1
ZAKŁAD BIOCHEMII
UMCS
BIOCHEMIA II
I rok II stopnia
Biochemia
ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM
Wstęp
Elektroforezę można najogólniej określić jako ruch fazy rozproszonej względem fazy rozpraszającej
zachodzący pod wpływem przyłożonej zewnętrznie różnicy potencjałów.
Istotę elektroforezy stanowi wędrówka w polu elektrycznym cząsteczek posiadających ładunek elektryczny
(dodatni lub ujemny) i proces rozdzielania tych cząsteczek na skutek różnicy szybkości ich wędrowania w
roztworze (elektroforeza swobodna) lub w nośnikach (tzn. w roztworach wypełniających kręte kapilary
nośników). Nośnikami mogą być takie substancje, jak np. bibuła, agar, skrobia, żel agarozowy, żel
poliakrylamidowy.
Jedną z najczęściej stosowanych obecnie metod elektroforetycznych jest elektroforeza żelowa. Pozwala
ona na uzyskanie lepszych wyników rozdziału mieszaniny związków niż stosowana dawniej elektroforeza
bibułowa. Środowisko żelowe w przeciwieństwie do bibuły nie przejawia własności adsorpcyjnych i
charakteryzuje się większą zdolnością rozdzielczą, gdyż cząsteczki wędrujące w polu elektrycznym z różną
szybkością zależną od ich ładunku, podlegają w żelu "przesiewaniu molekularnemu". Rolę "sita" spełniają pory
w sieci żelu, których wielkość zależy od rodzaju i sposobu przygotowania żelu.
Najbardziej selektywną i bardzo czułą metodą analitycznego rozdziału mieszanin białkowych jest
elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE - polyacrylamide gel electrophoresis). Stosowana jest ona min.
jako dogodne kryterium czystości enzymów. Rozdział ten może jednak ulegać zaburzeniom, jeżeli w
mieszaninie poddawanej elektroforezie istnieją tendencje do tworzenia kompleksów między cząsteczkami tych
samych lub różnych białek. Stosowanie środków denaturujących (jak mocznik lub chlorowodorek guanidyny)
bądź detergentów zapobiega agregacji. Powszechnie stosowana jest elektroforeza w obecności
dodecylosiarczanu sodu (SDS) - anionowego detergentu, który wiążąc się z białkami wiązaniami jonowymi jak
też poprzez oddziaływania hydrofobowe, rozszczepia ich kompleksy (SDS-PAGE). SDS nadając białkom silny
ładunek ujemny powoduje, że wszystkie wędrują do anody, z szybkością zależną od wielkości cząsteczek.
Elektroforeza w warunkach denaturujących i w obecności SDS jest stosowana do badania homogennosci białek,
oznaczania ich masy cząsteczkowej i liczby podjednostek w białkach oligomerycznych.
Żel poliakrylamidowy powstaje w procesie kopolimeryzacji akrylamidu (H
2
C=CH-CO-NH
2
) z N,N’-
metyleno-bis-akrylamidem [(H
2
C=CH-CO-NH)
2
CH
2
] w obecności odpowiednich katalizatorów. Zwykle do
polimeryzacji stosuje się nadsiarczan amonu (NH
4
)
2
S
2
O
8
i TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminę).
Inhibitorem reakcji polimeryzacji jest tlen cząsteczkowy obecny w powietrzu, dlatego roztwory żelu
należy odpowietrzyć przed polimeryzacją, a po uformowaniu warstwy żelu na jego powierzchnię nawarstwić
wodę (lub n-butanol nasycony wodą).
Wielkość porów żelu zależy przede wszystkim od stężenia akrylamidu, ale także od proporcji akrylamid
: bisakrylamid i ustala się ją w zależności od masy cząsteczkowej badanych białek. Najczęściej stosuje się
stężenie 7-10%, przy którym można uzyskać dobre wyniki w przypadku białek o masie cząsteczkowej 20 – 150
2
kDa. Do elektroforezy białek o mniejszej cząsteczce stosuje się żel o wyższym stężeniu akrylamidu, np. 15-20%,
a w przypadku bardzo dużych - o niższym stężeniu akrylamidu, nie niższym jednak niż 3,5%.
Rozdział białek przebiega wewnątrz słupka żelu zamkniętego w rurce szklanej („elektroforeza
rurkowa”) lub w cienkiej warstwie (elektroforeza płytowa). Żel może być jednorodny lub złożony z dwu warstw
o różnej gęstości i pH, przez które kolejno przechodzi rozdzielany materiał. W tym ostatnim przypadku, warstwa
lub słupek żelu składa się z dolnej części "rozdzielającej" i umieszczonej ponad nią części "zagęszczającej", w
której próbka ulega zagęszczeniu przed wniknięciem do warstwy separującej.
W zależności od wartości punktu izoelektrycznego (pI) nakładanych białek stosuje się żel rozdzielający
o różnym pH (3,0-9,0), zaś pH żelu zagęszczającego wynosi zwykle 6,0-7,0. Stężenie akrylamidu w tej ostatniej
warstwie żelu wynosi 2-5%. Elektroforezę białek o niskim pI przeprowadza się w środowisku alkalicznym
(tzw. elektroforeza anodowa), zaś białek o wysokim pI - w środowisku kwaśnym (tzw. elektroforeza katodowa).
Próbkę nakłada się albo w roztworze zawierającym monomery akrylamidowe, które polimeryzują
tworząc trzecią warstwę żelu zamykającą badany materiał, albo też roztworze sacharozy lub glicerolu (5-25%).
Ilość białka, jaką się zwykle stosuje, wynosi 10-100 µg/żel.
Białka rozdzielone podczas elektroforezy uwidacznia się w żelu przez wybarwianie czernią amidową
(Amido Black), błękitem Coomassie (Coomassie Brilliant Blue R250) lub jonami srebra. Niektóre białka
enzymatyczne można również uwidocznić w żelu wykorzystując ich aktywność katalityczną. W tym celu stosuje
się po elektroforezie barwienie substratowe. W najprostszym przypadku, kiedy enzym przekształca bezbarwny
substrat w barwny produkt, stosuje się inkubację żelu w roztworze substratu zawierającym bufor o odpowiednim
pH oraz dodatkowe potrzebne składniki (np. donory lub akceptory elektronów, koenzymy). Substrat dyfunduje
w głąb żelu i w miejscu, gdzie znajduje się enzym zostaje przekształcony w barwny produkt.
Taką metodą uwidacznia się m. in. lakazę, stosując do barwienia po elektroforezie roztwór gwajakolu. Wymaga
to jednak przeprowadzenia procesu elektroforetycznego w warunkach pozwalających na zachowanie aktywności
badanych enzymów (elektroforeza natywna). Nie można więc stosować środków denaturujących, a proces
rozdziału należy przeprowadzać w niskiej temperaturze.
Wykonanie ćwiczenia:
Elektroforezę białek przeprowadzamy w nieciągłym systemie buforowym. Jako bufor elektrodowy
stosuje się bufor: 0,025 M Tris, 0,192 M glicyna, o pH 8,3. Żel składa się z dwóch warstw: warstwy żelu
rozdzielającego (10%) oraz warstwy żelu zagęszczającego (3%).
Do przygotowania żelu rozdzielającego (10%) należy użyć:
1 000 mg akrylamidu (UWAGA! NEUROTOKSYNA)
33 mg bisakrylamidu
14 mg nadsiarczanu amonu
dopełnić do 10 ml 0,375 M buforem Tris-HCl, pH 8,8.
Składniki rozpuścić, odpowietrzyć i bezpośrednio przed naniesieniem między płytki aparatu do
eletroforezy pionowej (PAGER MINI) dodać 7µl TEMED-u.
Uformować warstwę żelu rozdzielającego i nawarstwić wodą destylowaną w celu odcięcia powietrza.
3
Pozostawić do polimeryzacji (ok. 0,5 - 1 godz.).
Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, usunąć wodę i wprowadzić roztwór żelu zagęszczającego
(3%) przygotowanego według podanego poniżej przepisu. Następnie umieścić w nim grzebień formujący
studzienki na próbki, w taki sposób, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się pod ząbki grzebienia.
Przygotowanie żelu zagęszczającego (3%):
150 mg akrylamidu (UWAGA! NEUROTOKSYNA)
10 mg bisakrylamidu
7 mg nadsiarczanu amonu
dopełnić do 5 ml 0,125 M buforu Tris-HCI, pH 6,8.
Po rozpuszczeniu składników, roztwór żelu odpowietrzyć i dodać 7 µl TEMED-u Czas polimeryzacji
tego żelu wynosi min. 30 min.
Rozdział elektroforetyczny
Po spolimeryzowaniu żelu zagęszczającego należy wlać bufor elektrodowy do obu ("górnego" i
"dolnego") zbiorników aparatu i ostrożnie wyjąć grzebień formujący, uważając by nie oderwać części żelu
rozdzielających poszczególne studzienki. Przy napełnianiu zbiorników buforem elektrodowym zwrócić uwagę,
by drut elektrody był całkowicie zanurzony w buforze.
Próbki białka (preparat lakazy), zagęszczone 2% sacharozą lub 20% gliceryną i zabarwione 0,03%
błękitem bromofenolowym nanieść do odpowiednich studzienek w objętości: 5 µl, 10 µ1, 15 µl, 20 µl, 25 µl.
Aparat do elektroforezy połączyć przewodami z zasilaczem i rozpocząć proces rozdziału - początkowo przy
napięciu 100 V (żel zagęszczający), a po wniknięciu próbek do warstwy żelu rozdzielającego zwiększyć napięcie
do 150 V.
Zasilacz odłączyć, gdy czoło barwnika znajdzie się w odległości ok. 5 mm od końca żelu. Wylać bufor,
otworzyć aparat, przeciąć żel wzdłuż na 2 części i odpowiednio wybarwić.
Barwienie białek metodą srebrową (Fast Protocol Zakład Bioch. Univ. Iowa (2001)):
1) Zanurzyć żel na 30 minut w kąpieli „fiksującej” zawierającej:
40ml metanolu
13,5ml formaldehydu
46,5ml H
2
O (MilliQ)
2) Zanurzyć żel na 1 minutę w 0,02% Na
2
S
2
O
3
3) Barwienie:
Zanurzyć żel na 10 minut w 0,1% azotanie srebra (0,lg/100 ml) UWAGA: roztwór nietrwały sporządzić
tuż przed barwieniem!
Spłukać wodą (MilliQ)
4) Rozwijanie:
Zanurzyć żel w kąpieli rozwijającej zawierającej:
3% Na
2
CO
3
50 µl formaldehydu
2 ml 0,02% Na
2
S
2
O
3
4
Reakcję zatrzymać dodatkiem kwasu cytrynowego in substancia
Przenieść do wody MilliQ.
Barwienie substratowe:
Żel umieścić w kąpieli zawierającej 1 ml gwajakolu w 100 ml 0,1M buforu Mc Ilvaine’a pH 5,3
Obserwować pojawiające się prążki.
Zaliczenie ćwiczenia:
Zamieścić w zeszycie opis ćwiczenia. Przerysować do zeszytu wybarwiony elektroferogram (uwzględniając
obie metody ujawniania rozdzielonych substancji).
5
Odczynniki i sprzęt:
aparat do elektroforezy i przewody przyłączające zasilacz
pompa olejowa rotacyjna
kolbki ssawkowe 100 ml - 2 szt.
korki do kolbek ssawkowych
cylinder 25 ml - 2 szt;
strzykawki 2 ml i 10 ml z igłami
pojemniki do barwienia
mini-strzykawka do nawarstwiania próbek
kolbka lub zlewka 100 ml
bufor elektrodowy: 0,025 M Tris, 0,192 M glicyną, pH 8,3
akrylamid - stosować rękawiczki 1-razowe i maseczkę
N,N’-metyleno-bis-akrylamid
nadsiarczan amonu
TEMED
Bufor żelu rozdzielającego: 0,375 M bufor Tris-HCI, pH 8,8
Bufor żelu zagęszczającego: 0,125 M bufor Tris-HCI, pH 6,8
Barwienie białka: UWAGA: wszystkie roztwory odczynników w wodzie milliQ!
metanol,
formaldehyd
0,02% Na
2
S
2
O
3
(0,02g/100 ml)
azotan srebra
3% Na
2
CO
3
,
kwas cytrynowy
woda milliQ
Barwienie substratowe:
gwajakol 1g/100ml etanolu
0,1M bufor Mc Ilvaine’a pH 5,3
Piśmiennictwo:
1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), 2005, Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa