03 Biochemia bialka

Aminokwasy łączą się za pomocą wiązania peptydowego

Aminokwasy

Aminokwasy o niepolarnych, alifatycznych grupach bocznych

glicyna alanina walina

leucyna metionina izoleucyna

Niepolarne, aromatyczne grupy boczne

fenyloalanina tyrozyna tryptofan

Polarne, nienaładowane grupy boczne

seryna treonina cysteina

prolina asparagina glutamina

Dodatnio naładowane grupy boczne

lizyna arginina histydyna

Ujemnie naładowane grupy boczne

kwas asparaginowy kwas glutaminowy

cysteina + cysteina

→

cystyna

grupy tiolowe

mostek
disiarczkowy

Absorpcja w ultrafiolecie (280 nm): określanie stęŜenia białek

Miareczkowanie aminokwasu (kwasu glutaminowego)

Aminokwasy łączą się tworząc wiązanie peptydowe

N-koniec C-koniec

Peptyd zawiera N-koniec i C-koniec

Peptyd to polimer składający się z aminokwasów.

Aspartame (Nutrasweet®): słodzik

Właściwości niektórych białek:
masa cząsteczkowa 10 000 - 3 000 000;
ilość aminokwasów: 100 - 27 000.

Koniugaty białek

Struktura białek

pierwszorzędowa drugorzędowa trzeciorzędowa

czwartorzędowa

Struktura pierwszorzędowa: sekwencja aminokwasowa.
Struktura drugorzędowa: struktura łańcucha polipeptydowego (

αα

-helisa,

ββββ

- harmonijka).

Struktura trzeciorzędowa: ułoŜenie całego łańcucha polipeptydowego.
Struktura czwartorzędowa: ułoŜenie kilku łańcuchów polipeptydowych.

Rozdzielanie białek - chromatografia kolumnowa

roztwór

faza stała

eluent

Chromatografia jonowymienna

ładunek dodatni

ładunek ujemny

perełki z
ujemnymi
ładunkami

Chromatografia sita molekularnego

porowate
perełki

Chromatografia powinowactwa

białko

ligand

ligand związany

z polimerem

Elektroforeza: rozdział białek w Ŝelu poliakrylamidowym

Detergent:
siarczan dodecylu sodu (SDS) powoduje
denaturację białek.

Elektroforeza: kaŜde białko wędruje w postaci osobnego prąŜka

Elektroforeza: oznaczenie względnej masy cząsteczkowej

nieznane
białko

Log Mcz

względna migracja

Sekwencja białka pokrywa się z sekwencją DNA

białko

DNA (gen)

Spektometria masowa białek:

Matrix-Assisted Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI)

pole elektryczne

kapilara próbka

próŜnia

próbka

matryca

białko

detektor

jony najlŜejsze
docieraja jako pierwsze

próba białka
poddana jonizacji

źródło
jonów

laser uruchamia zegar

MALDI-TOF (Time Of Flight)

Małe peptydy moŜna syntezować chemicznie

R. Bruce Merrifiled otrzymał peptydy na nierozpuszczalnej matrycy
za pomocą 9-fluorenometoksykarbonylo- pochodnych aminokwasów)

Struktura białek

Łańcuch peptydowy: karbonylowy atom tlenu
i amidowy atom azotu tworzą mały dipol.

Generalna większość wiązań peptydowych występuje
w konfiguracji trans.

Wiązanie peptydowe ma charaktery wiązania podwójengo
i nie moŜe się obracać.

wiązania peptydowe

Drugorzędowa struktura białek : helisa

αα

Drugorzędowa struktura białek : helisa

αα

Helisa

αα

: zawsze prawoskrętna

lewoskrętna prawoskrętna

Dipol helisy

αα

Drugorzędowa struktura białek : harmonijka

ββββ

antyrównoległa

równoległa

Wiązania wodorowe między sąsiednimi
segmentami łańcuchów polipeptydowych

Drugorzędowa struktura białek : skręt

ββββ

Łączą końce 2 antyrównoległych segmentów

ββββ

-harmonijek

typI

typ II

Gly

helisa

αα

harmonijka

ββββ

skręt

ββββ

Prawdopodobieństwo udziału aminokwasów w danej strkuturze

Struktura drugorzędowa i właściwości białek fibrylarnych

Helisa

αα

: keratyna, składnik włosów i paznokci

Powstawanie loków

Kolagen: składnik ścięgien i chrząstek

Potrójna spirala: lewoskrętna, 3 reszty aminokwasowe na jeden obrót.
35% Gly, 11% Ala, 21% Pro i HyPro

To nie jest helisa

αα

reszty glicyny

Struktura włókien kolagenu

Kolagen (M.cz. 300 000 da)

Włókno kolagenu:
długość: 3000 A
średnica: 15 A

Gly-Xaa-Pro lub Gly-Xaa-HyPro

U ssaków wystepuje 30 rodzajów kolagenu.

Struktura kolagenu

łańcuchy

włókienka
kolagenu

włókna
kolagenu

cząsteczki kolagenu
(potrójne helisy)

Sieciowanie cząsteczek kolagenu: Lys, HyLys lub His

łańcuch
polipetydowy

Lys bez grupy

εεεε

-aminowej

(norleucyna)

HyLys

dehydroksylizynonorleucyna

Kolagen: białko strukturalne, występujące w największej ilości
(do 50% suchej masy). Istnieje 12 rodzajów kolagenu.
Kolageny są syntezowane przez fibroblasty i komórki nabłonka
w postaci prokolagenów.

Prokolageny mają dodatkowe 150 aminokwasów na N-końcu
i 250 aminokwasów na C-końcu. Dodatkowe domeny stabilizują
kolagen w czasie tworzenia potrójnej helisy.

Włókna kolagenu tworzą się w retikulum endoplazmatycznym
i w aparacie Golgiego. W aparcie Golgiego następuje modyfikacja
prolin i lizyn oraz O-glikozylacja.

Modyfikacja prolin i lizyn:
- hydroksylacja prolin
- hydroksylacja lizyn
- oksydacja lizyn (do aldehydów, tworzą następnie mostki

sieciujące łańcuchy)

oddziałuje z typem I i II

XII

chrząstki

300 nm

chrząstki

150 nm, C-koniec

globularny

chrząstki,

przewaŜnie z typem II

200 nm, N-koniec

globularny

komórki śródbłonka

VIII

śródbłonek

450 nm, dimer

VII

tkanki śródmiąŜszowe,

przewaŜnie z typem I

150 nm, N i C-

koniec globularny

tkanki śródmiąŜszowe,

przewaŜnie z typem I

390 nm,N-koniec

globularny

błony podstawowe

390 nm, C-koniec

globularny

skóra, mięśnie

300 x 67 nm

III

chrząstki, ciała szkliste

często z typem I

300 x 67 nm

skóra, ścięgna, kości

300 x 67 nm

lokalizacja

struktura

typ

Rodzaje kolagenów

Fibroblast produkujący kolagen na warstwie kolagenu

Injekcje kolagenu w celu upiększającym

przed po

Struktury genów kodujących prokolagen typu II (chrząstki, ciała szkliste)

i prokolagen typu I (skóra, ścięgna kości)

Oba geny zawierają 52 eksony, z tym Ŝe niektóre eksony mogą
być połączone.

Osteogenesis imperfecta
(wrodzona łamliwość kości)
jest wynikiem mutacji
w obrębie genów kodujących
prokolageny.

Objawy: samoistne złamania,
deformacja kości, niski wzrost,
zaburzone ząbkowanie,
błękitne twardówki.

Synteza prokolagenu moŜe być
obniŜona, lub powstający kolagen
moŜe mieć nieprawidłową
strukturę.

Przyczyną wrodzonej łamliwości kości moŜe być utrata eksonów
w genie kodującym prokolagen.

Istnieją typy wrodzonej łamliwości kości.
Typy I i IV dają łagodniejsze objawy niŜ typ II,
który powoduje śmierć w okresie niemowlęcym.

Integra



: dwuwarstowy system regeneracji skóry po oparzeniach

Składa się z 2 warstw: zewnętrzna to silikon, który chroni ranę.
Wewnętrzna warstwa to mieszanina bydlęcego
kolagenu i glikozaminoglikanów (siarczanu-6-chondroityny)
z chrząstki rekina.

Wewnętrzna warstwa umoŜliwia regenerację skóry działając
jak „rusztowanie”, podczas gdy zewnętrzna warstwa zabezpiecza
przed zakaŜeniem.

Glikozaminoglikany wchodzą w skład macierzy zewnątrzkomórkowej

Glikozaminoglikan powtarzająca się ilość disacharydów

jednostka

w łańcuchu

kwas hialuronowy

4-siarczan chondroityny

siarczan keratanu

słuŜy jako smar w stawach
nadaje konsystencję oku
wchodzi w skład ścięgien

wchodzi w skład chrząstek
i ścięgien

wchodzi w skład kości,
a takŜe rogów,kopyt i paznokci

Jak działa Integra



Dzień 0: oczyszczenie rany

Dzień 1: usunięcie martwej tkanki

Dzień 1: przyłoŜenie Integry

Dzień 14: utworzyła się naturalna skóra

Dzień 21: usunięcie silikonu

Dzień 21+: przeszczep naskórka

Dzień 25+: całkowita regeneracja skóry

autoprzeszczep skóry Integra



4-hydroksyprolina jest niezbędnym składnikiem kolagenu

RóŜnice w konformacji między proliną i 4-hydrokysproliną

4-hydroksyprolina powstaje w wyniku
działania hydroksylazy prolinowej

Askorbinian (witamina C) jest konieczny do hydroksylacji

reszt proliny w kolagenie

zawiera Fe

Enzym zawierający Fe

jest nieaktywny.

Askorbinian redukuje
Fe

, czyli działa jako

antyutleniacz.

Kwas askorbinowy (witamina C) jest niezbędnym elementem
ludzkiej diety. Tylko człowiek, małpy, świnki morskie i niektóre
nietoperze nie potrafią syntezować witaminy C.

Brak witaminy C powoduje szkorbut.

szkorbut

wypadanie
zębów

blada
skóra

zapadnięte
oczy

James Lind, szkocki lekarz, wykazał w 1753,
Ŝe sok z cytryny leczy szkorbut

H.M.S. Salisbury

Kapitan James Cook korzystał z badań Linda

H.M.S. Resolution

H.M.S. Discovery

H.M.S. Endeavour

Biosynteza kwasu askorbinowego u roślin

Albert Szent-Gyorgyi wyizolował witaminę C z papryki w roku 1928

Odkrył teŜ witaminę PP i wykazał, Ŝe ATP jest niezbędnym źródłem energii w mięśniach.
Nobel 1937.

Zawartość witaminy C w róŜnych owocach i roślinach

acerola

czarma
porzeczka

guava

papryka

owoce warzywa

zawartość
witaminy C
(mg/100g)

Acerola (Malpighia punicifolia; wiśnia z Barbados):

najwyŜsza zawartość witaminy C wśród roślin

Fibroina: składnik jedwabiu i nici pajęczych

antyrównoległe
harmonijki

ββββ

fibroina produkowana przez pająka

Białka w róŜnych konformacjach róŜnią się wielkością

Albumina (M.cz. 64 500): 585 reszt aminokwasowych

Mioglobina: pierwsze białko o znanej strukturze

Hem, obecny w mioglobinie, hemoglobinie, cytochromie

Pierścień protoporfirymowy
oraz jon Ŝelazawy (6 wiązań koordynacyjnych)
W hemoglobinie i mioglobinie
jedno z prostopadłych wiązań koordynacyjnych
jest wykorzystane przez atom N histydyny.
Drugie moŜe byc wykorzystane przez tlen.

Badanie struktury białek: krystalografia rentgenowska

źródło promieni
rentgenowskich

kryształ

wiązka promieni
rentgenowskich

promienie
rozproszone

detektor

Badanie struktury białek: krystalografia rentgenowska

3 zasady:

1. Elektrony powodują rozproszenie promieni rentgenowskich.

Amplituda fali rozproszonej przez dany atom jest proporcjonalna
do liczby jego elektronów.

2. Fale rozproszone nakładają się.

KaŜdy atom bierze udział w rozpraszaniu promieni.

Fale rozproszone w wyniku nakładamia się mogą ulegać
wzmocnieniu lub wygaszeniu, w zaleŜności od tego,
czy znajdują się w jednakowej, czy tez róŜnej fazie.

3. Sposób nakładania się fal zalezy od rozkładu przestrzennego atomów.

Badanie trójwymiarowej struktury białek:
dyfrakcja promieni rentgenowskich

Wycinek mapy gęstości elektronowej mioglobiny

Magnetyczny rezonans jądrowy

energia

natęŜęnie pola magnetyczego

rozdzielenie
energii (

∆∆∆∆

przejście między
stanami spinowymi
daje linię NMR

napromieniowanie

Biologicznie waŜne jądra atomów dające sygnał NMR

jądro

występowanie izotopu
w przyrodzie
(% wagowy w puli
pierwiastka)

Magnetyczny rezonans jądrowy: alkohol etylowy

intensywność

przesunięcie chemiczne (ppm)

jądro znajdujące się w róŜnych
środowiskach zmienia stany
przy róŜniących się siłach pól

Magnetyczny rezonans jądrowy: 55-aminokwasowy peptyd

Jadrowy efekt Overhausera identyfikuje pary protonów znajdujące
się w bliskim sąsiedztwie

Struktura określona na podstawie obliczeń uzyskanych z widma NMR

Zestaw 25 struktur złoŜonych z 28-aminokwasowej
domeny palca cynkowego

przeciętne ułoŜenie
szkieletu białka

Magnetyczny rezonans jądrowy

Trójwymiarowa struktura niektórych małych białek

Udział rodzajów struktur w róŜnych białkach

Niektóre często występujące połączenia struktur

Połączenia harmonijek w strukturze składającej sie wyłącznie z harmonijek

ββββ

skrzyŜowane (nigdy niespotykane)

typowe

Struktura baryłki

ββββ

- wiele harmonijek

ββββ

przeciwciało

DuŜe motywy strukturalne powstają z małych motywów

Struktury wyłącznie

αα

Struktury wyłącznie

ββββ

Struktury

αα

ββββ

(

αα

ββββ

są wymieszane)

Struktury

αα

ββββ

(

αα

ββββ

są rozdzielone)

Struktura czwartorzędowa:
opisuje, z ilu podjednostek składa się białko

Deoksyhemoglobina (cztery podjednostki)

Max Perutz i John Kendrew określili strukturę hemoglobiny w roku 1959

Denaturacja białek

temperatura [°C] chlorowodorek guanidyny [M]

Symulacja fałdowania białka

Priony - białka, które mogą powodować nieprawidłowe fałdowanie

innych białek

Wycinek mózgu pacjenta zmarłego na chorobę Creutzfelda-Jakoba
(gąbczaste zwyrodnienie mózgu)

Białko PrP

: normalny składnik mózgu

Białko PrP

: zmieniona konformacja, przyczyna choroby

PrP

dimer PrP

druga podjednostka

zmiana konformacji:

Priony

Białka opiekuńcze (szaperony) nadzorują prawidłowe fałdowanie

Rola białek opiekuńczych w fałdowaniu białek

03. Biochemia - białka

Tematy do zapamiętania

1. Aminokwasy: struktura i funkcja.
2. Aminokwasy: alifatyczne, polarne, zasadowe, kwaśne.
3. Wiązanie peptydowe.
4. Białka: struktura pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędowa.
5. Chomatografia i elektroforeza.
6. Drugorzędowa struktura białek: helisa

αα

i harmonijka

ββββ

7. Keratyna: struktura i funkcja.
8. Kolagen: struktura i funkcja.
9. Rola witaminy C.