IMMUNODIAGNOSTYKA
ANALITYKA MEDYCZNA, rok II
ĆWICZENIA LABORATORYJNE
dr Magdalena Frydrychowicz
dr Mariusz Kaczmarek
dr Husam Samara
POZNAŃ 2013
IMMUNODIAGNOSTYKA
ANALITYKA MEDYCZNA, rok II
ĆWICZENIA LABORATORYJNE
dr Magdalena Frydrychowicz
dr Mariusz Kaczmarek
dr Husam Samara
POZNAŃ 2013
2
Ćwiczenie 1
Ocena jakościowa reakcji antygen − przeciwciało.
Zagadnienia:
antygeny, hapteny, antygenowość, immunogenność, epitop, powinowactwo, awidność,
przeciwciała, monoklonalność, poliklonalność, monowalentność, poliwalentność,
precypitacja, krzywa precypitacji, obszar ekwiwalentny, warunki reakcji precypitacji,
metody oparte o zjawisko precypitacji, immunoelektroforezy, immunofiksacja, złożone
techniki serologiczne, immunoblotting, doting, testy immunochromatograficzne,
immunoprecypitacja, aglutynacja, warunki reakcji aglutynacji, metody oparte o
zjawisko aglutynacji
1. Metody oparte o zjawisko precypitacji:
podwójna dyfuzja w agarze (PDA) - metoda Ouchterlony’ego, immunodyfuzja.
Do wyciętych w żelu agarozowym studzienek nanosi się badane surowice i roztwory
przeciwciał, które dyfundują w nośniku. W miejscu spotkania obu składników
badanego układu tworzą się łuki precypitacyjne.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują preparaty PDA i oceniają precypitaty powstałe
podczas reakcji kompleksów immunologicznych z odpowiednimi przeciwciałami.
immunoelektroforeza prosta (IM-EL) – metoda umożliwia ocenę białek zawartych
w surowicy, łączy elektroforezę i immunodyfuzję.
W pierwszym etapie mieszaninę białek zawartą w surowicy, umieszczoną w żelu
agarozowym rozdziela się przy pomocy prądu elektrycznego. Następnie wycina się w
żelu równoległy do kierunku migracji białek rowek, który wypełnia się
odpowiednimi przeciwciałami. Dyfundujące w żelu składniki układu (badane białka i
przeciwciała) tworzą łuki precypitacyjne o charakterystycznym kształcie i wielkości.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują poszczególne etapy immunoelektroforezy oraz
oceniają powstałe precypitaty.
2. Złożone techniki serologiczne:
immunoblotting
Poszukiwane przeciwciała zawarte w badanych surowicach wykrywane są przy
pomocy immobilizowanych w nitrocelulozie białek antygenu. W skład systemu
detekcyjnego wchodzi także antyglobulinowy koniugat wyznakowany enzymem
(np. peroksydaza chrzanowa lub alkaliczna fosfataza). Dodanie substratu dla
odpowiedniego enzymu powoduje powstanie nierozpuszczalnego w wodzie produktu
widocznego, jako barwny prążek na nitrocelulozie.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują test western-blott przy pomocy,
którego oznaczają przeciwciała przeciw antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym
przy pomocy testu paskowego ANA profile 3 EUROLINE firmy EUROIMMUN.
3
Preparatyka:
I.
Podwójna dyfuzja w agarze (PDA)
1. Sprzęt i odczynniki:
wypoziomowany stolik
odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6
9 cm lub szkiełka podstawowe
metalowa sztanca do PDA
pipeta szklana 10 – 25 ml
mikropipeta regulowana 10 – 200
l
1 % agar lub agaroza w soli zbuforowanej pH 7,6 (PBS)
łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa
wilgotna komora
próbki badanych antygenów i odpowiednie surowice odpornościowe (zwierzęce)
2. Materiał badany:
surowica pacjenta lub inny roztwór białka do analizy (min. ilość 50
l, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
Podczas 24 h inkubacji w komorze wilgotnej dochodzi do swobodnej dyfuzji białek
próbki badanej i zastosowanych do identyfikacji przeciwciał zwierzęcych. W miejscu
zetknięcia się obu składników układu dochodzi do powstania kompleksów
immunologicznych, a następnie (w strefie ekwiwalencji, tzn. równowagi stężeń
Ag-Ab) wytrącenia się precypitatu, który można analizować wizualnie
4. Wykonanie
gorący agar wylać przy pomocy ogrzanej pipety na płytkę szklaną do uzyskania
warstwy grubości ok. 1 mm,
po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu przy pomocy sztancy,
napełnić przeciwstawne studzienki roztworami antygenu i odpowiednio dobranych
surowic odpornościowych lub seryjnymi rozcieńczeniami tej samej surowicy
odpornościowej,
umieścić płytkę w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej na 24 lub 48 h.
5. Ocena i interpretacja wyników:
PDA jest techniką jakościową; powstanie łuku precypitacyjnego świadczy o obecności
poszukiwanego białka w próbce badanej; stosując podwójne rozcieńczenia
analizowanej surowicy odpornościowej można określić jej miano (tzn. największe
rozcieńczenie, przy którym powstaje widoczny w żelu precypitat).
4
II.
Immunoelektroforeza prosta (IM-EL)
1. Sprzęt i odczynniki:
wypoziomowany stolik
odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6
9 cm lub szkiełka podstawowe
metalowa sztanca do IM-EL
pipeta szklana 10 – 25 ml
mikropipeta regulowana 10 – 200
l
1 % agaroza w buforze weronalowym 0,01M pH 8,6
łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa
aparat do elektroforezy
zasilacz
wilgotna komora
wzorcowa surowica ludzka
królicze przeciwciała przeciw ludzkim Ig GAM
2. Materiał badany:
surowica ludzka (min. ilość 50
l, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
etap I – elektroforeza: rozdział białek badanej surowicy w polu elektrycznym,
etap II – 24 h inkubacja: białka surowicy badanej i dodane po elektroforezie
przeciwciała zwierzęce tworzą w pierwszej fazie kompleksy Ag-Ab, a następnie w
strefie ekwiwalencji, prążki precypitatu.
4. Wykonanie:
przygotować bufor weronalowy:
weronal (184 g) + weronal sodu (10,3 g)
rozpuścić w wodzie, doprowadzić pH do 8,6, uzupełnić do 1L objętości.
gorący agar wylać na płytkę szklaną do uzyskania warstwy ~ 1 mm
po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu i napełnić je próbkami badanych surowic
(nierozcieńczonych); do jednej ze studzienek podać wzorcową surowicę ludzką;
umieścić płytkę w aparacie do elektroforezy, połączyć żel na płytce z buforem w
zbiornikach aparatu przy pomocy „kluczy” z bibuły Whatman 3,
przeprowadzić elektroforezę w warunkach: 120 V; 0,1 A; 80 min; przewidywana
wędrówka immunoglobulin w kierunku elektrody (–)
po wyłączeniu z prądu płytkę wyjąć z aparatu, wyciąć rowki równoległe do
przewidywanego rozdziału białek, usunąć z nich żel,
wypełnić rowki odpowiednio dobranymi surowicami zwierzęcymi (po 50
l),
umieścić płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
5
5. Ocena i interpretacja wyników:
tworzące się w żelu łuki precypitacyjne oceniamy wizualnie po 24 h inkubacji
odnosząc długość, grubość i kształt poszczególnych linii do linii uzyskanych z
ludzką surowicą wzorcową; ocena ma charakter jakościowy
poziom danej immunoglobuliny uważa się za prawidłowy („norma”) jeśli uzyskany
w trakcie testu łuk precypitacyjny nie różni się zasadniczo od uzyskanego w tym
samym teście łuku dla surowicy wzorcowej. W przeciwnym przypadku poziom
ocenianej immunoglobuliny podaje się jako obniżony lub podwyższony („wzrost”,
„spadek”). Białko monoklonalne uważa się za obecne jeśli wyraźnemu wzrostowi
poziomu jednego z łańcuchów lekkich immunoglobulin towarzyszy istotny spadek
poziomu drugiego łańcucha lekkiego (odpowiednio kappa lub lambda) i temu
obrazowi towarzyszy wyraźna dysproporcja w poziomach łańcuchów ciężkich
immunoglobulin (istotny wzrost poziomu jednej klasy immunoglobuliny przy
jednoczesnym spadku poziomu pozostałych).
III.
Immunoblotting
1. Sprzęt i odczynniki:
pipety nastawne 1 – 1000
l
probówki 1,5 ml
zestaw ANA Profile 3 EUROLINE firmy EUROIMMUN
2. Materiał badany:
surowica ludzka (min. ilość 50
l, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
Opakowanie
zawiera
paski
testowe
z
naniesionymi
w
postaci
linii
scharakteryzowanymi biochemicznie antygenami. Każdy pasek pozwala na wykrycie
in vitro 14 różnych antygenów: nRNP, Sm, SS-A (SS-A natywne i Ro 52), SS-B, Scl-
70, Jo-1, CENP B, PCNA, dsDNA, nukleosomy, histony, rybosomalne białko P oraz
AMA-M2 w surowicy lub plazmie. W pierwszym etapie paski membrany inkubuje się
z rozcieńczonymi surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała
klasy IgG (a także IgA i IgM) wiążą się podczas drugiego etapu inkubacji z
przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat
enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną.
4. Wykonanie:
1. Przeznaczone do badania próbki surowicy oraz kontrolę dodatnią należy
rozcieńczać w stosunku 1:101 w buforze do próbek (np. 15
l surowicy + 1,5 ml
buforu do próbek);
2. Bufor do próbek jest gotowy do użycia;
3. Koniugat
enzymatyczny
należy
rozcieńczyć
w
stosunku
1:10
(np. 150
l + 1,35 ml buforu do próbek);
4. Bufor do płukania należy rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:10
(1 ml buforu do płukania + 9 ml wody/pasek).
6
Preinkubacja: paski należy umieścić w rynienkach inkubacyjnych tak aby numer
paska był widoczny. Inkubować 5 min w 1,5 ml buforu do próbek, a następnie
usunąć bufor z rynienek.
Inkubacja z surowicą: do rynienek nałożyć po 1,5 ml rozcieńczonych surowic
pacjentów. Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej (+ 18 − 25
C)
z ostrożnym mieszaniem (kołyska laboratoryjna).
Płukanie: opróżnić rynienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem
używając 1,5 ml buforu płuczącego (3
5 min, kołyska laboratoryjna).
Inkubacja z koniugatem: nałożyć do każdej rynienki reakcyjnej po 1,5 ml roztworu
koniugatu enzymatycznego (znakowana alkaliczną fosfatazą kozia Ig anty-ludzka
IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
Płukanie: opróżnić rynienki inkubacyjne. Płukać jak wyżej.
Inkubacja z substratem: nałożyć do każdej rynienki inkubacyjnej po 1,5 ml
roztworu substratu/chromogenu (NBT/BCIP). Inkubować 10 min w temperaturze
pokojowej na kołysce laboratoryjnej.
Przerwanie reakcji: opróżnić rynienki i trzykrotnie płukać wodą destylowaną
(3
1 min, kołyska laboratoryjna).
Pomiar: Paski należy umieścić na arkuszu protokołu oceny testu i wysuszyć.
Arkusz zeskanować i dokonać oceny półilościowej testu przy pomocy programu
EUROLineScan firmy EUROIMMUN.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Zależnie od intensywności wybarwienia prążka wynik dla poszczególnych antygenów
podaje się jako negatywny, słabo dodatni, dodatni, silnie dodatni.
7
Ćwiczenie 2
Ocena ilościowa reakcji antygen-przeciwciało.
Zagadnienia:
elektroforeza rakietkowa, immunodyfuzja wg Mancini, turbidymetria, nefelometria,
metody wykorzystujące odczynniki znakowane, RIA, ELISA, wiarygodność
metody diagnostycznej, przykłady zastosowania testów diagnostycznych
Metody oceny ilościowej:
odczyn immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)
W metodzie ELISA studzienki reakcyjne mikropłytek (faza stała) opłaszczone są
antygenem. W pierwszym etapie przeciwciała obecne w badanych surowicach łączą
się z zaadsorbowanym antygenem. W drugim etapie do układu dodaje się
wyznakowanego enzymem koniugatu antyglobulinowego. Następnie dodawany jest
substrat dla enzymu, który w reakcji z enzymem daje barwny produkt. Przy użyciu
odpowiedniego czytnika można mierzyć różnice w zabarwieniu reakcji w zależności
od stężenia poszukiwanej substancji.
W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą ELISA poziom autoprzeciwciał
w klasie IgG przeciw antygenowi dsDNA.
Preparatyka:
Odczyn immunoenzymatyczny ELISA
1. Sprzęt i odczynniki:
pipety nastawne 1 – 1000
l
probówki 1,5 ml
statyw do probówek
zestaw ELISA Anty-dsDNA (IgG) firmy EUROIMMUN
2. Materiał badany:
surowica ludzka (min. ilość 50
l, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
Opakowanie zawiera mikropłytkę ze studzienkami reakcyjnymi opłaszczonymi
antygenem. W pierwszym etapie studzienki reakcyjne inkubuje się z rozcieńczonymi
surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała klasy IgG wiążą się
z obecnymi na powierzchni studzienki antygenami. Związane przeciwciała wykrywa
się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko
ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie
katalizuje reakcję barwną.
8
4. Wykonanie
Przeznaczone do badania próbki surowicy należy rozcieńczyć w stosunku 1:101
w buforze do próbek (np. 10
l surowicy + 1 ml buforu do próbek). Bufor do
próbek, koniugat enzymatyczny, kalibratory i kontrole gotowe są do użycia. Bufor
do płukania należy rozcieńczyć destylowaną wodą w stosunku 1:10 (np. 5 ml
buforu do płukania + 45 ml wody).
Inkubacja próbek surowicy: zgodnie ze schematem nałożyć do studzienek
reakcyjnych po 100
l surowicy kalibracyjnej, pozytywnej i negatywnej surowicy
kontrolnej oraz rozcieńczone surowice pacjentów. Inkubować 30 min w
temperaturze pokojowej (+ 18 – 25
C).
Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne i trzykrotnie płukać (30 – 60 s),
za każdym razem używając 300
l rozcieńczonego buforu płuczącego. Po każdym
płukaniu płytkę mikrotitracyjną należy odwrócić studzienkami w dół i silnie
wytrząsnąć nad papierem filtracyjnym, aby całkowicie usunąć resztki buforu
płuczącego.
Inkubacja koniugatu: nałożyć do każdej studzienki reakcyjnej po 100
l roztworu
koniugatu enzymatycznego (znakowana peroksydazą królicza Ig anty- ludzka IgG).
Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej.
Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne. Płukać jak wyżej.
Inkubacja substratu: nałożyć do każdej studzienki reakcyjnej po 100
l roztworu
substratu/chromogenu. Inkubować 15 min w temperaturze pokojowej; chronić
przed światłem.
Przerwanie reakcji: nałożyć do każdej studzienki reakcyjnej, w tej samej kolejności
i z tą samą szybkością, co przy pipetowaniu substratu, po 100
l roztworu
przerywającego reakcję.
Pomiar: fotometryczna ocena intensywności barwy powinna być przeprowadzona
w ciągu 30 min. Od zastopowania reakcji, przy długości fali
= 450 nm i
referencyjnej długości fali > 620 nm.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Odwzorowując w linearnym układzie współrzędnych wartości ekstynkcji 3 surowic
kalibracyjnych i odpowiadające im względne jednostki (RU/ml), a następnie łącząc
naniesione punkty, wykreśla się krzywą wzorcową, z której można odczytać
stężenie przeciwciał w surowicy. Krzywą można wykreślić także za pomocą
programu komputerowego.
Do akceptowania i dokumentowania wyników wykorzystuje się program
komputerowy dostarczony przez firmę EUROIMMUN.
Górna granica normy (cut-off) rekomendowana przez EUROIMMUN wynosi
20 jednostek relatywnych (R/ml). Rekomenduje się następującą interpretację
wyników:
< 16 RU/ml
negatywny
16 – 22 RU/ml
graniczny
> 22 RU/ml
pozytywny
9
Ćwiczenie 3
Ocena immunofenotypu leukocytów krwi obwodowej.
Zagadnienia:
pojęcie immunofenotypu, cytofluorymetria przepływowa, cytometr przepływowy,
względna wielkość komórki, względna ziarnistość komórki, średnia intensywność
fluorescencji, zjawisko fluorescencji, markery różnicowania, immunofenotyp krwi
obwodowej
Ocena immunofenotypu:
immunofluorescencja bezpośrednia – oznaczanie z pełnej krwi obwodowej
Określenie antygenów tzw. markerów różnicowania (ang.
cluster of differentiation
;
CD) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, celem zróżnicowania komórek
immunologicznie kompetentnych.
W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą immunofluorescencji bezpośredniej
obecność antygenów różnicowania leukocytów krwi obwodowej i przeprowadzają
analizę immunofenotypową badanych próbek.
Preparatyka:
Immunofluorescencja bezpośrednia
1.
Sprzęt i odczynniki:
cytometr przepływowy
zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000
l
probówki cytometryczne
statyw do probówek
tryskawka do PBS
zlewka
10
stężony bufor lizujący
roztwór PBS pH 7,4
przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem
płyn lizujący
woda destylowana
2.
Materiał badany:
1. krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem EDTA (min. ilość
500
l)
10
3.
Zasada metody:
Określenie przy pomocy cytofluorymetru przepływowego zespołu charakterystycznych
cech antygenowych komórki, które pozwalają zidentyfikować populacje komórek o
istotnym znaczeniu diagnostycznym.
4.
Wykonanie
Do probówek wprowadzić po 2
l odpowiednich przeciwciał.
Następnie do każdej probówki dodać po 50
l dokładnie wymieszanej krwi.
Inkubować 15 – 20 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.
Do każdej probówki dodać po 500
l roztworu buforu lizującego, rozcieńczonego
wodą destylowaną 1 : 10 i dokładnie wymieszać.
Inkubować 10 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.
Przerwać lizę dodając do probówki ~2 ml PBS z tryskawki.
Wirować probówki 5 min z prędkością 1500 obr./min.
Usunąć supernatant.
Ponownie do probówki dodać PBS i wirować jak wyżej.
Usunąć supernatant i zawiesić osad w 150
l PBS, próbki gotowe do akwizycji.
5.
Ocena i interpretacja wyników:
Ocenę wykonanych próbek przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego
stosując odpowiedni program komputerowy. W trakcie oceny immunofenotypowej
określa się odsetek komórek wykazujących fluorescencję danego fluorochromu.
11
Ćwiczenie 4
Ocena czynnościowa komórek układu odpornościowego.
Zagadnienia:
komórki immunologicznie czynne, komórki pomocnicze, metody izolacji komórek,
testy czynnościowe, reakcje nadwrażliwości, testy skórne, metody oceny funkcji
limfocytów, test transformacji blastycznej, metody oceny aktywacji komórek,
mitogeny, testy cytotoksyczne, metody oceny wydzielania cytokin, metody oceny
funkcji komórek żernych, ocena adhezji, ocena zdolności do chemotaksji, zaburzenia
chemotaksji, ocena zdolności do fagocytozy, indeks fagocytarny, zaburzenia
fagocytozy, ocena zdolności do zabijania wewnątrzkomórkowego, wybuch tlenowy,
zaburzenia wybuchu tlenowego, zaburzenia zabijania wewnątrzkomórkowego
1. Izolacja komórek na gradiencie i oznaczanie żywotności komórek.
metoda izolacji w gradientach gęstości
Wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze właściwym poszczególnych komórek.
Stosuje się mieszaniny rozdzielające: Ficoll (Percoll) – Isopaque (Uropolina) –
[metoda Boyum’a], Gradisol (mieszanina Uropoliny i dekstranu) o różnej gęstości.
Krew pobraną na antykoagulant i wymieszaną z PBS nawarstwia się na odpowiedni
gradient i wiruje. Po wirowaniu komórki zbiera się powstałej interfazy.
ocena żywotności izolowanych komórek
W celu oceny żywotności komórek wykorzystuje się np. roztwór błękitu trypanu.
Dodanie tego barwnika pozwala ocenić przepuszczalność błony komórkowej.
W teście martwe komórki barwią się na niebiesko. Oceniane komórki liczy się na
kamerze pod mikroskopem świetlnym.
W trakcie ćwiczeń studenci przeprowadzają separację PBMC z krwi obwodowej oraz
oceniają ich żywotność.
2. Ocena cyklu komórkowego komórek ustalonej linii hodowlanej.
Do badanych komórek dodaje się 100
l roztworu 0,1 % saponiny w celu ich
permabilizacji. Po inkubacji i wirowaniu do permabilizowanych komórek dodaje się
roztwór jodku propidyny. Wyznakowane jodkiem propidyny preparaty poddaje się
akwizycji przy pomocy cytometru przepływowego. W trakcie analizy ocenia się
poszczególne fazy cyklu komórkowego.
W trakcie ćwiczeń studenci przeprowadzają barwienie jodkiem propidyny komórek
ustalonej linii hodowlanej, a następnie obliczają odsetki komórek w poszczególnych
fazach cyklu komórkowego.
12
Preparatyka:
I.
Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) w gradiencie
gęstości
1. Sprzęt i odczynniki:
probówki plastikowe 15 ml i 50 ml
zestaw regulowanych mikropipet 10 – 1000
l
Gradisol L (FICOLL o d = 1,077 g/cm
3
)
Bufor PBS
2. Materiał badany:
2. krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem heparyną (min. ilość
500
l)
3. Zasada metody:
Na określoną objętość gradientu gęstości nawarstwia się rozcieńczoną PBS krew
obwodową. Po odwirowaniu zbiera się interfazę bogatą w komórki limfoidalne. Na
dnie probówki zbierają się erytrocyty i granulocyty, które przedostały się przez
warstwę Ficollu.
4. Wykonanie
Pobraną na heparynę krew rozcieńczyć w probówce 50 ml roztworem PBS
w stosunku 1 : 3.
Do probówki 15 ml wprowadzić Gradisol L i krew zawieszoną w PBS w stosunku
1 : 1 (3 : 1) tak aby zachować granicę faz.
Wirować probówki w ciągu 20 min, w temperaturze 20
C, przy 2000 obr./min.
Zebrać z interfazy pierścień komórek jednojądrzastych.
Płukać dwa razy w PBS. Wirować w temperaturze 4
C przy 200 g.
Komórki zawiesić w PBS.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Ocenę izolacji PBMC przeprowadza się pod mikroskopem świetlnym.
13
II.
Liczenie komórek na hemacytometrze oraz określenie żywotności komórek
przy pomocy błękitu trypanu.
1. Sprzęt i odczynniki:
hemacytometr (kamera do liczenia komórek, np. Burkera)
zestaw regulowanych mikropipet 10 – 1000
l
probówki plastikowe
mikroskop świetlny
błękit trypanu 0,05 %
2. Materiał badany:
jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowane w gradiencie gęstości
3. Zasada metody:
W wyniku barwienia błękitem trypanu komórki martwe wybarwiają się na niebiesko,
do wnętrza komórek żywych barwnik nie wnika.
4. Wykonanie
Zmieszać 10
l zawiesiny komórek z 10
l 0,05 % błękitu trypanu (stosunek 1 : 1).
Nałożyć 10
l mieszaniny komórek i błękitu trypanu na hemacytometr pod
szkiełko nakrywkowe.
Umieścić kamerę do liczenia komórek pod mikroskopem świetlnym.
Obliczyć ilość żywych (niewybarwionych) i martwych (niebieskich) komórek
zawartych na powierzchni 1 mm
2
. Powtórzyć liczenie dla 3 – 4 różnych pól i
obliczyć średnią liczbę komórek na 1 mm
2
.
Po zakończeniu liczenia wyczyścić kamerę i szkiełko nakrywkowe wodą oraz 70%
alkoholem, a następnie osuszyć.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Przeliczyć całkowitą liczbę żywych komórek wg wzoru:
# żywych komórek = średnia # żywych komórek
rozcieńczenie
2
1
10
5
(np. # komórek
10 ml
2
10 000)
Obliczyć % żywych komórek wg wzoru:
komórek
wszystkich
h
policzonyc
komórek
żywych
h
policzonyc
#
#
100 = % żywych komórek
14
III.
Ocena cyklu komórkowego komórek ustalonej linii hodowlanej.
1. Sprzęt i odczynniki:
cytometr przepływowy
zestaw regulowanych mikropipet 10 – 1000
l
probówki cytometryczne
statyw do probówek
tryskawka do PBS
zlewka
roztwór PBS pH 7,4
1 % roztwór saponiny w RPMI + 10 % surowicy FBS
roztwór jodku propidyny 100
g/ml w PBS
2. Materiał badany:
komórki ustalonej linii hodowlanej.
3. Zasada metody:
Jodek propidyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra komórkowe
badanych komórek interkalując z helisą DNA. Barwnik ten emituje czerwone światło
fluorescencji w zakresie możliwym do oceny przy pomocy cytometru przepływowego.
4. Wykonanie
Do badanych komórek dodać 200
l 1 % roztworu saponiny.
Próbkę inkubować 30 min w lodówce.
Po tym czasie wirować próbkę 10 min przy prędkości 1500 obr./min
w temperaturze 4
C.
Supernatant odrzucić, a uzyskany osad zawiesić w 150
l schłodzonego buforu
PBS zawierającego 100
g/ml jodku propidyny.
Próbę inkubować 30 min w temperaturze 4
C chroniąc przed światłem
(w lodówce).
Po tym czasie próbę poddać akwizycji przy użyciu cytometru przepływowego.
5. Ocena i interpretacja wyników:
W trakcie przeprowadzanej analizy ocenia się średnią intensywność fluorescencji
(MFI) emitowaną przez jodek propidyny interkalujący z DNA badanych komórek.
Ocenę intensywności fluorescencji przeprowadza się przy pomocy histogramu.
15
Ćwiczenie 5
Metody immunomorfologiczne.
Zagadnienia:
sposoby detekcji reakcji antygen-przeciwciało, reakcje immunoenzymatyczne,
reakcja APAAP, reakcja ABC, reakcja LAB, reakcje z użyciem barwnika
fluorescencyjnego, immunofluorescencja wielokolorowa, mikroskopia konfokalna,
mikroskopia wielofotonowa, reakcje z użyciem metali ciężkich, mikroskopia
elektronowa, technologia ImageStream
Reakcje z użyciem barwnika fluorescencyjnego:
zamrażanie materiału tkankowego
Szybkie zamrażanie zapobiega powstawaniu niszczących strukturę tkanki dużych
kryształów lodu.
reakcja pośredniej immunofluorescencji IMF
Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy w chorobach autoimmunologicznych.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują preparaty mikroskopowe na skrawkach
tkankowych z wątroby szczura i oceniają je pod mikroskopem fluorescencyjnym.
I.
Zamrażanie materiału tkankowego.
1. Sprzęt i odczynniki:
termos z cienkościennym naczyńkiem metalowym
pęseta
worek foliowy
mieszanina zamrażająca (suchy lód + aceton)
płyn oziębiający (eter naftowy)
płyn o dużej gęstości zamrażany razem z tkanką (tzw. Tissue-tek)
2. Materiał badany:
blok tkankowy
3. Zasada metody:
Materiał tkankowy w trakcie rekcji immunomorfologicznych należy odpowiednio
zamrozić. Zamrażanie powinno odbywać się jak najkrótszym czasie, aby zapobiec
tworzeniu się w tkance kryształów lodu, które mogą uszkodzić fizycznie tkankę.
16
4. Wykonanie
Zamrażany blok tkankowy zanurza się w mieszaninie zamrażającej przygotowanej
wcześniej w termosie
Po kilku-kilkunastu sekundach następuje wyraźne i trwałe zblednięcie tkanki,
świadczące o zamrożeniu materiału.
Zamrożony blok tkankowy, przy pomocy pęsety wyjmuje się z mieszaniny
zamrażającej, umieszcza w opisanym woreczku foliowym i przechowuje w
zamrażarce (opt.
70
C).
II.
Oznaczanie autoprzeciwciał metodą immunofluorescencji pośredniej.
1. Sprzęt i odczynniki:
szkiełka z preparatami wątroby szczura (substrat antygenowy dla wykrywanych
autoprzeciwciał)
kriostat
odtłuszczone w alkoholu szkiełka nakrywkowe
pipety jednorazowe i regulowane
probówki plastikowe
statyw do probówek
płuczka szklana
komora wilgotna
bufor PBS o pH 7,6
przeciwciała królicze anty ludzkie IgG, A, M znakowane FITC
surowica kontrolna
90 % buforowana gliceryna
błękit Evansa
2. Materiał badany:
surowica badana w ilości ~ 2 ml.
3. Zasada metody:
Autoprzeciwciała obecne w badanych surowicach przyłączają się w pierwszym etapie
do substratu antygenowego (antygenów w skrawkach wątroby szczurzej) na szkiełkach
podstawowych. W drugim etapie następuje detekcja autoprzeciwciał przy pomocy
wyznakowanej fluoresceina antyglobuliny.
4. Wykonanie
wyjąć szkiełka z antygenami z lodówki i doprowadzić je do temperatury pokojowej
pod wentylatorem;
przygotować rozcieńczenia badanych surowic w roztworze PBS (rozc. od 1 : 80);
17
nałożyć po 25
l surowic (kontrolnych i badanych) a szkiełko ze skrawkami;
inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3
5 min;
nałożyć 20
l anty-ludzkiej IgG, A, M/FITC na szkiełko;
inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3
5 min;
zamknąć w glicerolu/PBS pod szkiełkiem nakrywkowym;
do ostatniego płukania można dodać błękit Evansa (10 kropli na 150 ml
PBS − Tween).
5. Ocena i interpretacja wyników:
Ocenę preparatów przeprowadza się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za reakcję
dodatnią uznaje się obecność żółtozielonej fluorescencji (w odpowiednim substracie
komórkowym w zależności od rodzaju autoprzeciwciał).
18
LITERATURA:
1. Żeromski J. Immunologia dla studentów wydziału lekarskiego. Wyd. AM, Poznań
2008;
2. Żeromski J. Metody immunologiczne. Przewodnik do ćwiczeń z immunologii dla
studentów Wydziału Lekarskiego. Wyd. AM, Poznań 1997;
3. Kątnik-Prastowska I. Immunochemia w biologii medycznej. Metody Laboratoryjne.
PWN, Warszawa 2009;
4. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W. Diagnostyka laboratoryjna z elementami
biochemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Elsevier Urban&Partner,
Wrocław 2009
5. Luft S. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. PWN, Warszawa 1996;
6. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunologia. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2008;
7. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W. Stokłosa T. Immunologia. PWN, Warszawa 2008;
8. Ptak W., Ptak M., Szczepanik M. Podstawy immunologii. PZWL, Warszawa 2009;
9. Zeman K. Zaburzenia odporności u dzieci. PZWL, Warszawa 2002;
10. Zabel M. Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999;
11. Zuba-Surma E.K., Kucia M., Ratajczak M.Z. Post. Biol. Kom. 2007; 34(2): 361- 376;
12. Porcedury ANA Profile 3 EUROLINE i Anty- Borrelia plus VlsE (IgG) ELISA firmy
EUROIMMUN