PRIMER EXTENSION.
Technikę wydłużania startera (ang. primer extension) wykonujemy w celu ustalenia dokładnego miejsca startu transkrypcji
badanego genu. Aby wykonać ten test musimy posiadać następujące dane:
1. Przybliżona pozycja 5’ końca transkryptu. Obszar ten można zidentyfikować porównując sekwencję genomową ze
znanymi sekwencjami cDNA danego genu. Należy pamiętać o tym, że sklonowane sekwencje cDNA na ogół nie zawierają
pełnej sekwencji początkowej transkryptu.
2. Z oryginalnego materiału biologicznego, w którym dochodzi do ekspresji danego genu, należy wyizolować całkowity
RNA, który posłuży jako matryca do reakcji wydłużania startera.
Test primer extension wykonujemy w następujących etapach:
1. Przygotowanie startera. Opierając się na znanej sekwencji genomowej, obejmującej obszar 5’ końca genu, należy
przygotować starter, czyli oligonukleotyd który będzie homologiczny zarówno do mRNA jak i do sekwencji genomowej
danego genu (Rys.1). Starter powinien znajdować się w odległości ok. 50-500 pz poniżej przypuszczalnego miejsca startu
transkrypcji.
nić kodująca
nić matrycowa
mRNA
3’
5’
3’
5’
starter
starter
start transkrypcji
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Rys.1
2. Wydłużenie startera. Do mieszaniny reakcyjnej, zawierającej całkowity RNA, dodajemy starter, który zwiąże się z
sekwencją określonego mRNA. Dimer ten jest następnie rozpoznawany przez odwrotną transkryptazę, która do 3’ końca
startera przyłącza nukleotydy tworząc cząsteczkę cDNA, którego długość odpowiada odległości od miejsca związania
startera do 5’ końca cząsteczki RNA (Rys.2). Reakcję tę nazywamy wydłużaniem startera (ang. primer extension).
Powstała w ten sposób cząsteczka cDNA musi posiadać znacznik radioaktywny. W tym celu do startera należy uprzednio
przyłączyć radioaktywny izotop
32
P (przy udziale kinazy polinukleotydowej), lub do reakcji wydłużania należy dodać
radioaktywne nukleotydy, które zostają włączone do powstającej nici cDNA.
3. Rozdział na żelu. Produkt reakcji wydłużania startera należy poddać denaturacji w celu oddzielenia produktu cDNA od
matrycy RNA i rozdzielić w denaturującym żelu poliakryloamidowym. Do sąsiednich kieszonek należy nałożyć marker
mas cząsteczkowych, którym w tym przypadku mogą być produkty reakcji sekwencjonowania DNA badanego genu,
uzyskane z wykorzystaniem tego samego startera. Po rozdziale dokonujemy ekspozycji żelu na błonę radiologiczną.
4.
Interpretacja wyniku. W celu ustalenia miejsca startu transkrypcji należy odczytać z radiogramu wielkość produktu
reakcji wydłużania startera. Wielkość ta odpowiada odległości od znanej pozycji startera do miejsca startu transkrypcji.
Długość ta, po odniesieniu do znanej sekwencji genomowej, umożliwia identyfikację pozycji startu transkrypcji badanego
genu.
120 z
RNA
genomowy DNA
reakcja primer extension
reakcja
sekwencjonowania
sklonowany fragment
genomowego DNA
accGTTGC
...
GTTGC
...
start
transkrypcji
starter
starter
G
G
C
T
A
120 z
Rys.2