznie zlokalizowany na późno replikujących ori

replikacja jest mechanizmem ustanowienia i utrzymywania struktury

chromatyny – iniekcja egzogennego DNA do komórek we wczesnej

fazie S powoduje ustanowienie na nim transkrypcyjnie aktywnej,

hiperacetylowanej chromatyny, iniekcja DNA do komórek w późnej

fazie S ustanawia na nim transkrypcyjnie nieaktywną, hypoacetylowaną

chromatynę i raz ustanowiony profil replikacji jest zachowywany

poprzez podziały komórkowe

kompleks WICH (

WSTF

ISWI

chromatin remodelling

complex) oddziałuje z

PCNA

terminacja

replikacji kolistego DNA

terA i terB:
terminatory
replikacji

na koniec replikacji koliste DNA bakteryjne tworzy katenany, które są

odplątywane w 2 etapach - 1

denaturacja pozostałych niedoreplikowanych 2-

helisowych skrętów sprzęgających obie nici, 2

wypełnienie luk przez system

naprawczy; pozostawia to prawoskrętny równoległy pierścieniowaty katenan z
parzysta liczbą węzłów, które są rozwiązywane przez topoizomerazę IV

Schemat kompleksów telomerowch, telomerazy i białek uczestniczących w

komórkowym sygnałowaniu z telomerów (naprawie telomerów). Telomeraza

składa się z matrycowego RNA hTR i katalitycznego białka hTERT. Wydaje się,

że w regulacji

in vivo

aktywności hTR–hTERT i utrzymaniu struktury telomerów

biorą udział dodatkowe elementy. Np. białka TRF1, TRF2, tankyrase, TIN2, RAP1

(niepokazane) i POT1 oddziałują z telomerami i mogą regulować otwieranie i

zamykanie wolnych końców telomerów i ich dostępność dla innych kompleksów

białkowych jak telomeraza. Szereg białek i RNP, w tym HSP90, DKC1, L22, P23 i

GAR1 (niepokazane), może uczestniczyć w składaniu telomerazy i ułatwiać jej

interakcje z telomerami. Inne białka, jak MRE11A, NBS1, KU70, KU80, DNAPK

(niepokazane) i ATM mogą funkcjonować w szlaku wykrywania krótkich

telomerów i wyzwalać szlaki odpowiedzi na uszkodzenia DNA lub naprawę

sekwencji telomerowych.

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009
"for the discovery of how chromosomes are protected by
telomeres and the enzyme telomerase"

b. 1952
(in London, United Kingdom)

b. 1961
(in San Diego, CA USA)

b. 1948
(in Hobart, Tasmania, Australia)

Harvard Medical School;
Massachusetts General Hospital
Boston, MA, USA;
Howard Hughes Medical Institute

Johns Hopkins University
School of Medicine
Baltimore, MD, USA

University of California
San Francisco, CA, USA

USA

1/3 of the prize

Jack W. Szostak

Carol W. Greider

Elizabeth H. Blackburn

Illustration of the vertebrate telomerase ribonucleoprotein complexed with its substrate, telomeric DNA (blue).

Telomerase consists of a reverse transcriptase (TERT, in yellow and pink), and RNA component (TR, in green), and the

dyskerin protein complex. The TERT protein contains the N-terminal domain (TEN), RNA-interacting domains 1 and 2

(RID1 and RID2), and the reverse transcriptase domain (RT). The RNA component contains base-pairing region P1b

that defines the template boundary, the template that encodes the telomeric sequences, the pseudoknot, conserved

regions 4 and 5 (CR4-CR5) that include P6 and P6.1, and the 3’-box H/ACA stem-loop bound by the H/ACA

ribonucleoprotein complex (dyskerin, Nop10, NHP2, and Gar1). RID1 is bound to pseudoknot-template region and RID2

to CR4-CR5. There six proteins that associate with telomeres to form the shelterin complex (TRF1, TRF2, POT1,

directly bound telomeric DNA and TIN2, TPP1, and Rap1 associated with the telomeric DNA binding proteins). TRF1

and TRF2 are bound to double-stranded telomeric DNA, while POT1 is bound to the single-stranded region.
http://telomerase.asu.edu/

Numerous mutations within TR, the 451 nt

RNA component of the telomerase RNP,
have been connected with human
diseases.

Three domains characterize TR,

pseudoknot that includes the template,
conserved regions 4 and 5 (CR4-CR5),
and ScaRNA domain for nuclear
recruitment.

The primary nucleotide sequence is in

black,

point mutations are colored red,

while

deletion mutations are shaded blue

and both are labeled.

http://telomerase.asu.edu/diseases.html

Numerous mutations causing amino acid substitution, additions, deletions, and frame shifts within

TERT, the essential protein component of the telomerase, have been connected with human

diseases.

TERT is composed of three domains, N-terminal extension (NTE) that contains RNA-interaction

domains 1 and 2 (RID1 and RID2), reverse transcription domain (RT) where nucleotide transfer

occurs, and a C-terminal extension (CTE) for processivity and localization.

The black line represents the mRNA sequence of 4015 nt with the untranslated regions (UTR)

labeled and the grey box corresponds to the protein sequence. The individual motifs are labeled

and

NTE is denoted by green

CTE by orange

, and the

central RT domain by blue

boxes.

The mutated residues are colored red

and the change in amino acids is labeled.

gene sequence 41881 bp
TERT protein sequence 1132 AA

Human diseases can be also caused by mutations in genes coding for telomerase-associated

proteins: DKC1 (dyskerin), Nola3 (Nop10), Nola2 (NHP2), TINF2 (TIN2 – one of the six proteins

of shelterin complex).

http://telomerase.asu.edu/diseases.html