UNIWERSYTET ROLNICZY IM. HUGONA KOŁŁĄTAJA W KRAKOWIE
WYDZIAŁ TECHNOLOGII śYWNOŚCI
Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych
ĆWICZENIE 4
OCENA WARTOŚCI ODśYWCZEJ I ZDROWOTNEJ
MLECZNYCH NAPOJÓW FERMENTOWANYCH
Studia stacjonarne I stopnia – rok III, semestr V
Przedmiot: Mleko i Przetwory Mleczarskie w śywieniu Człowieka
2
Mleczne napoje fermentowane
Fermentacja mlekowa jest jedną z najstarszych i najbardziej rozpowszechnionych na
ś
wiecie metod utrwalania mleka. W przeszłości metoda ta była wyłącznie stosowana w
gospodarstwach domowych do utrwalania mleka róŜnych ssaków, a umiejętność wytwarzania
produktów fermentowanych przenoszono z pokolenia na pokolenie.
Na świecie znanych jest ponad 400 róŜnych produktów, które moŜna zaliczyć do
rodziny mlecznych napojów fermentowanych, dlatego ich klasyfikacja jest niezwykle trudna.
Podstawowym kryterium podziału jest rodzaj mikroflory stosowanej do produkcji mlecznych
napojów fermentowanych, który ma swoje tradycje wynikające z naturalnej, trwającej przez
wieki selekcji mikroflory, zaleŜnej przede wszystkim od warunków klimatycznych. W
krajach o ciepłym klimacie wyselekcjonowała się mikroflora termofilna, która po
wyizolowaniu umoŜliwia produkcję takich wyrobów jak np. jogurt. Z kolei w krajach o
umiarkowanym lub zimnym klimacie mleko ukwaszano mezofilnymi bakteriami fermentacji
mlekowej, które są stosowane do produkcji min. maślanki i zsiadłego mleka.
Produktem uzyskanym w wyniku fermentacji mieszanej, mlekowo-alkoholowej jest
kefir, który tradycyjnie przygotowany jest przy uŜyciu grzybków kefirowych, będących
symbiotycznym tworem bakterii fermentacji mlekowej i droŜdŜy.
Mleczne napoje fermentowane są takŜe uzyskiwane w wyniku aktywności bakterii
fermentacji mlekowej i pleśni, jak np. viili.
Kolejna grupa to produkty probiotyczne, czyli mleka fermentowane przez
wyselekcjonowaną mikroflorę jelitową, naturalnie bytującą w przewodzie pokarmowym
człowieka. Probiotyki są definiowane jako pojedyncze lub mieszane Ŝywe kultury
mikroorganizmów, które podawane człowiekowi lub zwierzętom wywierają na ich organizmy
korzystny wpływ, zapewniając właściwą równowagę mikroflory zasiedlającej organizm.
WaŜne, Ŝe organizmy te muszą być zidentyfikowane co do szczepu, muszą być odpowiednio
liczne (10
6
jtk/1 ml lub g) oraz aktywne do końca okresu przydatności do spoŜycia.
Zazwyczaj do grupy tej zalicza się szczepy bakterii z rodzaju Bifidobacterium oraz
Lactobacillus. Aby mogły spełniać swoją terapeutyczną rolę muszą być równieŜ spoŜywane
regularnie w odpowiedniej ilości (co najmniej 100g dziennie jogurtu zawierającego szczepy
probiotyczne).
Przykład oznakowania szczepu probiotycznego:
Lactobacillus acidophilus LA5 (rodzaj – gatunek – szczep)
Obecnie często do produkcji mlecznych napojów fermentowanych stosuje się
mieszaninę tradycyjnych bakterii fermentacji mlekowej i bakterii probiotycznych. Mleka
takie noszą róŜne nazwy w zaleŜności od składu zakwasu czystych kultur, jak np.: biojogurt,
bifigurt. Producenci takich napojów nadają teŜ zastrzeŜone nazwy handlowe jak np. Yakult
,
Actimel
®
, Activia
i Benefit
®
.
Pod względem metody produkcji mleczne napoje fermentowane moŜna podzielić na
napoje wytwarzane metodą zbiornikową (tzw. mieszane) i termostatową (tzw. stałe),
natomiast w zaleŜności od formy występowania moŜna je podzielić na napoje o zwiększonej
zawartości suchej masy, np. pasty i proszki, płynne i zestalone, np. mroŜone i Ŝele.
Zgodnie z definicją Komisji Kodeksu śywnościowego, Światowej Organizacji Zdrowia
(WHO) i Międzynarodowej Federacji Mleczarskiej (FIL/IDF) z 1997r., mleczne napoje
fermentowane są produktami otrzymanymi z mleka w wyniku działania specyficznej
mikroflory powodującej obniŜenie pH i koagulację mleka. Zastosowane specyficzne
mikroorganizmy muszą być Ŝywe, liczne i aktywne takŜe w końcowym okresie przydatności
3
do spoŜycia. Wymienione organizacje ustaliły, Ŝe tradycyjne nazwy mlecznych napojów
fermentowanych są zastrzeŜone dla wyrobów zawierających specyficzną mikroflorę w
określonej liczbie. Oznacza to, Ŝe dla napojów produkowanych z udziałem mikroorganizmów
innych niŜ te zastrzeŜone nie mogą być stosowane nazwy tradycyjne. Jeśli np. przy produkcji
jogurtu uŜywa się innych niŜ tradycyjne mikroorganizmów np. bifidobakteri i/lub
Lactobacillus acidophilus, producenci mają w takich przypadkach obowiązek podawania na
opakowaniu składu zastosowanej mikroflory.
Nazwy i określenia róŜnych mlecznych napojów fermentowanych:
Mleko fermentowane (wg. PN-A-86061:2002) – produkt otrzymany w wyniku fermentacji
mleka i/lub innych surowców pochodzenia mlecznego z uŜyciem odpowiedniej mikroflory,
która powoduje obniŜenie pH i/lub koagulację mleka; z dodatkiem lub bez dodatku nie więcej
niŜ 30% (m/m) niemlecznych składników smakowych i/lub aromatów; o zwiększonej lub nie
zwiększonej zawartości suchej masy.
Do mleka fermentowanego smakowego stosuje się następujące dodatki:
-
sacharozę i inne cukry (fruktoza, syrop glukozowy, miód),
-
składniki, takie jak owoce, przetwory owocowe, owoce suszone, warzywa, soki,
przeciery, pulpy, ziarna zbóŜ, czekolada, orzechy, kawa, kakao i inne przetwory
spoŜywcze.
Oraz wyłącznie do mleka fermentowanego smakowego i mleka fermentowanego
poddanego obróbce cieplnej:
-
Ŝ
elatynę i skrobię.
Mleko ukwaszone – napój z mleka znormalizowanego poddanego pasteryzacji, ukwaszonego
zakwasem czystych kultur maślarskich: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp.
cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides ssp.
cremoris.
Mleko acidofilne - napój z mleka znormalizowanego lub odtłuszczonego, pasteryzowanego,
ukwaszonego zakwasem czystych kultur Lactobacillus acidophilus.
Kefir - napój z mleka pasteryzowanego, znormalizowanego poddanego fermentacji mlekowo-
alkoholowej przez dodanie zakwasu z grzybków kefirowych. Grzybki kefirowe są zoogleą
(zlepieńcem) bakterii fermentacji mlekowej (Lactobacillus spp., Lactococcus spp.,
Leuconostoc spp.), droŜdŜy (Saccharomyces spp., Kluyveromyces spp., Candida spp.), a takŜe
bakterii octowych (Acetobacter aceti), które tworzą układ symbiotyczny. Ziarna tworzą
uporządkowaną strukturę, w której środku znajdują się komórki droŜdŜy, a w warstwach
zewnętrznych ziarniaki, paciorkowce i pałeczki.
Jogurt - napój z mleka znormalizowanego, zgęszczonego przez dodatek odtłuszczonego
mleka w proszku lub odparowanie części wody, poddanego pasteryzacji, a następnie
ukwaszonego zakwasem czystych kultur bakterii z grupy Streptococcus thermophilus i
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.
Jogurt o zmienionej mikroflorze – mleko fermentowane zawierające charakterystyczne
kultury Streptococcus thermophilus i dowolne kultury Lactobacillus inne niŜ Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus.
4
Maślanka – napój uzyskany przy wyrobie masła ze śmietany pasteryzowanej i ukwaszonej
zakwasem czystych kultur maślarskich, bez dodatku wody, nienormalizowany lub o
określonej zawartości tłuszczu, maślanka moŜe być takŜe produkowana z dodatkiem mleka
odtłuszczonego, pasteryzowanego i zakwasu czystych kultur bakterii kwasu mlekowego, w
skład których wchodzą: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris,
Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris.
Pod względem metody produkcji mleczne napoje fermentowane moŜna podzielić na
napoje wytwarzane metodą zbiornikową – tzw. mieszane, w których wytworzony w zbiorniku
skrzep poddaje się mieszaniu i napełnianiu opakowań jednostkowych i termostatową – tzw.
stałe, które inkubuje się w opakowaniach jednostkowych, dzięki czemu wytworzony skrzep
nie jest poddawany obróbce mechanicznej i ma charakter Ŝelu.
W zaleŜności od formy występowania mleczne napoje fermentowane moŜna podzielić
na: napoje płynne i półpłynne (np. jogurty mieszane); o zwiększonej po procesie fermentacji
zawartości suchej masy (np. pasty i proszki); zestalone (mroŜone i Ŝele).
Podstawowym procesem zachodzącym podczas produkcji mlecznych napojów
fermentowanych jest fermentacja mlekowa, aczasem takŜe fermentacja alkoholowa. Procesy
te zachodzące w warunkach beztlenowych, polegaja na enzymatycznej przemianie
węglowodanów do kwasu mlekowego, etanolu, kwasu octowego, kwasu mrówkowego i
dwutlenku węgla oraz uwolnienia energii potrzebnej do procesów Ŝyciowych komórek
bakterii. Fermentacja mlekowa moŜe mieć postać:
- homofermentacji – kwas mlekowy stanowi 85% wszystkich metabolitów,
- heterofermentacji – kwas mlekowy stanowi 50% wszystkich metabolitów, ponadto
powstają takŜe kwas octowy, etanol oraz dwutlenek węgla.
Kwas mlekowy występuje w róŜnych formach izomerycznych: L(+) i D(-) oraz
racemicznej DL. Proporcje poszczególnych form tego kwasu są zmienne i zaleŜą od rodzaju
substratu i mikroorganizmów, a takŜe przy stałym składzie mikroorganizmów, od parametrów
procesu fermentacji oraz warunków przechowywania produktu. Forma kwasu D(-) jest
znacznie wolniej absorbowana z jelit niŜ forma L(+). Dzięki temu kwas D(-) moŜe
przechodzić w znacznych ilościach do jelita grubego, zakwaszając jego treść i hamując tym
samym rozwój bakterii chorobotwórczych i toksynotwórczych. Wg WHO spoŜycie formy
D(-) nie powinno być większe niŜ 100 mg na 1 kg masy ciała.
Fermentacja cytrynianów - bakterie Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis i
Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris mają zdolność fermentacji cytrynianów zawartych
w mleku do diacetylu – podstawowego związku kształtującego aromat masła, śmietany,
maślanki i innych napojów fermentowanych. W zaleŜności od uzdolnień mikroorganizmów,
dwuacetyl moŜe gromadzić się w ilościach nawet do kilkunastu mg w dm
3
.
Fermentacja alkoholowa – zachodzi w kefirze i kumysie. Prowadzona przez droŜdŜe, które
moŜna podzielić na fermentujące laktozę – Candida kefir, Kluyveromyces marxianus var.
marxianus oraz droŜdŜe nie fermentujące laktozy – Sacharomyces cerevisiae i Sac.
unisporus. Zawartość alkoholu etylowego zarówno w kefirze, jak i kumysie jest zmienna i
zaleŜy od czasu dojrzewania. Zawartość etanolu w kefirze moŜe wahać się od 0,1% do ponad
1%, a w kumysie od 1% do 3,5%.
5
Tworzenie związków aromatycznych.
Mikroorganizmy stosowane do produkcji mlecznych napojów fermentowanych
wytwarzają związki nadające napojom specyficzny aromat. Do najwaŜniejszych związków
będących produktami metabolizmu bakterii fermentacji mlekowej naleŜy zaliczyć: kwas
mlekowy, aldehyd octowy, dwuacetyl, kwas octowy i alkohol etylowy. Oprócz tych
związków wytwarzane są w mniejszych ilościach równieŜ inne substancje, takie jak: lotne
kwasy (mrówkowy, propionowy), aceton, alkohole i estry.
Kwas mlekowy jest głównym produktem we wszystkich napojach (0,5-1,5%), w
których zachodzi fermentacja i wywiera istotny wpływ na smak i zapach napojów. Dwuacetyl
(0-15 mg/dm
3
) jest produktem powstającym głównie w wyniku fermentacji cytrynianów.
Najwięcej dwuacetylu jest w napojach zawierających bakterie Lactococcus lactis ssp. lactis
var. diacetylactis i Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, naleŜą do nich maślanka,
ś
mietana czy kwaśne mleko. W przypadku jogurtu i produktów pochodnych, głównym
składnikiem aromatu jest aldehyd octowy (0-40 mg/dm
3
), który powstaje w wyniku
metabolizmu węglowodanów. Spośród bakterii jogurtowych, pałeczki Lactobacillus
delbruecki ssp. bulgaricus wytwarzają więcej tego związku niŜ ziarniaki Streptococcus
thermophilus. Nadmiar aldehydu octowego jest niepoŜądany podczas produkcji śmietany,
maślanki, mleka ukwaszonego, gdyŜ nadaje im posmak trawiasty. W przypadku napojów
otrzymanych na bazie fermentacji alkoholowej (kefir, kumys) znaczny udział w kształtowaniu
smaku ma alkohol etylowy (0-3%). Do związków współtworzących bukiet smakowo-
zapachowy napojów fermentowanych zaliczyć moŜna takŜe lotne kwasy, takie jak: octowy,
propionowy, mrówkowy, masłowy, izowalerianowy, kapronowy, kaprylowy i kaprynowy
oraz aminokwasy i inne związki powstałe wskutek degradacji białek, tłuszczu i laktozy.
Wymagania chemiczne i dla charakterystycznej mikroflory według PN-A-86061:2002
„Mleko i przetwory mleczne. Mleko fermentowane.”:
Mleko fermentowane
Wymagania
Jogurt
Jogurt o
zmienionej
mikroflorze
Mleko
acidofilne
Kefir
Maślanka
Inne
(zawierające
charakterysty
-czną
mikroflorę
np.
probiotyczną)
Mleko
fermento-
wane
poddane
obróbce
cieplnej
Zawartość białka,
% wag. nie mniej
niŜ:
-mleko
fermentowane
- mleko ferm. o
zwiększonej
zawartości s.m.
2,7
5,6
Zaw. tłuszczu, %
wag.
Zgodnie z deklaracją producenta, jednak poniŜej 10%
Kwasowość
miareczkowa, %
kw. mlekowego,
nie mniej niŜ:
0,6
0,3
0,6
Liczba
charakterystycznej
mikroflory, w 1 g,
nie mniej niŜ
łącznie 10
7
w tym L.
delbrueckii
ssp.
bulgaricus
10
6
nie
normalizuje
się
nie
normalizuje
się
nie
normalizuje
się
nie
normalizuje
się
nie
normalizuje
się
-
Liczba droŜdŜy w
1g, nie mniej niŜ:
-
-
-
10
2
-
-
-
6
WYKONANIE
1.
Ocena organoleptyczna:
a.
sprawdzanie jakości opakowania – opakowanie jednostkowe naleŜy ocenić pod
względem wyglądu, prawidłowości zamknięć oraz oznakowania,
b.
określenie zapachu – określanie zapachu naleŜy przeprowadzić bezpośrednio po
otwarciu opakowania, czynność tę powtórzyć po wymieszaniu produktu,
c.
określanie wyglądu, barwy i konsystencji – płytkę Petriego postawić na kartce białego
papieru, pobrać łyŜeczką próbkę napoju i wzrokowo określić jego barwę i
konsystencję, wylewając zawartość łyŜeczki na płytkę,
d.
określenie smaku.
2.
Przygotowanie próbki do oznaczeń.
Próbkę napoju mlecznego doprowadzić do temperatury 20
°
C i dokładnie wymieszać. W
przypadku stwierdzenia warstwy śmietany lub grudek masła próbkę napoju podgrzać powoli
w łaźni wodnej do temperatury 30-32
°
C, następnie dokładnie wymieszać i oziębić do temp.
20
°
C. W wypadku napojów z dodatkiem owoców część dokładnie wymieszanej próbki
przeznaczoną do oceny zawartości tłuszczu przecedzić przez gazę lub sito w celu oddzielenia
części stałych. Przygotowaną próbkę naleŜy dokładnie wymieszać przed kaŜdorazowym
pobraniem do poszczególnych oznaczeń.
3.
Oznaczenie zawartość tłuszczu metodą Gerbera.
Do kolby miarowej o pojemności 50 cm
3
odwaŜyć 45 g napoju z dokładnością do 0,01 g.
Kolbę uzupełnić do kreski 3% roztworem amoniaku. Po uzupełnieniu zawartość dokładnie
wymieszać przez odwracanie kolby. Następnie próbkę pozostawić na 30-40 minut często
mieszając w celu rozpuszczenia się grudek Ŝelu.
Do tłuszczomierza Gerbera odmierzyć 10 cm
3
kwasu siarkowego (d=1,815g/cm
3
) i 11 cm
3
rozcieńczonej próbki napoju mlecznego, wlewając ostroŜnie po ściance tłuszczomierza.
Następnie dodać 1 cm
3
alkoholu amylowego. Tłuszczomierz zakorkować i po dokładnym
wymieszaniu zawartości przez odwracanie tłuszczomierza wstawić do łaźni wodnej o
temperaturze 65
°
C na około 15 minut. W czasie ogrzewania mieszać od czasu do czasu
zawartość tłuszczomierza aŜ do całkowitego rozpuszczenia białka. Tłuszczomierz wyjąć z
łaźni wodnej i wirować w wirówce przez 5 minut. Po odwirowaniu umieścić tłuszczomierz w
łaźni wodnej o temp. 65
°
C na 5 minut. Napoje zawierające powyŜej 12% suchej masy, a takŜe
wszystkie napoje poddane procesowi homogenizacji podlegają 2-krotnemu wirowaniu. Wyjąć
tłuszczomierz z łaźni i ostroŜnie za pomocą korka uregulować dolny poziom słupka tłuszczu
do najbliŜszej podziałki oznaczonej liczbą. UwaŜając aby słupek tłuszczu nie przesuwał się,
dokonać odczytu dolnego poziomu słupka tłuszczu oraz górnego poziomu słupka tłuszczu wg
menisku dolnego z dokładnością do 0,05%. RóŜnica między dwoma odczytami stanowi
zawartość tłuszczu. Wynik oznaczania obliczyć ze wzoru:
w którym a – zawartość tłuszczu odczytana na skali tłuszczomierza
111
,
1
11
45
50
11
⋅
=
⋅
⋅
⋅
=
a
a
X
7
4.
Oznaczenie zawartości suchej masy metodą suszenia w temp. 130
°°°°
C.
Do naczyńka wagowego wsypać około 30 g piasku, włoŜyć pręcik szklany, wstawić
do suszarki i suszyć w temp. 130
°
C przez 30 min po czym ostudzić w eksykatorze i
zwaŜyć z dokładnością do 0,01 g. Do naczyńka przenieść ok. 4 g napoju zawierającego do
12% suchej masy lub 3 g napoju zawierającego powyŜej 12% suchej masy. Następnie
naczyńko zwaŜyć z dokł.
±
0,01 g. Zawartość naczyńka dokładnie wymieszać pręcikiem
szklanym po czym wstawić do suszarki w temp. 130
°
C na 30 min. Następnie ostudzić w
eksykatorze i zwaŜyć z dokładnością do 0,01 g. Wynik obliczyć wg wzoru:
w którym:
a – masa naczyńka z piaskiem i pręcikiem szklanym, g.
b – masa naczyńka z piaskiem i pręcikiem szklanym i napojem mlecznym przed
suszeniem, g.
c – masa naczyńka z piaskiem i pręcikiem szklanym i napojem mlecznym po wysuszeniu,
g.
5.
Wyliczenie zawartości suchej masy beztłuszczowej.
6.
Oznaczenie kwasowości miareczkowej.
Do kolby stoŜkowej odmierzyć pipetą 25 cm
3
napoju mlecznego. Pipetę popukać
wodą destylowaną z drugiej pipety w ilości 25 cm
3
. Dokładnie wymieszać zawartość
kolby, dodać 1 cm
3
roztworu fenoloftaleiny i miareczkować roztworem 0,25 M NaOH do
otrzymania lekko róŜowego zabarwienia utrzymującego się przez 30s. Wynik podać w
stopniach % kwasu mlekowego. Przelicznik ze
°
SH (wynik miareczkowania razy cztery)
na % kwasu mlekowego wynosi 0,0225.
7.
Oznaczenie pH.
Wyjąć ostroŜnie elektrodę pH-metru z kolby z nasyconym roztworem KCl, popłukać
ją wodą destylowaną po czym zanurzyć w próbce napoju. Po ustabilizowaniu się wskazań
dokonać odczytu wartości pH. Następnie ponownie popłukać elektrodę wodą destylowaną
i umieścić ją w kolbie z nas. roztworem KCl.
8.
Oznaczenie aktywności przeciwutleniającej – metoda z rodnikiem DPPH
••••
.
DPPH
••••
jest jednym z bardziej stabilnych i powszechnie dostępnych organicznych
rodników azowych. Roztwory charakteryzują się
purpurową barwą oraz maksimum absorbancji w
zakresie UV-Vis przy długości fali 515 nm. W trakcie
redukcji odbarwia się co moŜe być kontrolowane
spektrofotometrycznie. Zazwyczaj analiza przebiega
następująco: 3.9 ml metanolowego r-ru DPPH (25 mg/l)
miesza się z 0.1 ml próbki i obserwuje zmianę
absorbancji przy długości fali 515 nm w czasie 30 min.
lub do ustabilizowania się wartości absorbancji.
a
b
a
c
X
−
⋅
−
=
100
)
(
DPPH
••••
- 2,2-dwufenylo-1-pikrylohydrazyl
(DPPH)
8
%
pozostałego
DPPH
jest
odwrotnie
proporcjonalny
do
stęŜenia
związków
przeciwutleniających obecnych w próbce, a stęŜenie które powoduje obniŜenie zawartości
DPPH o połowę jest definiowane jako EC
50
.
Wykonanie:
W oznaczeniu wymieszać 0,10g
±
0,01 g próbki właściwej (napoje naturalne bez
rozcieńczenia, jogurty z dodatkami rozcieńczyć 10-krotnie metanolem tj. nawaŜyć 1 g jogurtu
i dopełnić metanolem do 10 g), lub próby ślepej (metanol) z 3.9 ml mieszaniny reakcyjnej w
probówkach wirówkowych. Próby właściwe oraz próbę ślepą pozostawić do przereagowania
na 1 godz. w temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Próby właściwe (z jogurtem) przed
pomiarem absorbancji odwirować (4000 obr/min, 5 min.). Następnie zmierzyć absorbancję
płynu znad osadu przy długości fali
λ
=515 nm. Ilość próbki wymaganą do redukcji stęŜenia
DPPH o 50% określa się jako EC
50
. Pojemność antyoksydacyjną podać jako ARP (Anti
Radical Power), odwrotność EC
50
(1/ EC
50
) i wyrazić względem ARP Troloksu
(rozpuszczalny w wodzie analog witaminy E) jako
µ
mol TE/g próbki ze wzoru:
100
50
)
1
(
0509
,
0
×
⋅
−
⋅
=
m
A
A
ARP
S
W
Gdzie:
0,0509 – ARP Troloksu,
A
w
– absorbancja próby właściwej;
A
s
– absorbancja próby ślepej;
m – nawaŜka jogurtu [g] (0,1 g – jogurt naturalny, 0,01 – jogurt z dodatkami).