Analiza jakościowa aminokwasów
20 aminokwasów stanowi budulec białek,
aminokwasy są także prekursorami w syntezie związków istotnych dla życia:
→
Glicyna – porfiryny (synteza, prekursor)
→
Glicyna, Glutamina, Kwas asparaginowy – puryny (synteza)
→
Glutamina, Kwas asparaginowy – pirymidyny (synteza)
→
Glicyna, Kwas glutaminowy, Kwas asparaginowy, GABA – neuroprzekaźniki
→
L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) – synteza dopaminy i adrenaliny
→
S-adenozylometionina – donor CH
3
w reakcjach metylacji
→
Ornityna i cyrulina – amin. cyklu mocznikowego
→
Ornityna – prekursor poliamin
→
Arginina – synteza tlenku azotu (substrat)
→
trijodotyronina, tyroksyna – hormony tarczycy (poch. tyrozyny)
Wszystkie aminokwasy białkowe są alfa (wyj. prolina), wszystkie steroizomery L (wyj. glicyna).
podział aminokwasów
→
hydrofobowe
•
Gly
•
Ala
•
Val
•
Leu
•
Ile
•
Met
•
Phe
•
Trp
•
Pro
→
hydrofilowe
•
Ser
•
Thr
•
Cys
•
Tyr
•
Asn
•
Gln
•
Asp ( kwaśne)
•
Glu ( kwaśne)
•
Lys (zasadowe)
•
Arg (zasadowe)
•
His (zasadowe)
Wykrywanie aminokwasów
Reakcja ninhydrynowa (ilościowe oznaczanie aminokwasów)
→
dekarboksylacja, deaminacja aminokwasów
→
powstaje: aldehyd uboższy o jeden węgiel, NH
3
i CO
2
→
ninhydryna redukuje się do hydrindantyny
→
purpura Ruhemana, związek niebiesko fiołkowy (ninhydryna, hydrindantyny, NH
3
)
→
prolina i hydroksyprolina dają żółte zabarwienie bo nie posiadają grupy α-aminowej
Reakcja ksantoproteinowa (wykrywanie aminokwasów aromatycznych)
→
aminokwasy aromatyczne po dolaniu stężonego kwasu i ogrzaniu, dają żółte pochodne
nitrowe
→
po zalkalizowaniu silniej zabarwione pochodne
Reakcja Adamkiewicza – Hopkinsa (wykrywanie układu indolowego)
→
w środowisku stężonych kwasów nieorganicznych związki zawierające układ indolowy
ulegają kondensacji z aldehydami tworząc barwne kompleksy:
•
z aldehydem mrówkowym (reakcja Voissenta)
•
z kwasem glioksalowym
Reakcja Pauli’ego (wykrywanie układy imidazolowego)
→
w środowisku alkalicznym
→
sprzęganie pierścienia imidazolowego histydyny z jonem p-sulfobenzenodiazoniowym
→
tworzą pomarańczowy barwnik azowy
Odczyn Sakaguchi’ego (wykrywanie układu guadyninowego)
→
w obecności utleniacza (bromian (I) sodu lub potasu)
→
grupa guanidynowa argininy tworzy z α naftolem pomarańczowoczerwony barwnik
→
mocznik stabilizuje powstały barwnik
Reakcja z nitroprustdkiem sodu (wykrywanie grup tiolowych)
→
nitroprusydek sodu i związki zawierające (-SH) tworzą kompleks o zabarwieniu czerwono
fiołkowym
Analiza jakościowa białek
funkcje białek:
→
substancje budulcowe
→
elementy kurczliwe
→
enzymy
→
hormony
→
cząsteczki transportujące
→
receptory komórkowe
→
czynniki wzrostu i różnicowania komórek
→
regulatory funkcji komórkowych
→
czynniki transkrypcyjne
→
substancje odpowiedzialne za odporność organizmu substancje zapasowe
→
toksyny
białko
→
jeden lub kilka łańcuchów polipeptydowych ( łańcuch zawiera 100 – 1000 aminokwasów)
→
masy cząsteczkowe są rożne( kilkanaście tysięcy do kilka milionów kDa)
•
lizozym – 14 kDa
•
albuminy – 68 kDa
•
konektyny (tityny) – ponad 3800 kDa
→
istnieją także białka złożone mające trwale wbudowanym składnik niebiałkowy (gliko-, liko-,
metalo-, chromoproteiny) :
•
cukrowy
•
lipidowy
•
jon metalu
•
naturalny barwnik
→
struktura
•
I rzędowa: sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym (podajemy od N-końca)
•
II rzędowa: rodzaj regularnego przestrzennego ułożenia łańcucha, stabilizowana
wiązaniami wodorowymi ( α-helisa, β-harmonikja )
•
III rzędowa: przestrzenne ułożenie całego łańcucha polipeptydowego stabilizowana przez
wzajemne oddziaływanie reszt bocznych ( oddziaływania : wodorowe, hydrofobowe,
elektrostatyczne, mostki disiarczkowe)
•
IV rzędowa: wzajemne położenia łańcuchów polipeptydowych ( tylko białka
oligomeryczne )
dimery (homodimery, heterodimery)
trimery
tetramery
Wykrywanie białek
Reakcja Biuretowa (wiązania peptydowe)
→
dają ją związki mające 2 wiązania peptydowe
→
biuret = dimocznik
→
w środowisku zasadowym wiązanie ulega tautomeryzacji (forma enolowa)
→
skompleksowanie jonów miedzi przez enolowe formy wiązań peptydowych
→
dwa wiązania jonowe z atomami tlenu
→
cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu
→
kompleks jest fioletowy
Wysalanie białek osocza
→
białka dobrze rozpuszczają się w wodzie i wodnych roztworach soli
→
duże stężenia soli powodują wysalanie białek ( konkurencja o cząsteczki wody)
→
jest to proces odwracalny
→
wysalanie przebiega najłatwiej w pH równym punktowi izoelektrycznemu
→
do wysalania stosuje się sole obojętne których jony tworzą hydraty np. (NH
4
)
2
SO
4
•
25% nasycenie – fibrynogen
•
50% nasycenie – globuliny
•
80% nasycenie – albuminy i dobrze rozpuszczalne globuliny
Denaturacja białek
→
Naruszenie lub zniszczenie natywnej konformacji białka, i utratę jego funkcji pod wpływem:
•
wysokiej temperatury
•
mocnych kwasów nieorganicznych
•
mocnych zasad
•
niektórych kwasów organicznych (trichlorooctowy, sulfosalicylowy, pikrynowy,
fosforowolframowy)
•
rozpuszczalników organicznych (alkohole, aceton)
•
kationów metali ciężkich ( Fe
2+
, Fe
3+
, Hg
2+
, Pb
2+
),
•
sole metali ciężkich stosuje się w preparatce białek
→
denaturowane białka są gorzej rozpuszczalne i często ulegają wytrąceniu z roztworu
→
do odbiałczania próbek osocza stosuje się kwas trichlorooctowy (TCA)
→
wytrącone białko usuwa się przez odwirowanie