ćwiczenie 5
ODZYSKIWANIE FRAGMENTÓW DNA Z ŻELI ELEKTROFORETYCZNYCH
W pracach genetyki molekularnej często zachodzi konieczność odzyskania z żelu elektroforetycznego określonych frakcji
DNA lub RNA. Czynność ta, zwana elucją, wykorzystywana jest między innymi w następujących pracach:
1. DNA uzyskany w wyniku klonowania zazwyczaj poddawany jest subklonowaniu, tzn. insert lub jego fragment zostaje
przeniesiony z jednego wektora do innego. Przeniesienie insertu do nowego wektora jest konieczne, gdyż wektory stosowane do
klonowania DNA nie dają takich możliwości badawczych, jakie można uzyskać z wykorzystaniem innych wektorów, np.
wektorów ekspresyjnych lub wektorów do transformacji organizmów eukariotycznych.
2. Subklonowanie konieczne jest również wówczas, gdy w wyniku klonowania uzyskano duży fragment DNA, np. klon
genomowy obejmujący kilka genów, a celem pracy jest sklonowanie pojedynczego genu lub jego fragmentu.
3. Elucja z żelu elektroforetycznego wykonywana jest również wtedy, gdy sklonowany fragment DNA, chcemy oddzielić od
wektora a aby poddać go reakcji znakowania, np. radioaktywnym izotopem. W niektórych przypadkach DNA po znakowaniu,
ponownie poddawany jest elektroforezie, tym razem w celu oddzielenia wyznakowanej cząsteczki od radioaktywnych
nukleotydów, które nie zostały do niej wbudowane.
Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli
agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy
niskotopliwe, dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29
o
C i
depolimeryzują w temp. +65
o
C, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną
frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia
DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w –80
o
C. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje
odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości,
umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej
agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach.
Używane do elucji agarozy o normalnej temperaturze topnienia nie mogą zostać stopione termicznie gdyż temperatura, którą
należałoby zastosować, czyli ponad +60
o
C, spowodowałaby denaturację DNA. Dlatego do stopienia wyciętego fragmentu agarozy
wykorzystuje się niektóre związki chemiczne, np. NaJ. Po chemicznym rozpuszczeniu agarozy, do odzyskania DNA z roztworu
często wykorzystuje się zdolność mikrokuleczek krzemowych do adsorpcji kwasów nukleinowych na swojej powierzchni. Kuleczki
z przyłączonym DNA tworzą zawiesinę, którą może łatwo oddzielić od roztworu na drodze wirowania. Dodanie do uzyskanego
osadu wody lub buforu TE powoduje oddysocjowanie DNA z kuleczek. Metoda ta, ze względu na krótki czas trwania i wysoką
wydajność jest obecnie bardzo często wykorzystywana.
Elucja wykonana przy zastosowaniu DEAE-celulozy (dietyloaminoetyl) nie
wymaga topienia agarozy. Przeniesienie DNA na DEAE celulozę odbywa się w trakcie
rozdziału elektroforetycznego, podczas którego fragment bibułki DEAE celulozy należy
umieścić w żelu na drodze migracji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się właściwości
jonowymienne DEAE celulozy. W warunkach elektroforetycznych, czyli przy
stosunkowo niskim stężeniu soli i neutralnym pH, grupy funkcyjne DEAE-celulozy,
obdarzone ładunkiem dodatnim (+), wiążą cząsteczki DNA. Przeniesienie DEAE
celulozy do buforu o wysokim st. soli, np. NaCl, powoduje elucję DNA do roztworu.
DNA można również eluować z agarozy stosując wirowanie w probówce z filtrem. Wycięty fragment agarozy po nałożeniu na
filtr i odwirowaniu uwolni DNA, który wraz z buforem obecnym w żelu przedostanie się do probówki pod filtrem.
W przypadku elucji dużych fragmentów DNA, tzn. powyżej 5 tpz, gdy inne metody okazują się mało wydajne, zaleca się
stosowanie elektroelucji w woreczkach dializacyjnych. W metodzie tej wycięty fragment żelu z frakcją DNA przenosi się do
woreczka dializacyjnego a następnie całość umieszcza się w aparacie elektroforetycznym. Pod wpływem pola elektrycznego, DNA
migruje z żelu i zatrzymuje się przy wewnętrznych ściankach woreczka. Po usunięciu agarozy, DNA łatwo może zostać wypłukany z
woreczka do nowej probówki.
Oprócz przedstawionych technik spotkać można wiele innych sposobów odzyskiwania DNA z żeli agarozowych.
DNA z żeli poliakryloamidowych często eluowany jest po reakcji znakowania. W tym przypadku, przed przystąpieniem do
elucji należy zidentyfikować pozycję DNA z wykorzystaniem autoradiografii. Następnie fragment żelu z DNA lub RNA zostaje
wycięty, zmacerowany i zawieszony w buforze elucyjnym (1 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 M octan amonu; 10mM octan magnezu; 0,1%
SDS). Całość poddawana jest następnie kilkunastogodzinnej inkubacji, podczas której kwasy nukleinowe dyfundują z
rozdrobnionego żelu do buforu. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę żelu należy odwirować od buforu zawierającego uwolniony
DNA. Na zakończenie, DNA z roztworu należy wytrącić etanolem.
Sprzęt i odczynniki
–
agaroza niskotopliwa
–
trawiony DNA
–
aparaty elektroforetyczne
–
obciążacz LB
–
skalpel pęseta
–
DEAE celuloza (Schleicher & Schuell
NA-45
®
)
–
buf. NTE "low"
–
buf. NTE "high"
–
fenol
–
chloroform
–
bufor TE 10/1
–
octan amonu 10M
–
etanol 96%
–
etanol 75%
