Sprawozdanie 1. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 1 z 3 
Data zajęć: 2008/10/17 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.

 

Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Marta Kłoczaniuk 
Aleksandra Korkuś 

 

 

 Wstęp 

Aldolazy  to  enzymy  należące  do  klasy  liaz.  Występują  w  różnych  izoformach.  Izolowane 

są  z  tkanki  mięśniowej,  wątroby  i  mózgu.  Biorą  udział  w  jeden  z  reakcji  glikolizy  oraz 

glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.) 

CH

2

OPO

3

C

C

C

C

CH

2

OPO

3

O

H

O

H

OH

H

OH

CH

2

OPO

3

C

C

H

O

OH

H

C

C

CH

2

OPO

3

OH

O

H

H

fruktozo-1,6-disfosforan

aldolaza

+

fosfodihydroksyaceton

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

2-

2-

2-

2-

 

Reakcja 1. – Reakcja katalizowana przez aldolazę 

Stężenia  enzymu 
 można  próbować  wyznaczyć  poprzez  pomiar  absorbancji  przy  280  nm 
oraz  stosując  prawo  Lamberta-Beera  (1),  gdzie  to  współczynnik  ekstynkcji,  a  do  długość 

drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń. 

 

   ·  · 
 

(1) 

Aktywność  enzymu  wyznacza  się  poprzez  zmianę  stężenia  (poprzez  zmianę  absorbancji) 

w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności U definiuje się zgodnie ze wzorem (2). 

 

U 

 µmol substratu

 min

 

(2) 

Test hydrozynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym 

oznaczaniu  zmiany  stężenia  hydrazonu  aldehydu  3-fosfoglicerynowego  (H)  przy  240  nm. 

W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny 

w stosunku 1:1. 

Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3). 

 



















 

(3) 

Cel 

Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym. 

Wykonanie {Trzeba dopisać treść instrukcji, sam załącznik to za mało} 

Doświadczenie  przeprowadzono  zasadniczo  zgodnie  z  treścią  instrukcji.  Do  wyznaczenia 

stężenia aldolazy użyto po 3000 μl buforu oraz odmierzono 60 μl stężonego roztworu aldolazy. 

Sprawozdanie 1. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 2 z 3 
Data zajęć: 2008/10/17 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.

 

Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Marta Kłoczaniuk 
Aleksandra Korkuś 

 

 

Wyniki 

Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych 

 

pomiar 1° 

pomiar 2° 

średnia* 

uwagi 





 

 µl! 

60 

- 



"#

 

 

0,1954 

odczyt 
ze spektrofotometru 

$

ald



 

 mg/ml! 

0,2147 

$

ald





(

)*+

,

)*+

+,%

·/

 



0

 

 µl! 

23 



0



1

ald

2

ald

)

 



3#

4

 

 

0,09 

0,08 

0,085 

odczyt z wykresu 1. 



3#

5

 

 

0,265 

0,26 

0,262 

odczyt z wykresu 1. 

Δ

3#

 

 

0,175 

0,18 

0,178 

Δ

3#

 

3#

5

7 

3#

4

 

 

$

ald

0

 

 mg/ml! 

2,866 ∙ 10

–3

 

$

ald

0



2

ald

)

8

)9

 

Δt 

 min! 

3 

3 

3 

- 

Akt

ald

0

 

 U/ml! 

0,0214 

0,0220 

0,0217 

Akt

ald

0



<(

)=+

>

?

·/·∆A

· 10

0

 

Akt

tot

0

 

 U! 

0,0369 

0,0379 

0,0374 

Akt

tot

0

 Akt

ald

0

· 

0

 

Akt

spec

0

 

 U/mg! 

7,47 

7,68 

7,58 

Akt

spec

0



Akt

ald

9

2

ald

9

 

* średnia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°. 

gdzie: 
 

masa aldolazy: G

ald

 5 µg 

 

długość drogi optycznej (szerokość kuwety):   1 cm 

masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): 

"#

#,%

 0,91 

ml

mg·cm

 

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydronazonu GAP (przy 240 nm): J

K

 2730 

1

M·cm

 

 

objętość: 

0

 1,5 ml P 200 µl P 23 µl  1723 µl  1,723 ml 

 

rozcieńczenie: 

0



Q

9



)9



)9





9



)9



R0 µl

0 µl

 74,9 

 

 

Sprawozdanie 1. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 3 z 3 
Data zajęć: 2008/10/17 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.

 

Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Marta Kłoczaniuk 
Aleksandra Korkuś 

 

 

Tabela 2. – Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy 

wykonane na podstawie wartości średnich pomiarów 1° i 2° 

 

uwagi 

$

ald



 

 mg/ml! 

10,9 

$

ald



 



· 

0

· $

ald

0

 



· $

ald



 

Akt

ald



 

 U/ml! 

82,9 

Akt

ald



 



· 

0

· Akt

ald

0

 

Akt

tot



* 

 U! 

82,9 

Akt

tot



 Akt

ald



· 



 

Akt

spec



 

 U/mg! 

7,58 

Akt

spec





Akt

ald



2

ald





8

)

·8

)9

·Akt

ald

9

8

)

·8

)9

·2

ald

9

 Akt

spec

0

 

* objętość wyjściowego preparatu aldolazy 



 1 ml. 

gdzie: 

 

rozcieńczenie: 





Q

)



)



)



0### µlT# µl

T# µl

 51 

Wnioski 

Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami 

spektrofotometrycznymi. Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie, 

z dobrym przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu, 

im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita 

(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia 

enzymu i wynosi średnio 7,58 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych 

od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,15). 

{Można było dodać coś o samym teście enzymatycznym.} 

Załączniki 

1.

 

Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.). 

2.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi notatkami.