BIOTECHNOLOGIA ściąga i pojęcia

BIOTECHNOLOGIA
Biotechnologia to zintegrowane zastosowa-
nie wiedzy i techniki w dziedzinach bioche-
mii mikrobiologii i nauk in

ynierskich w celu

technologicznego wykorzystania drobno-
ustrojów, kultur tkankowych lub ich cz

ęś

oraz molekularnych analogów dla pozyska-
nia produktów i usług. Biotechnologia to

wiadczenie dóbr i sług z zastosowaniem

metod biologicznych. Biotechnologia jest
dyscyplin

nauk technicznych wykorzystuj

procesy biologiczne na skal

przemysło-

wa. Biotechnologia jest interdyscyplinarn

dziedzin

w sobie nauki techniczne i

przyrodnicze, obejmuj

badanie, wytwa-

rzanie i wykorzystanie DNA/RNA, białek /
enzymów, drobnoustrojów, kultur komórko-
wych w procesach modyfikacji genetycznej,
biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a
tak

e wyodr

bnianie i modyfikacje tak

otrzymywanych bioproduktów.
Wykład 2
W zwi

zku z pojawieniem si

metod pozwa-

laj

cych na ingerowanie w naturalny

materiał genetyczny drobnoustrojów przyj

powszechnie podział biotechnologii na

-tradycyjn

-przebiegaj

z u

yciem

drobnoustrojów i komórek organizmów
wy

szych nie zawieraj

cych obcego mate-

riału genetycznego
-nowoczesn

gdzie stosowane s

szczepy

drobnoustrojów lub inne linie komórkowe
skonstruowane metodami in

ynierii gene-

tycznej
Podział biotechnologii
biała biotechnologia – biotechnologia
przemysłowa wykorzystuj

ca systemy

biologiczne w produkcji przemysłowej i
ochronie

rodowiska

czerwona biotechnologia – wykorzystywana
w ochronie zdrowia
zielona biotechnologia – zwi

zana z rolnic-

twem obejmuj

ca stosowanie metod

ynierii genetycznej w celu doskonalenia

produkcji ro

linnej i zwierz

cej.

Biotechnologia czerwona wykorzystuje
systemy biologiczne w produkcji przemysło-
wej. Opiera si

na biokatalizie i bioproce-

sach. Surowce odnawialne s

tu przekształ-

cane z wykorzystaniem ple

ni, dro

bakterii, enzymów w cenne chemikalia, leki,
biopolimery, czynniki energetyczne, funkcjo-
nalne, składniki

ywno

ci.

Biotechnologia czerwona wykorzystywana w
ochronie zdrowia i medycynie. Jest wa

nym

i dynamicznie rozwijaj

cym si

obszarem

biotechnologii, w szczególno

ci w zakresie

produkcji nowych biofarmaceutyków,
rozwoju diagnostyki genetycznej, geoterapii i
ksenotransplantologii.
Biotechnologia zielona zwi

zana jest z

rolnictwem, obejmuje zastosowanie metod
in

ynierii genetycznej w celu doskonalenia

produkcji ro

linnej i zwierz

cej. Wa

nym

obszarem jest wprowadzanie transgenicz-
nych ro

lin do produkcji szczepionek

doustnych i rekombinowanych białek a tak

wykorzystanie tych

e ro

lin jako surowców

odnawialnych w biorafineriach.
HISTORIA BIOTECHNOLOGII
I okres przedpasteurowski (do połowy XIXw)
procesy fermentacyjne produkcja piwa,
wina, octu, chleba, napojów mlecznych.
Wprowadzenie procesu inokulacji – szcze-
pienia kolejnych cykli fermentacji cz

ęś

produktu finalnego lub ubocznego.
II okres przej

ciowy (pocz

tki nowych

technologii mikrobiologicznych. Naukowe
poznanie procesów mikrobiologicznych. W
1857r L Pateur wyja

nił rol

drobnoustrojów

w procesie fermentacji. Zastosowanie zło

zraszanego w oczyszczaniu

cieków. Nowe

metody biotransformacji mikrobiologicznej
orbitolu.
III okres Era nowoczesnej technologii,
podokres : ZŁOTA ERA ANTYBIOTYKÓW
nowe biotechnologie ok 100 antybiotyków w
tym penicylina, a tak

e wielu enzymów,

aminokwasów, witamin nukleotydów SCP
(białko paszowe), katalizatory immobilizo-
wane, podokres: WSPÓŁCZESNA BIO-
TECHNOLOGIA manipulacja genami poza
komórk

. Nast

pił rozwój metod rekombina-

cji DNA in vitro, in vivo. Mikrobiologiczna
produkcja insuliny, hormonu wzrostu, białek
odporno

ciowych metody klonowania i

rozmna

ania ro

lin in vivo.

Technologia mikrobiologiczna – obejmuje
procesy uwarunkowane obecno

drobno-

ustrojów. Pozwalaj

na wykorzystanie

mikroorganizmów do wywołania ró

norod-

nych przemian chemicznych oraz do
nadprodukcji wielorakich metabolitów w
ilo

ciach znacznie przewy

szaj

cych ich

potrzeby. Wi

ąż

e si

to z mo

liwo

ukierunkowanej transformacji genotypu
drobnoustrojów oraz sterowania ich metabo-
lizmem poprzez dobór odpowiednich
warunków

rodowiskowych. Obszar ten

obejmuje procesy mikrobiologicznej biosyn-
tezy i biotransformacji Fermentacja – z
punktu widzenia biochemii drobnoustrojów
poj

cie to wi

ąż

e si

z metabolizmem

beztlenowym w którym energotwórcze
procesy utleniania substratu w

glowego

przebiegaj

ce z wydzieleniem CO

nie

wymagaj

tlenu cz

steczkowego jako

cowego akceptora elektronów.

W praktyce biotechnologicznej fermentacja
słu

y do okre

lenia przemian chemicznych

w wyniku aktywno

ci metabolicznej drobno-

ustrojów, czyli obejmuje zarówno fermenta-
cje beztlenowe (np fermentacja alkoholowa)
jak równie

tlenowe (fermentacja octowa).

Technologia enzymów – obejmuje wszystkie
zagadnienia zwi

zane z zastosowaniem

enzymów w procesach biotechnologicznych.
Dział biotechnologii intensywnie rozwijaj

od II poł XX wieku. Szczególnie inten-

sywnie rozwijaj

techniki unieruchamia-

nia enzymów (immobilizacja) lub całych
komórek. Dzi

ki immobilizacji zakres

zastosowa

enzymów uległ znacznemu

rozszerzeniu. Powstał nowy dział biotechno-
logii – technologia biokatalizatorów unieru-
chomionych.
In

ynieria genetyczna – metody biologii

molekularnej umo

liwiaj

ce manipulacje

genetyczne poza komórk

czyli rekombino-

wanie DNA in vitro
In

ynieria białka – zajmuje si

problemami

zwi

zanymi z przystosowaniem enzymów do

wykonywania odpowiednich procesów
technologicznych – syntezy, transformacji
lub degradacji zwi

zków chemicznych, nie

zawsze b

cych substancjami naturalnymi.

ynieria cytogenetyczna – in

ynieria

genetyczna na poziomie komórkowym
zajmuj

ca si

głównie opracowaniem

technik fuzji komórek (np fuzja komórek
nowotworowych szpiczaka i

immunizowa-

nych komórek pozwoliła na otrzymanie
komórek mieszka

ców (hybrydoma) które

zachowuj

c cechy nowotworu szybko rosn

i wydajnie produkuj

przeciwciała.

Zalety biotechnologii gwarantuj

ce jej

dynamiczny rozwój
- du

a ró

norodno

ść

bioprocesów

– łagodne warunki przebiegu bioprocesów
– procesy przyjazne dla

rodowiska

– bezpiecze

stwo procesów biotechnolo-

gicznych
– wykorzystanie surowców,które s

odpa-

dami dla innych technologii
– przetwarzanie surowców odnawialnych
Tworzenie nowych biotechnologii
Program opracowania proces obejmuj

cy:

-faz

wst

czyli analiz

zapotrzebowania

społecznego na okre

lone produkty

-faz

badawcz

maj

na celu opracowa-

nie technologii ko

rachunkiem

ekonomicznym i podj

ciem decyzji inwesty-

cyjnych
-faz

wdro

enia czyli projektowanie oaz

budow

linii technologicznej i uruchomienie

produkcji.
Procesem technologicznym przyj

to nazy-

zapis wszystkich czynno

ci wyst

puj

cych po sobie w okre

lonej kolejno

ci,

powoduj

cych przemiany fizyczne, che-

miczne, biochemiczne surowców oraz
materiałów i prowadz

cych do otrzymania

żą

danego produktu. Opracowanie

procesu technologicznego wymaga wy-
szczególnienia procesów i operacji jednost-
kowych, okre

lenia substratów i materiałów

pomocniczych, sposobu oczyszczania i
konfekcjonowania produktu jak równie

planu zagospodarowania b

utylizacji

odpadów
Proces jednostkowy – elementarny etap
procesu produkcyjnego stosowany w
przemy

le chemicznym i pokrewnych.

Rozró

nia si

procesy podstawowe o

charakterze fizykochemicznym lub chemicz-
nym , które dzieli si

z uwagi na typ reakcji

lub rodzaj faz bior

cych udział lub warunków

przebiegu procesu
Operacje jednostkowe – s

to te czynno

jednostkowe w których wyniku zachodz

przemiany fizyczne.

Procesy biotechnologiczne maj

zró

nico-

wany charakter, mog

prowadzone

wieloma sposobami i wymagaj

ró

nych

warunków technicznych Jest uzale

nione od

-rodzaju surowca
-produktu wytwarzanego
-rodzaju biologiczno-chemicznej natury
czynnika katalitycznego
Wi

kszo

ść

bioprocesów wymaga u

ycia

-czystych kultur drobnoustrojów okre

lonych

linii komórkowych lub konkretnych enzymów
-zapewnienia warunków aseptycznych
-prowadzenia procesów w specjalnych
bioreaktorach umo

liwiaj

cych kontrol

warunków procesu. Prowadzone s

tak

procesy nie wymagaj

ce warunków asep-

tycznych i przebiegaj

ce z udziałem mie-

szanej populacji organizmów (np biologiczne
oczyszczanie

cieków). Mog

równie

prowadzone w innych warunkach np
mikrobiologiczne ługowanie metali.
Podział procesów biotechnologicznych:
-biosynteza
-biotransformacja
-biohydroliza
-fermentacja
-bioługowanie
-biodegradacja
PROGRAM OPRACOWANIA PROCESU
BIOTECHNOLOGICZNEGO
-przygotowanie technologii na przykładzie
procesu biosyntezy mikrobiologicznej
-proces obejmuje zarówno prace badawcze
jak i prace wdro

eniowe Ogólnie mo

wyró

6 etapów opracowania procesu

1. pozyskiwanie odpowiednich drobnoustro-
jów (scrining)
2. wst

pne ustalenie warunków hodowli

3. doskonalenie cech produkcyjnych
szczepów
4. optymalizacja procesu
5. powi

kszenie skali procesu

6. uruchomienie produkcji
Ad.1. Pozyskiwanie drobnoustrojów –
poszukiwanie odpowiednich drobnoustrojów
prowadz

cych okre

lony bioproces lub

wytwarzaj

cych okre

lony bioprodukt

(izolacja, ocena przydatno

ci, warunki

przechowywania) charakterystyka materiału
biologicznego (szybko

ść

wzrostu, szybko

ść

przyswajania substratu, szybko

ść

tworzenia

produktu, szybko

ść

oddychania)

Znajomo

ść

: mikrobiologia, biochemia,

biologia kmórki
Ad.2. dobór warunków hodowli – stworzenie
warunków zapewniaj

cych szczepom

maksymaln

produkcj

(skład podło

prekursory, pH, potencjał O

, potencjał

redox, nast

pnie temperatur

, natlenienie

sposób prowadzenia hodowli: powierzch-
niowy czy wgł

bny, okresowy czy ci

gły. Na

tym etapie ustala si

równie

metody

wyodr

bniania i oczyszczania bioproduktów,

oraz warunki tych operacji: ci

nienie,

temperatura, lepko

ść

, pobór mocy.

Znajomo

ść

: mikrobiologia biochemia,

biologia komórki, in

ynieria

Ad.3. doskonalenie cech produkcyjnych
szczepu – zwi

kszenie potencjału gene-

tycznego szczepu w zakresie biosyntezy i
biotransformacji, okre

lonego substratu w

ilo

ci przewy

szaj

cej potrzeby własne

drobnoustrojów od kilkuset do kilkudziesi

ciu tysi

cy razy. Stosuje si

nast

puj

metody manipulacji genami: mutacje
genetyczne, fuzj

protoplastów, rekombina-

DNA in vitro. Ponadto dzi

ki in

ynierii

genetycznej mo

nakonstruowa

szczepy,

które syntezuj

bioprodukty, których drob-

noustroje macierzyste nigdy nie produkowa-
ły. Znajomo

ść

: genetyka, biologia moleku-

larna
Ad.4. Optymalizacja bioprocesu – ostatni
etap laboratoryjny. Jest konsekwencj

maksymalnego wykorzystania potencjału
metabolicznego drobnoustrojów. Ustala si

skład podło

a, warunki jego mieszania i

napowietrzania, kinetyki bioprocesu i in.
Cz

sto ten etap i nast

puj

ce po nim s

opracowywane przy u

yciu techniki kompu-

terowej. Znajomo

ść

: mikrobiologia, bioche-

mia,biologia komórki, chemia,in

ynieria oraz

informatyka.
Ad.5. powi

kszenie skali – przeniesienie

opracowanej w laboratorium technologii do
skali półtechnicznej (fermentatory o poj. 20-
1000L).
Znajomo

ść

ynieria, informatyka, matema-

tyka, fizyka, ekonomia, ekologia
Ad.6. uruchomienie produkcji przemysłowej
– przeniesienie wyników do

wiadcze

laboratoryjnych, półtechnicznych do warun-
ków przemysłowych (fermentatory o poj.
10tys-200tys L)
Znajomo

ść

: in

ynieria, informatyka, mate-

matyka, fizyka, ekonomia, ekologia.
Problemy bezpiecze

stwa w biotechnologii.

Do głównych nale

żą

-analiza patogenno

ci stosowanych drobno-

ustrojów
-ocena zagro

wynikaj

cych z otrzymania

i stosowania organizmów konstruowanych
metodami in

ynierii genetycznej.

ród drobnoustrojów stosowanych w

biotechnologii przewa

gatunki całkowicie

bezpieczne dla człowieka (np. bakterie
stosowane przy produkcji przetworów
mlecznych).Zastosowanie drobnoustrojów
chorobotwórczych (przy produkcji szczepio-
nek) wymaga przestrzegania

cisłych

przepisów i tworzone s

bardzo precyzyjne

mechanizmy kontroli warunków technicz-
nych bezpiecznego namna

ania drobno-

ustrojów patogennych. Zagadnieniem
budz

cym niepokój jest potencjalne niebez-

piecze

stwo zwi

zane z rozwojem in

ynierii

genetycznej i biotechnologii z u

yciem

organizmów modyfikowanych genetycznie.
Dotyczy to szczególnie szczepów konstru-
owanych dla rolnictwa jak równie

wykorzy-

stywanych do utylizacji

cieków.

Proces biotechnologiczny

Uproszczony schemat technologii zrekombi-
nowanego DNA

CHARAKTERYSTYKA DROBNOUSTRO-
JÓW PRZEMYSŁOWYCH
Termin drobnoustroje nie jest jednoznaczny.
Do grupy mikroorganizmów zalicza si

bakterie, liczne grzyby a tak

e niektóre

glony i pierwotniaki.
Wirusy to organizmy z pogranicza

ycia i

materii nieo

ywionej.

Drobnoustroje pełni

rol

w proce-

sach biotechnologicznych dzi

ki takim

cechom jak
-du

a szybko

ść

przemiany materii

-wielka ró

norodno

ść

prowadzonych reakcji

chemicznych
-znaczna zmienno

ść

fizjologiczna, co

pozwala na sterowanie przebiegiem proce-
sów
mikrobiologicznych przez dobór warunków

rodowiskowych

-łatwo

ść

dokonywania zmian genetycznych

Rodzaje produktów wytwarzanych przez
drobnoustroje
-całe komórki (dro

e, preparaty paszowe,

szczepionki preparaty mikroflory)
-produkty ko

cowe przemian metabolicz-

nych (etanol, kwas mlekowy, aceton,
butanol)
-produkty spo

ywcze (jogurt, sery, piwo,

wino)
-produkty syntez podstawowych
a)małocz

steczkowe (aminokwasy, kwas

cytrynowy, nukleotydy, witaminy)

b)wielkocz

steczkowe (enzymy, lipidy,

polisacharydy)
-produkty syntez peryferyjnych (antybiotyki,
alkaloidy dekstran)
-produkty syntez i biotransformacji z udzia-
łem prekursorów (kwas 6-
aminopenicylanowy,
kwas akrylowy)
-produkty obce dla drobnoustrojów ze
zrekombinowanym DNA (insulina, interferon,
hormon wzrostu, inne białka).
Przydatno

ść

drobnoustrojów w biotechnolo-

gii ocenia si

wg nast

puj

cych cech

ytkowych

-wydajno

ść

i szybko

ść

tworzenia produktu

-czysto

ść

produktu

-szybko

ść

wzrostu

-niepatogenno

ść

i brak produktów toksycz-

nych
-stabilno

ść

genetyczna i fenotypowa

-fagooporno

ść

-wymagania pokarmowe (ilo

ciowe i jako-

ciowe)

-tolerancja na zmienne st

ęż

enia składników

podło

-wielko

ść

zapotrzebowania na tlen oraz

tolerancja na zmiany warunków natlenienia
-wymagania w zakresie temperatury,
odczynu i innych parametrów procesów,
oraz wra

liwo

ść

na ich zmiany

-łatwo

ść

wydzielenia produktu

-inne cechy technologiczne
a)korzystne np. zdolno

ść

do flokulacji

(proces tworzenia agregatów)
b)niekorzystne np. lepko

ść

pienisto

ść

hodowli
Sposoby od

ywiania drobnoustrojów

Organizmy

ywe dzielimy

Podział organizmów

ywych:

*Podział ze wzgl

du na zwi

zki b

ostatecznym akceptorem elektronów.
*Bilans materiałowy metabolizmu glukozy z
tlenowej i beztlenowej hodowli dro

*Wymagania pokarmowe drobnoustrojów
*Drobnoustroje wykorzystywane w proce-
sach biotechnologicznych charakteryzuj

niewielkimi wymaganiami pokarmowymi.
Wi

kszo

ść

z nich to organizmy prototroficz-

ne
(zdolne do syntezy wszystkich składników
komórki z pojedynczego

ródła w

gla np.

glukozy) Niektóre szczepy s

naturalnymi

lub sztucznie indukowanymi auksotrofami,

wymagaj

cymi dodatku witamin aminokwa-

sów lub innych zwi

zków organicznych,

specyficznych dla danego procesu.
Podło

a do hodowli

-minimalne zawieraj

ce jedynie zwi

zki

niezb

dne dla wzrostu drobnoustrojów (nie

sprzyjaj

jednak szybkiemu namna

aniu

drobnoustrojów, gromadzeniu du

ej bioma-

sy czy te

wydajnej biosytnezy dlatego s

raczej stosowane w procesach badawczych
a rzadziej w procesach biotechnologicz-
nych).
-podło

a wzbogacone zawieraj

takie

składniki jak namok kukurydziany, melas

serwatk

. Podło

a kompleksowe maj

pewne wady, trudny do okre

lenia skład

jako

ciowy i ilo

ciowy co jest wynikiem

zmienno

ci i nieodtwarzalno

ci składu

chemicznego u

ytych surowców komplek-

sowych pochodz

cych z ró

nych

ródeł.

Surowce kompleksowe
Namok kukurydziany zawiera 45-55%
suchej masy głównie zwi

zki azotowe w tym

azotu białkowego 8% Jest

ródłem amino-

kwasów i peptydów poza tym zawiera
cukry(2-10%sm) kwas mlekowy(10-30%sm)
zwi

zki fosforowe(3-5%sm) jest tak

ródłem witamin i soli mineralnych.

Melasa - produkt uboczny przy produkcji
cukru z buraków cukrowych: g

sty lepki

ciemnobrunatny syrop zawieraj

cy ok 50%

cukru stosowana jet jako dodatek do pasz w
przemy

le fermentacyjnym i spo

ywczym

(produkcja spirytusu dro

y kw. Cytryno-

wego, kwasu mlekowego, gliceryny. Zwi

zki

azotowe stanowi

ponad 12% sm. Zawiera

równie

sole mineralne i witaminy.

Serwatka – produkt uboczny uzyskiwany
podczas przerobu mleka na ser i twaróg.
Wyró

nia si

serwatk

podpuszczkow

oraz

kwasow

. Zawieraj

głównie wod

a tak

tłuszcz białko i laktoz

. Serwatka zawiera k

50% laktozy zawartej w mleku jak równie

białko witaminy zwi

zki mineralne Białka

sto s

wydzielane i oczyszczone sprze-

dawane jako białko serwetkowe.
Proces pozyskiwania i ulepszania szczepów
przemysłowych
Nowe biotechnologie wymagaj

ycia

szczepów drobnoustrojów produkcyjnych o

le zaprogramowanych wła

ciwo

ciach

metabolicznych. Mo

na wyselekcjonowa

rodowiska naturalnego szczep dziki

wyró

niaj

cy si

przydatno

do okre

lo-

nego procesu biotechnologicznego jednak

opracowanie wydajnego i ekonomicznie
opłacanego procesu wymaga najcz

ęś

ciej

przeprowadzenia doskonalenia cech
u

ytkowych szczepu dzikiego. Pozyskiwanie

szczepów zasady racjonalnego skriningu
Poj

cie skriningu drobnoustrojów lub

produktów ich metabolizmu definiowane jest
jako kompleksowe post

powanie obejmuj

ce zespół selektywnych zabiegów maj

cych

na celu
-wykrycie i izolacj

spo

ród du

ej liczby

liwych tylko tych drobnoustrojów które

celem bada

-wst

ocen

przydatno

ci do danego

procesu
Ulepszanie szczepów
Klasycznym sposobem wywoływania zmian
jest dokonywanie trwałych zmian genetycz-
nych poprzez proces mutagenizacji i selekcji
wykorzystywanych mutantów. Taka
mutagenizacja genetyczna mo

e zwi

kszy

wydajno

ść

szczepu.

Mutacje
Mutacj

nazywamy zmian

w strukturze

DNA na skutek jego uszkodzenia. Mutacje
dziedziczy si

w nast

pnych pokoleniach.

Rodzaje mutacji
-mutacje spontaniczne (naturalne) zachodz

samoczynnie z cz

sto

mniejsz

10-5

powa

nym problemem w procesach

biotechnologicznych poniewa

mog

doprowadzi

do zdominowania hodowli

przez niekorzystne mutanty i doprowadzi

do utraty przez szczep produkcyjny cech
wa

nych biotechnologicznie

-mutacje indukowane zachodz

pod wpły-

wem czynników fizycznych (promieniowanie
UV najcz

ęś

ciej w zakresie tzw dalekiego UV

czyli 254-265nm, promieniowanie jonizuj

ce,pr

dkie neutrony oraz czynników che-

micznych (kwas azotawy, zwi

zki alkiluj

ce,

iperyt, nitrozoaminy, barwniki akrydynowe
przykłady zwi

zków alkiluj

cych:

-etyenoimina
-metylosulfonian metylu
-metylosulfonian etylu

-dimetylonitrozoamina
W strukturze DNA wywołane przez czynniki
mutagenne zmiany mog

dotyczy

obszaru

od kilku do kilku milionów par zasad.
Klasyczna mutagenizacja stanowi zatem
typowe post

powanie losowe: opiera si

pracochłonnej metodzie prób i bł

dów.

Schemat mutacji punktowej:
Przepływ informacji genetycznej w
komórce:

DNA

Pary zasad: T=A i G

≡

Informacja genetyczna to sekwencja zasad
heterocyklicznych.
Struktura DNA ilustruje podstawow

zale

ść

wspóln

dla wszystkich biocz

steczek

cisł

zale

ść

dzy struktur

a funkcj

Wła

ciwo

DNA które pozwalaj

temu

biopolimerowi funkcjonowa

jako wydajny i

stabilny no

nik informacji jest struktura

-DNA jest liniowym polimerem czterech
monomerów (zasad A,G,T,C)
-ka

dy nukleotyd składa si

reszty cukrowej

deoksyrybozy i grupy fosforanowej i z
zasady heterocyklicznej
-rdze

polimerowy stanowi

powtarzaj

reszty fosforanowo-cukrowe (rdze

fosforanowo-cukrowy)
Do ka

dej reszty cukrowej doł

czona jest

zasada heterocykliczna. Kolejno

ść

zasad

oznacza sekwencj

. Sekwencja stanowi

informacj

genetyczn

(instrukcj

do syntezy

białek kieruj

cych syntez

innych cz

ste-

czek, tworz

cych całe komórki i całe

organizmy.
Zasady heterocykliczne
Dwie pojedyncze nici DNA ł

tworz

dwuniciow

helis

Helisa DNA zło

ona jest z dwóch oplataj

cych si

nici uło

onych tak

e cukrowo-

fosforowy rdze

y na zewn

trz a zasady

heterocykliczne s

we wn

trzu helisy.

Najwa

niejsz

cech

tej struktury jest

specyficzno

ść

parowania si

zasad poprzez

zania wodorowe A=T G

≡

C Wi

zania

wodorowe sa znacznie słabsze od kowalen-
cyjnych. Wi

zania tego typu s

jednak

bardzo istotne z punktu widzenia układów
biologicznych i ich aktywno

ci.

Zaproponowana przez Watsona i Cricka
struktura dwuniciowej helisy DNA ma dwie
cechy o kluczowym znaczeniu w pełnieniu
przez DNA funkcji no

nika informacji

genetycznej
1. struktura ta jest kompatybilna z ka

sekwencj

zasad (pary zasad maj

zasadni-

czo taki sam kształt)
2. sekwencja wzdłu

jednej nici determinuje

całkowicie sekwencj

drugiej nici (jako wynik

komplementarno

i).

A zatem je

li dwuniciowa helisa ulega

rozdzieleniu na dwie pojedyncze nici to
ka

da z nich mo

e pełni

rol

matrycy w

tworzeniu nowej komplementarnej nici
poprzez specyficzne parowanie zasad.
RNA po

redniczy w przepływie informacji

genetycznej.
Organizmy których geny zbudowane s

DNA musz

najpierw zamieni

informacj

genetyczn

z DNA na RNA by była ona

dost

pna i funkcjonalna.

Struktura RNA jest podobna do DNA. Jest
polimerem zbudowanym z czterech mono-
merów- nukleotydów A, G, C, U. Podstawo-
w

ró

nic

dzy RNA i DNA jest to,

reszt

cukrow

jest tu ryboza a zamiast

tyminy wyst

puje uracyl.

RNA wyst

puje w komórce na ogół w

postaci pojedynczej nici jakkolwiek niektóre
segmenty s

dwuniciowe.

Funkcje jakie pełni RNA:
1. po

redniczy w przepływie informacji od

DNA do białek (transkrypcja: mRNA).
2. RNA pełni rol

steczek adaptorowych

(tRNA) które przetwarzaj

informacje

zawart

w sekwencji kwasu nukleinowego

mRNA w okre

lone białko (udział tRNA w

procesie translacji)
3. RNA jest wa

nym składnikiem maszynerii

komórkowej, która prowadzi proces transla-
cji.

rRNA jest składnikiem buduj

cym rybosomy.

Unikatowa pozycja roli RNA jako po

rednika

pomi

dzy „magazynem” informacji gene-

tycznej DNA a funkcjonalnym produktem tej
informacji – białkiem jak i mo

liwo

ść

czenia wła

ciwo

ci no

nika informacji

genetycznej i katalitycznych wła

ciwo

(rybosomy) wskazuje

e RNA odgrywa

istotn

rol

w ewolucji (hipoteza

wiata

RNA). Wszystkie białka zaczynaj

metioniny Cz

steczki transferowego RNA

rednicz

w odczytaniu informacji z DNA i

syntezie białka. Zawiera antykodon – trójka
zasad komplementarna do kodonu do ko

3' doł

czony jest odpowiedni aminokwas.

Enzymy – narz

dzia in

ynierii genetycznej

-endonukleazy przecinaj

ce DNA w tym

endonukleazy restrykcyjne
-polimerazy DNA
-odwrotna transkryptaza – synteza DNA na
matrycy mRNA (synteza cDNAkomplemen-
tarny DNA)
-ligaza enzym ł

cy kowalencyjnie odcinki

DNA (w strukturach dwuniciowych)
UPROSZCZONY SCHEMAT TECHNOLO-
GII ZREKOMBINOWANEGO DNA
Enzymy restrykcyjne – rozpoznaj

sekwen-

cje DNA i przecinaj

w danym miejscu s

to tzw. no

yczki molekularne. Wyst

puj

bakteriach a wytworzone zostały do obrony
przed bakteriofagami. Ka

dy enzym restryk-

cyjny poł

czony jest z innymi enzymami

zabezpieczaj

cymi, dzi

ki czemu nie

rozcinaj

swojego DNA. Sekwencje typu

palindromowego – czyli takie które s

symetryczne. Mog

tu wyst

trzy sposoby

rozcinania. Istnieje mo

liwo

ść

poci

cia DNA

w sposób odwracalny, mo

emy ł

czy

steczk

która słu

y nam do transformacji

danego organizmu czy innego DNA.
Enzymy s

narz

dziami in

ynierii genetycz-

nej
-polimerazy DNA- potrafi

zsyntetyzowa

komplementarn

DNA wzoruj

c si

matryc

(mo

e powieli

DNA)

-odwrotna transkryptaza- synteza DNA na
matrycy mRNA (synteza cDNAkomplemen-
tarny DNA). Enzym ten potrafi zsyntetyzo-
wa

na matrycy RNA drug

która jest ju

nici

DNA. Nast

puje rozplecenie i do nici

DNA syntezowana druga ni

DNA.

cDNA-geny wytworzone sztucznie na bazie
mRNA za pomoc

odwrotnej transkryptazy.

-ligaza- enzym który w momencie gdy
wyst

puj

nici poł

czone lepkimi ko

cami

czy je na stałe Enzym ł

czy odcinki

kowalencyjnie
PCR- polimerowa reakcja ła

cuchowa. DNA

ogrzewamy do 100°C, nast

puje rozplece-

nie nici.
Starter (primery) s

to krótkie (najcz

ęś

ciej

ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA kom-
plementarne do matrycy. Do reakcji wpro-
wadza si

matrycowy DNA, trifosforany

deoksyrybonukleotydów, startery (primery),
oraz termostabiln

polimeraz

DNA. W

szej temperaturze (zwykle około 95°C)

kaj

zania wodorowe i podwójna

helisa. DNA rozdziela si

na dwa pojedyn-

cze ła

cuchy. W temperaturze ni

szej,

okre

lonej dla danej pary starterów (pomi

dzy 45-70°C), przył

czaj

one do

matrycy. Podwy

szenie temperatury do

około 72°C powoduje utworzenie si

matrycy, z przył

czonymi do niej starterami,

kompleksu z polimeraz

DNA, wskutek

czego rozpoczyna si

synteza nici komple-

mentarnej do matrycy. Twórc

metody PCR

jest Kary Mullis. Metoda ta zacz

ła by

szeroko stosowana gdy polimeraz

Klerova

na było zast

termostabiln

polime-

raz

z bakterii Thermus aquaticus.

Polimeraza Taq. Optymalna temperatura
polimeryzacji dla tego enzymu to 70-79°C.
Enzym zachowuje zdolno

ść

polimeryzacji po

wielokrotnym ogrzewaniu do temp 95°C
(taka temperatura jest wymagana do
przeprowadzenia denaturacji dwuniciowego
DNA). Dzi

ki tym wła

ciwo

ciom polimerazy

Taq proces powielania DNA udało si

zautomatyzowa

. Proces ten polega na

umieszczeniu próbki powielanego DNA w
obj

ci nie wi

kszej ni

0,1ml. Proces

składa si

z trzech etapów:

1. denaturacja podwójnej helisy DNA
zachodzi w temperaturze 95°C przez 15-
30sek
2. renaturacja (wi

zanie hybrydyzacja

starterów) Mieszanin

szybko si

chłodzi do

okre

lonej temperatury, w której startery

mog

tworzy

dwuniciowe struktury hybry-

dowe na ko

cach ka

dej nici DNA

3. elongacja (wła

ciwy etap syntezy DNA na

matrycy DNA). Temperatur

mieszaniny

podwy

sza si

zwykle do 72°C i utrzymuje

przez zadany okres czasu aby umo

liwi

polimerazie skopiowanie ka

dej jednonicio-

wej matrycy
Metoda A (rys.)
Metoda cDNA

Metoda chemiczno enzymatyczna
Naturalne metody wymiany informacji
genetycznej u drobnoustrojów.
Rekombinacja genetyczna definiowana jako
proces w wyniku którego powstaj

nowe

kombinacje genów, stanowi podstaw

bardziej racjonalnego ani

eli mutagenizacja,

sposobu otrzymywania szczepów przydat-
nych do celów biotechnologicznych. Proces
ten wykorzystywany jest w dwojaki sposób:
1) poprzez hybrydyzacj

czyli krzy

owanie

szczepów
2) konstruowanie sztucznych kombinacji
genów in vitro i uzyskiwanie dokładnie
zaprogramowanych informacji genetycznej
w komórkach odpowiednio dobranego
gospodarza (in

ynieria gospodarcza

technologia zrekombinowanego DNA)
Podstawy hybrydyzacji
naturalna hybrydyzacja wi

ąż

e si

z przeka-

zywaniem informacji genetycznej z komórki
dawcy do biorcy w wyniku przedłu

onego

kontaktu obu komórek i polega na wymianie
odcinków DNA (rekombinacji) mi

dzy

chromosomami lub genoforami dawcy i
biorcy w procesie okre

lanym jako crossing

over. W wyniku zachodz

cej nast

pnie

separacji czyli rozdzielenia materiału
genetycznego w komórkach potomnych
mo

na otrzyma

hybrydy (rekombinaty) o

zmienionym genotypie i nowych wła

ciwo-

ciach metabolicznych. Jedn

z koncepcji

wykorzystania procesu hybrydyzacji drob-
noustrojów do ich ulepszania było pozyski-
wanie nowego warto

ciowego materiału

genetycznego ze

rodowisk naturalnych i

ycie do wzbogacania genotypów obecnie

stosowanych upo

ledzonych genetycznie

szczepów produkcyjnych. Zasadniczym
działaniem stało si

krzy

owanie szczepów,

pochodz

cych z ró

nych linii mutacyjno-

selekcyjnych zwłaszcza wywodz

cych si

od ró

nych przodków. Hybrydyzacja umo

liwia popraw

wielu wa

nych cech stano-

cych obok wydajno

ci produktu o

warto

ci technologicznej szczepów przemy-

słowych. Dotyczy to mi

dzy innymi przyswa-

janie wa

nych substratów zmiany wymaga

pokarmowych, tolerancji na zmian

ęż

enia

ró

nych składników podło

a i warunki

natlenienia, tworzenia produktów ubocz-
nych, szybko

ci wzrostu oraz takich cech

technologicznych jak pienienie si

i wła

ci-

ci filtracyjne hodowli.

Procesy paraseksualne u bakterii
Koniugacja – poł

czenie si

dwóch komórek

bakteryjnych po którym nast

puje

jednostronne przekazanie du

ych fragmen-

tów DNA z komórki dawcy (m

skiej do

komórki biorcy (

skiej ).

Transdukcja – przekazanie materiału
genetycznego przez wirusy (bakteriofagi
przenosz

fragmenty DNA z jednej komórki

do drugiej).
Transformacja – proces wnikania do komórki
biorcy fragmentów DNA bez kontaktu z
komórk

dawcy i zast

pienie przez ten

fragment DNA odpowiedniego fragmentu
genomu biorcy.
Koniugacja- poł

czenie si

dwóch komórek

bakteryjnych po którym nast

puje jedno-

stronne przekazanie du

ych fragmentów

DNA z komórki dawcy do komórki biorcy
przy czym dawc

jest komórka m

ska Hfr

biorc

komórka

ska F Proces ten

składa si

z nast

puj

cych etapów :

-ł

czenie si

komórek o ró

nych cechach

poprzez wytworzenie mostka
cytoplazmatycznego. Dla zaj

cia tego etapu

konieczne jest wyst

powanie w

cianie

komórkowej komórki biorcy tzw substancji
komplementarnych, które pozwalaj

zaak-

ceptowa

partnera

-przej

cie fragmentu DNA zawieraj

cego

cech

a+ z komórki dawcy do komórki

biorcy

-wł

czenie cechy a+ do DNA komórki biorcy

przez zast

pienie t

cech

odpowiedniego

fragmentu genomu biorcy
-powstanie rekombinatów genetycznych
posiadaj

cych now

cech

Mechanizm wnikania i namna

ania bakterio-

faga
A -adsorpcja wirusa na powierzchni komórki
bakteryjnej
B -wnikanie materiału genetycznego wirusa
do wn

trza komórki bakteryjnej

C,D -otaczanie cz

steczek wirusa w zaka-

onej komórce

E -liza komórki bakteryjnej i wydalenie z niej
fagów
Proces lizogeniczny- materiał genetyczny
wbudowuje si

w genom bakterii i pozostaje

w u

pieniu.

Mechanizm transdukcji
-w momencie zetkni

cia si

wra

liwej

komórki bakterii z fagiem nast

puje adsorp-

cja wirusa na jej powierzchni w sposób
nieodwracalny (z udziałem czułki i płytki
faga)
-skurcz osłonki ogonka fagowego i przenik-
ni

cie ogonka w gł

ciany a nast

pnie

błony komórkowej bakterii
-wprowadzenie DNA do wn

trza bakterii

kanalikiem rdzenia ogonka. Po przenikni

ciu

fag przestawia metabolizm bakterii na
produkcj

własnego DNA i własnego białka.

W rezultacie powstaj

w komórce bakteryj-

nej dojrzałe fagi przy czym niektóre z nich
posiadaj

fragmenty DNA bakterii zamiast

własnego DNA
-liza (rozpad) komórek bakteryjnych
-bakteriofag zawieraj

cy DNA fagowo-

bakteryjne, zaka

c kolejne komórki

bakteryjne b

dzie wnosił do nich ten

kompleks DNA.
Etapy transformacji
-po wyizolowaniu fragmentów DNA (materiał
genetyczny mo

e by

pobrany z komórek

martwych gdy

nie traci on swych zdolno

do przechowywania cech genetycznych
innych organizmów) z komórek dawcy
nast

puje ich sorpcja na powierzchni

komórek biorcy
-transport zaadsorbowanej cz

steczki DNA

przez

cian

komórkow

i błon

cytopla-

zmatyczn

komórek biorcy

-wł

czenie DNA dawcy do genomu biorcy

-procesy zewn

trznego wyra

ania nowej

cechy
WEKTORY
Wektory czyli przeno

niki genów

Wprowadzenie po

żą

danego genu do

wybranego mikroorganizmów wymaga
wł

czenia go do wi

kszej cz

stki DNA któr

transformuje si

komórk

biorcy. W tym celu

stosuje si

wektory

-plazmidowe
-fagowe
-kosmidowe (hybrydy składaj

ce si

DNA

plazmidowego i sekwencji cos faga lambda)
Struktura wektora musi by

tak zaprogra-

mowana aby poza wprowadzeniem po

żą

da-

nego genu do komórki zapewni

jego

-powielenie
-stabilno

ść

-dobr

ekspresj

klonowanej cechy

-łatw

detekcj

jego obecno

-ochron

zrekombinowanego DNA i produk-

tu finalnego(białka) przed enzymatyczn

degradacj

-ewentualnie transport białka poza komórk

PLAZMID
Plazmidy s

dwuniciowymi kolistymi cz

steczkami DNA naturalnie wyst

puj

cymi w

niektórych bakteriach. Ich wielko

ść

to od

kilku do kilkudziesi

ciu tysi

cy par nukleoty-

dów. Mog

wyst

powa

w komórce bakte-

ryjnej w liczbie od kilku do kilkunastu kopii.
Plazmidy posiadaj

własne regulatorowe

sekwencje nukleotydów ori(origin of replica-
tion) kontroluj

ce ich automatyczn

replika-

, która dzi

ki temu mo

e zachodzi

niezale

nie i z wi

ksz

stotliwo

powielanie DNA genoforowego (czyli
replikuj

niezale

nie od głównego chromo-

somu bakteryjnego). Charakterystyka
wektorów plazmidowych. Pojemno

ść

wektorów plazmidowych ograniczona jest
sposobem wprowadzania zrekombinowa-
nych cz

stek DNA do komórek gospodarza.

Przy klasycznej transformacji wielko

ść

wstawki nie powinna by

ksza ni

10kb (10 tys par zasad). Warto zwróci

jeszcze uwag

na ilo

ść

kopii wektora w

komórce Istniej

wektory

niskokopijne i wysokokopijne co uzale

nione

jest od rodzaju ori.
Wprowadzenie plazmidów do komórek
biorcy. Wektory plazmidowe wprowadzane
s

do komórek bakterii przy wykorzystaniu

zjawiska transformacji. W przypadku
stosowanej najcz

ęś

ciej bakterii E.Coli

wymaga to zwi

kszenia przepuszczalno

błon komórkowych czyli ukompetentnienia.
W tym celu wystawia si

komórki na wysok

koncentracj

pewnych dwuwarto

ciowych

kationów w typowej procedurze komórki
traktuje si

roztworem CaCl2. Zazwyczaj

jedna komórka na milion zostaje stransfor-
mowana i jedna cz

steczka na tysi

zrekombinowanych plazmidów transformuje
komórk

bakteryjn

. Markerem selekcyjnym

jest gen oporno

ci na antybiotyk

Komórki które nie przyj

ły plazmidu umiera-

, natomiast te które go przyj

ły

mno

żą

dalej. W plazmidach zawarte

mog

geny oporno

ci na antybiotyki i

inne substancje toksyczne, co jest dla
bakterii bardzo korzystne poniewa

umo

li-

wia przetrwanie w niesprzyjaj

cych warun-

kach. Plazmidowe geny odporno

ci na

antybiotyki stanowi

cech

selekcyj-

wykorzystywan

podczas klonowania i

namna

ania szczepów ze zrekombinowa-

nym DNA
Metoda selekcji wykorzystuj

ca obecno

ść

plazmidzie 2 genów oporno

ci na dwa ró

antybiotyki:
Selekcja na podstawie barwy
Bardziej przemy

lanym sposobem rozpo-

znania obecno

ci rekombinowanych

plazmidów, mo

liwym do przeprowadzenia

na jednej szalce jest ich przeszukiwanie na
podstawie białej lub niebieskiej barwy koloni
komórek. Metoda równie

oparta jest na

inercyjnej inaktywacji genu i wykorzystuje
powstawanie niebieskiego barwnika jako
indykatora. System selekcji opiera si

tzw te

cie alfa-komplementacji.

Stosowane s

plazmidy serii pUC. Polilinke-

ry w tego typu wektorach umiejscowione s

w obr

bie genu koduj

cego N-ko

cowy

peptyd

-galaktozydazy (białka enzyma-

tycznego który degraduje laktoz

na glukoz

i galaktoz

Transformowane s

bakterie które maj

mutacje akurat we fragmencie genu koduj

cym t

ęść

enzymu.

W takim szczepie aktywna

-galaktozydaza

powstaje dopiero po dostarczeniu prawidło-
wej cz

ęś

ci genu niesionej przez plazmidach

Kolonie zmutowanych komórek E.coli które
pobrały plazmid pUC i zostały wyhodowane
na specjalnej po

ywce zawieraj

cej chromo-

forowy substrat X-pal (5-bromo-4-chloro-3-
indolino-

-galaktozyd) maj

barw

niebie-

. Wynika to z obecno

ci w tych komór-

kach aktywnej

-galaktozydazy.

Wł

czenie w obr

b polilinkera pUC dodat-

kowego fragmentu DNA (klonowanego
genu) powoduje inaktywacj

genu loc Z i

zablokowanie syntezy N-ko

cowej cz

ęś

-galaktozydazy . Po transformacji komórek

E.coli takim plazmidem nie jest produkowa-
na

-galaktozydaza i hodowane kolonie

maj

białe zabarwienie. Tak wi

c mo

łatwo wyró

komórki zawieraj

ce wektory

zrekombinowane.
WEKTORY FAGOWE
Klonowanie w wektorze pochodnym fa-
ga.Mo

na wstawi

20-25 tys par zasad.

Genom bakteriofaga

jest dwuniciow

steczk

DNA o znanej sekwencji 49502

par zasad mieszcz

ok 40 genów.

W dojrzałych cz

steczkach wirusowych DNA

ma form

liniowej cz

steczki zako

czonej

12 nukleotydowymi jednoniciowymi „lepkimi
ko

cami”nazywanymi sekwencjami cos.

Z DNA faga lambda mo

na usun

ąć

odcinek

stanowi

cy około 30% genomu pozostawia-

c jego lewe i prawe ramie zawieraj

niezb

dne geny w cyklu

yciowym. Ponie-

do główki białkowej faga nie jest

pakowany DNA o długo

ci ró

cej si

cej ni

75-105% długo

ci DNA faga

dzikiego. Mo

na to zjawisko wykorzystywa

do selekcji zrekombinowanych cz

steczek

DNA, gdy

tylko takie b

infekcyjne.

Podobnie jak w wektorach plazmidowych do
wektorów bakteriofagowych faga

równie

wstawiono odpowiednie polilinkery,geny
markerowe, silne promotory itp.
Czynno

ci pakowania DNA do główek faga

na wykona

in vitro.

Dzi

ki 12 nukleotydowym, wzajemnie

komplementarnym jednoniciowym fragmen-

tom DNA na ko

cach cz

steczki DNA faga

tzw sekwencjom cos- mo

liwe jest przybra-

nie przez DNA faga w komórce bakteryjnej
formy kulistej oraz zapakowanie go w
białkow

główk

. Maksymalna wielko

ść

DNA który mo

e by

sklonowany w wekto-

rach stosowanych w transformacji komórek
prokariotycznych.

Typ wektora

Dł.klonówDNA

PLAZMID

10 (kb)

BAKTERIOFAG

25 (kb)

KOSMID

45 (kb)

YAC

500 (kb)

YAC-sztuczne chromosomy dro

owe.

WEKTORY EKSPRESYJNE
wektory te zawieraj

odpowiednie sekwen-

cje promotorowe i regulatorowe, które w
komórce umo

liwiaj

skuteczn

transkrypcje

przyległego do nich wprowadzonego do
wektora odcinka DNA. Wektory te kieruj

syntez

ych ilo

ci odpowiedniego mRNA

które w komórkach ulega translacji skon-
struowano ró

nego rodzaju wektory ekspre-

syjne przeznaczone do stosowania w
ró

nych komórkach gospodarzy: bakterii

dro

ach w komórkach owadzich i ssa-

czych Wektor ekspresyjny powinien
posiada

-silny promotor warunkuj

cy dobr

ekspre-

klonowanego genu

-sekwencj

liderowa wi

zania mRNA z

rybosomem
-kodon inicjacji syntezy białka naturalnego
dla gospodarza w celu wytworzenia białka
hybrydowego co chroni je przed hydroliz

przez enzymy proteolityczne gospodarza
-sekwencje sygnałowa dla białka które mog

transportowane poza komórk

Wektory ekspresyjne tego typu wykorzysta-
no do:
-celów naukowych by otrzyma

liczne białka

ne dla biologii komórki w ilo

ciach

wystarczaj

cych do przeprowadzenia

szczegółowych bada

-celów przemysłowych szczególnie do
produkcji du

ych ilo

ci białek wa

nych w

medycynie np. Produkcja czynnika VIII
krzepliwo

ci krwi, insuliny, hormonu wzrostu

lub białek wirusowych -kapsydów słu

żą

cych

jako szczepionki
INSULINA
Insulina ludzka (HI-human insulin)
Produkowany w trzustce polipeptyd zbudo-
wany z 51 aminokwasów. Mimo

e jej masa

steczkowa wynosi około 6000Da to

sto zaliczana jest do białek z uwagi na

łatwo

ść

z jak

z cynkiem lub innymi jonami

krystalizuje w postaci dimerów lub heksame-
rów. Insulina wykazuje szerokie spektrum
aktywno

ci biologicznej:

-obni

a poziom glukozy we krwi

-wzmaga biosyntez

aminokwasów, białek i

kwasów tłuszczowych
-wpływa na wnikanie glukozy do tkanek
tłuszczowych i mi

ęś

ni.

Niski poziom insuliny powoduje

e niewyko-

rzystana glukoza gromadzi si

w organizmie

i powoduje szereg dolegliwo

ci (cukrzyca).

Nieleczona cukrzyca powoduje uszkodzenie
naczy

krwiono

nych, serca tkanki nerwo-

wej i nerek. W zaawansowanych postaciach
cukrzycy jedynym lekiem ratuj

ycie jest

egzogenna insulina przyjmowana podskór-
nie lub do

ylnie. Insulina została odkryta

przez Bantinga w 1921r (nagroda Nobla w
1923r) a jej struktura pierwszorz

dowa

została ustalona przez Sangera w 1955
(nagroda Nobla w 1958r). Insulina ludzka
zbudowana jest z dwóch ła

cuchów:

-ła

cuch A zawiera 21 reszt aminokwasów

-ła

cuch b zawiera 30 reszt aminokwaso-

wych
Oba ła

cuchy poł

czone s

dwoma most-

kami siarczkowymi a w ła

cuchu A znajduje

jeszcze jeden mostek S-S.

Insulina zwierz

ca – otrzymuje si

z trzustek

wieprzowych lub wołowych Insulina

ska

ró

ni si

od ludzkiej tylko jednym amino-

kwasem – w miejscu treoniny w pozycji B30
wyst

puje alanina. Insulina bydl

ca ma

równie

alanin

w pozycji B30a tak

alanin

w miejsce treoniny w pozycji A8 oraz

walin

w miejscu izoleucyny w pozycji A10.

Insulina krystaliczna – insulina oczyszczona
przez krystalizacj

najcz

ęś

ciej kompleksu z

cynkiem (zawiera zanieczyszczenia –
proinsulin

deaminoinsulin

i inne produkty

rozkładu.
Insulina jednoskładnikowa – insulina dobrze
oczyszczona za pomoc

czenia moleku-

larnego, chromatografii cieczowej lub
ekstrakcji przeciwpr

dowej (nazwa pochodzi

od faktu i

na chromatografii HPLC jest tylko

jeden pik).
Do niedawna jedynym

ródłem insuliny były

trzustki zwierz

t rze

nych głównie trzustki

wieprzowe i wołowe. Ze wzgl

du na praco-

chłonn

technologi

jej wyodr

bniania

wyst

pował stały deficyt tego leku

Z 1kg trzustek wołowych otrzymuje si

2000

IU insuliny (1mg insuliny odpowiada 24 IU)
przy czym jedna dawka lecznicza wynosi
kilkaset IU.
Mimo

e cz

steczki insuliny zwierz

cej

ró

aminokwasami w niektórych

pozycjach to prawie wszystkie wykazuj

podobn

aktywno

ść

biologiczn

i mog

spełnia

aktywn

funkcj

w organizmie

ludzkim. Czasami zdarza si

organizm

ludzki traktuje je jak obce białka- antygen,
co przy długotrwałym stosowaniu prowadzi
do szeregu reakcji alergicznych. Z tego
powodu zostały opracowane chemiczno-
biologiczne metody transformacji insuliny
zwierz

cej w ludzk

ale ze wzgl

du na

koszty nie znalazły wi

kszego zastosowa-

nia. Dopiero rozwój in

ynierii genetycznej

stworzył realne podstawy produkcji. Synteza
insuliny w organizmie ludzkim rys.
Otrzymywanie insuliny metodami cDNA.
Otrzymywanie ludzkiej insuliny z wykorzy-
staniem zrekombinowanych bakterii E.coli.
Generalnie problem rozwi

zano na dwa

sposoby:
-otrzymano metodami in

ynierii genetycznej

oddzielnie oba ła

cuchy A i B po czym

poł

czono je na drodze chemicznej

-wytworzenie proinsuliny która była enzyma-
tycznie przekształcona w insulin

(sposób

podobny do procesu zachodz

cego natural-

nie w trzustce).
W procesie technologicznym opartym na
ł

czeniu ła

cuchów A i B

-opracowano procedury wprowadzania
genów do komórek bakterii, warunki hodowli
zrekombinowanych organizmów oraz
opracowano warunki izolacji i oczyszczania
peptydów A i B
-opracowano warunki ł

czenia peptydów A i

B w natywn

steczk

insuliny (tworzenie

dwusiarczkowych mostków w

le okre

lo-

nych pozycjach). Produkcja ludzkiej insuliny
w komórkach E.coli.
Był to niezwykle trudny etap w opracowaniu
technologii. W wyniku niekontrolowanego
poł

czenia mo

e powsta

bardzo wiele

izomerów w tym 3 monomery A monomer B,
57 dimerów A2 2 dimery B2 12 dimerów AB
(w tym jeden b

cy HI) a ponadto ponad

3000 trimerów i niezliczona liczba wy

szych

izomerów. W praktyce w wyniku spontanicz-
nego tworzenia mostków disiarczkowych
otrzymano preparat o aktywno

ci 1-2%

naturalnej insuliny. Taka wydajno

ść

była nie

do zaakceptowania w przemysłowym
procesie tworzenia leku. Opracowana
procedura polegała na wcze

niejszym

przeprowadzeniu grup tiolowych w
tioestry siarczynowe, nast

pnie reakcji

czenia ła

cuchów A i B w stosunku

molowym 2:1 przeprowadzonej w obecno

chiralnego utleniacza zwanego odczynni-
kiem Clelada-DTTditiotretiol o wzorze
HSCH2CHOHCHOHCH2SH. Takie warunki
prowadziły do otrzymania
prawidłowej cz

steczki insuliny z wydajno-

50% liczon

w stosunku do ła

cucha B

Metody otrzymywania ludzkiej insuliny
-ekstrakcja z ludzkich trzustek
-chemiczna synteza via indywidualne
aminokwasy
-transformacja

skiej insuliny semi-

synteza
-produkcja metodami in

ynierii genetycznej

SEMI-SYNTEZA
-ekstrakcja insuliny

skiej z zamro

onych

tkanek
-oczyszczanie insuliny

skiej

-biochemiczna transformacja (insulina

ska ma alanin

w B30 zamiast treoni-

ny). Transformacj

wykonuje si

wobec

trypsyny przy du

ym nadmiarze treoniny

(najlepsze rezultaty daje ester t-butylowy)
-oczyszczanie ludzkiej insuliny aby ograni-
czy

do minimum zawarto

ść

proinsuliny

-ostateczna foemulacja insuliny
Produkcja Novo Nordisk. Insulina jednoła

cuchowa SCI (single-chain insulin).
Alternatywnym sposobem biosyntezy
ludzkiej insuliny z wykorzystaniem

rekombinowanego DNA jest technologia
oparta o wytwarzane przez dro

e peptydy

des (B30) tzw insuliny jednoła

cuchowym i

jej transpeptydacja do insuliny ludzkiej. Do
komórek dro

y wprowadza si

gen

prekursora insuliny czyli peptydu des(B30).
Taki peptyd był ju

wcze

niej znany ponie-

powstał z insuliny

skiej pod

wpływem
trypsyny. Wykorzystano zatem wcze

niejsze

wiadczenia dotycz

ce jego

transpeptydacji w obecno

ci estru treoniny.

Najtrudniejszym etapem tego procesu jest
oczyszczanie produktu od zanieczyszcze

biologicznych a w szczególno

ci od obcych

białek.
Po dokonaniu poni

ej wymienionych

procesów oczyszczania otrzymuje si

insulin

o czysto

ci powy

ej 99,5%

Masa

Etap procesu

Wyd.

25500 kg

fermentacja

14300kg

Uzyskanie

ciałek inkluzyj-

nych

90%

6250kg

Chemiczne

konwersje

(ci

cie za

pomoc

CNBr,

tworzenie

mostków di

siarczkowych)

procesy

oczyszczania

60%

3000kg

Enzymatyczne

konwersje

90%

15kg

cowe

oczyszczanie,

jonowymienna

chromatografia

RPHPLC ,

filtracja

elowa,

ultrawirowanie,

krystalizacja

60%

Diagnostyka fenyloketonurii
Fenyloketonuria- choroba polegaj

ca na

zaburzeniu w przemianie aminokwasów
aromatycznych zwi

zana z niedoborem

hydrolazy fenyloalaninowej (PAH). Gen PAH
wyst

puje w jednej kopii i składa si

z 13

egzonów (eksonów) o długo

ci sumarycznej

2,3kpz i 12 intronów o długo

ci 85kpz.

Fenyloketonuria to wynik zmiany jednego
aminokwasu argininy na tryptofan jako wynik
pojedynczej mutacji (->T w egzonie 12-tym).
Gen PAH ulega ekspresji w w

trobie dlatego

nie mo

na do wykrycia fenyloketonurii

zastosowa

klasycznych metod diagnostyki

prenatalnej. Test wykonuje si

po urodzeniu.

Terapia zachowawcza (dieta uboga w
aminokwasy aromatycze) wprowadzona
zaraz po urodzeniu pozwala na unikni

cie

nieodwracalnych uszkodze

tkanki mózgo-

wej wywołanej toksycznymi produktami
niewła

ciwego metabolizmu fenyloalaniny.

W badaniach DNA członkowie rodzin
obci

ąż

onych fenyloketonuri

znaleziono

polimorfizm restrykcyjny obszaru genu PAH
dla o

miu enzymów restrykcyjnych m.in.

Msp I (u

ycie tego enzymu do analizy

pozwala na postawienie diagnozy z
98,5%pewno

)

SZCEPIONKI.