UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
09-02-18 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.18.02.18
- 1 z 3 -
Wła
ś
ciwo
ś
ci fizykochemiczne białek
Zadanie 1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego białka
Celem zadania jest oznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny na
podstawie jej zachowania w roztworach o ró
Ŝ
nym pH.
Wykonanie. Do 6 probówek odmierzy
ć
podane w tabeli obj
ę
to
ś
ci
mianowanych roztworów CH
3
COOH i wody destylowanej, tworz
ą
c tym samym
ró
Ŝ
ne
ś
rodowiska reakcji. Nast
ę
pnie do ka
Ŝ
dej probówki dodawa
ć
kroplami
po 1 cm
3
0,5% roztwór kazeiny w 0,1 mol/dm
3
CH
3
COONa. Po dodaniu ka
Ŝ
dej
kropli wstrz
ą
sn
ąć
probówk
ą
. Odstawi
ć
zawarto
ść
probówek na 30 min i po
tym czasie zaobserwowa
ć
zmiany zm
ę
tnienia roztworów. Wyniki zanotowa
ć
w
tabeli: brak zm
ę
tnienia (-) lub ró
Ŝ
ne stopnie zm
ę
tnienia (+,++,+++).
Obliczy
ć
pH w ka
Ŝ
dej probówce, posługuj
ą
c si
ę
równaniem Hendersona –
Hasselbalcha.
W jakim pH zm
ę
tnienie jest najwi
ę
ksze? Ile wynosi warto
ść
punktu
izoelektrycznego dla kazeiny?
Nr probówki
Składnik, cm
3
1
2
3
4
5
6
0,01 mol/dm
3
CH
3
COOH
0,6
1,3
-
-
-
-
0,1 mol/dm
3
CH
3
COOH
-
-
0,3
1
8
-
1 mol/dm
3
CH
3
COOH
-
-
-
-
-
1,6
H
2
O
8,4
7,7
8,7
8
1
7,4
0,5% kazeina
1
1
1
1
1
1
Zm
ę
tnienie
pH
Zadanie 2. Wysalanie albumin i globulin
Celem zadania jest rozdzielenie mieszaniny białek surowicy poprzez
proces
wysalania,
który
wykorzystuje
wła
ś
ciwo
ś
ci
chemiczne
poszczególnych białek.
Wykonanie. Do 5 cm
3
surowicy doda
ć
równ
ą
obj
ę
to
ść
nasyconego
roztworu (NH
4
)
2
SO
4
. Po wytr
ą
ceniu kłaczkowatego osadu globulin roztwór
przes
ą
czy
ć
. Do supernatantu dodawa
ć
(NH
4
)
2
SO
4
in substantia porcjami i
miesza
ć
a
Ŝ
do momentu, w którym na dnie probówki pozostan
ą
kryształki
nierozpuszczonego (NH
4
)
2
SO
4.
Wytr
ą
ca si
ę
wówczas osad albumin. Po
ods
ą
czeniu zbada
ć
rozpuszczalno
ść
osadu w H
2
O. Przes
ą
cz skontrolowa
ć
na
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
09-02-18 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.18.02.18
- 2 z 3 -
obecno
ść
białka prób
ą
str
ą
ceniow
ą
z kwasem trichlorooctowym (TCA) lub
sulfosalicylowym.
Zadanie 3. Str
ą
canie białek kwasami nieorganicznymi i organicznymi
Celem
zadania
jest
obserwacja
działania
st
ęŜ
onych
kwasów
nieorganicznych oraz niektórych organicznych na białko. W reakcjach
tych mo
Ŝ
e dochodzi
ć
do denaturacji białka.
Wykonanie. Do 3 probówek odmierzy
ć
po 1 cm
3
1% roztworu białka
jaja. Nast
ę
pnie do 1, 2 i 3 probówki wprowadzi
ć
odpowiednio po 0,5 cm
3
st
ęŜ
onego HCl, HNO
3
, i H
2
SO
4
. Zawarto
ść
ka
Ŝ
dej probówki wstrz
ą
sn
ąć
. W
probówce z HCl i H
2
SO
4
osad zdenaturowanego białka rozpuszcza si
ę
(sole
białek z tymi kwasami silnie dysocjuj
ą
). Natomiast w probówce z HNO
3
osad nie znika po wstrz
ąś
ni
ę
ciu.
Do 2 innych probówek odmierzy
ć
po 2 cm
3
1% roztworu białka jaja.
Nast
ę
pnie do 1 probówki wprowadzi
ć
kroplami 5% roztwór kwasu TCA, a do
2 probówki – 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego. Wytr
ą
ca si
ę
biały
osad.
Kwas
sulfosalicylowy
i
TCA
tworz
ą
z
białkami
sole
nierozpuszczalne
i
dlatego
s
ą
stosowane
do
odbiałczania
płynów
biologicznych. Zwi
ą
zki te w wi
ę
kszych st
ęŜ
eniach wywołuj
ą
denaturacj
ę
białka.
Zadanie 4. Str
ą
canie białek kationami metali ci
ęŜ
kich
Celem zadania jest obserwacja działania soli metali ci
ęŜ
kich (Cu,
Hg, Pb) na białko w zale
Ŝ
no
ś
ci od pH.
Do 3 probówek odmierzy
ć
po 2 cm
3
1% roztworu białka o pH = 3 i do
3 kolejnych tego samego białka o pH = 8. Nast
ę
pnie do ka
Ŝ
dej z probówek
kolejno dodawa
ć
wymienione w tabeli odczynniki. Zanotowa
ć
powstanie (+)
lub
brak
(-)
osadu.
Wyja
ś
ni
ć
wyniki
reakcji
w
poszczególnych
probówkach, uwzgl
ę
dniaj
ą
c
ś
rodowisko oraz zjonizowanie odpowiednich
grup.
Białko jaja
Odczynnik
pH 3
pH 8
10% CuSO
4
5% HgCl
2
5%
(CH
3
COO)
2
Pb
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
09-02-18 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.18.02.18
- 3 z 3 -
Zadanie 5. Ilo
ś
ciowe oznaczenia białka w badanej próbie
Celem zadania jest ilo
ś
ciowe oznaczenia zawarto
ś
ci białka w
badanej próbie metod
ą
biuretow
ą
na podstawie przygotowanej wcze
ś
niej
krzywej kalibracyjnej.
Wykonanie. Odmierzy
ć
1 cm
3
otrzymanego roztworu białka, doda
ć
4 cm
3
odczynnika miedziowego. Po 20-25 min mierzy
ć
absorbancj
ę
przy długo
ś
ci
fali 545 nm.
Na podstawie krzywej kalibracyjnej wyznaczy
ć
st
ęŜ
enie procentowe
białka w otrzymanym roztworze.
Uwaga! Wykorzysta
ć
krzyw
ą
kalibracyjn
ą
przygotowan
ą
na poprzednich
ć
wiczeniach.
Próba
Absorbancja
przy 545 nm
St
ęŜ
enie białka
[%]
1
2
Ś
rednia
-