Slajd 1

Metody barwienia i różnicowania komórek

•

Barwienie preparatów mikroskopowych:

•

Barwienie preparatów hematologicznych

•

Barwienie preparatów mikrobiologicznych

•

Immunohistochemia

Metody barwienia i różnicowania komórek

• Barwienie komórek
  organelle znajdujące się
  w komórkach identyfikuje
  się używając różnorodnych
  pigmentów i barwników.

• Za pomocą technik barwienia
  można zabarwić
  i zaobserwować większość
  dużych organelli
  komórkowych.

Metody barwienia i różnicowania komórek

• Standardowa technika barwienia metodą
eozyna – hematoksylina

• Eozyna jest kwaśnym barwnikiem, który wykazuje

powinowactwo chemiczne z białkami cytoplazmy.

Zabarwia głównie cytoplazmę, zabarwione w ten sposób

struktury nazywane są acidofilnymi lub eozynofilnymi.

• Hematoksylina to podstawowy barwnik który wykazuje

powinowactwo z rybonukleoproteinami jądra. Barwi głównie

jądro a zabarwione struktury nazywane są bazofilnymi.

Barwienie i różnicowanie komórek

• Istnieje również wiele innych sposobów barwienia, które

używane są do wizualizacji poszczególnych tkanek.

• Krew obwodowa i szpik kostny barwione są techniką

May – Grünwald – Giemsy, która rozróżnia wszystkie typy

komórek i ich poszczególne elementy np. różne ziarna

w granulocytach.

Barwienie preparatów hematologicznych

• Wykonuje się w celu oceny morfologii leukocytów,
     erytrocytów i płytek krwi.
• Rozmaz wykonuje się na szkiełkach podstawowych z krwi
   wersenianowej żylnej lub włośniczkowej ( jednak nie później
   niż 2h od pobrania )

Wykonywanie

rozmazu z krwi obwodowej

•

Krew wersenianową dokładnie,

ale delikatnie wymieszać;

•

Nanieść niewielką kroplę krwi na

szkiełko podstawowe ok.1 cm od
brzegu.

•

Powyżej kropli oprzeć rozmazówkę na

szkiełku podstawowym przysunąć

rozmazówkę do kropli krwi tak aby, cała

krew równomiernie rozmieściła się

między szkiełkami.

•

Jednym, zdecydowanym ruchem,

bez dociskania, rozprowadzić krew

utrzymując kąt między szkiełkami

ok. 45°

Wykonywanie

rozmazu z krwi obwodowej

•  Natychmiast suszyć rozmaz poprzez wykonanie kilku
     szybkich ruchów rozmazem w powietrzu
     - faza szybkiego suszenia.
• Podpisać rozmaz zwykłym ołówkiem w jego najgrubszej
     części: Imię i nazwisko pacjenta, ewentualnie data
     i numer badania.
• Pozostawić rozmaz na powietrzu w temperaturze
     pokojowej na ok. 1h – faza wolnego suszenia.
• W ten sam sposób wykonać drugi preparat dla tego
     samego pacjenta – preparat rezerwowy w razie
     niepowodzenia w barwieniu.

Prawidłowo wykonany rozmaz:

Ma barwę żółtoróżową

Jest coraz cieńszy ku końcowi

Ma jednolitą powierzchnię bez smug, „schodków”

i dziur

Ma odpowiednią grubość, nie jest zbyt cienki, ani

zbyt gruby; w zbyt grubym rozmazie trudno

różnicować komórki (szczególnie blastyczne)

Ma długość ok. 3 – 4 cm i sięga do 2/3 długości

szkiełka

Brzegi rozmazu nie dochodzą do brzegów szkiełka

podstawowego

Zakończony jest tzw.: „brodą”

Barwienie rozmazów

•

Najczęściej stosowaną - jest metoda z użyciem

dwóch barwników: May-Grünwalda i Giemsy.

• W skład barwników wchodzą:
   May-Grünwalda – błękit metylenowy, eozyna, metanol,

Giemsy – błękit metylenowy, eozyna, azur

• Do barwienia stosuje się nierozcieńczony barwnik
May-Grünwalda dzięki czemu preparat nie musi być

utrwalany (gdyż w skład barwnika wchodzi alkohol

metylenowy)

Barwienie rozmazów

• Eozyna jest barwnikiem kwaśnym, który barwi

zasadowe struktury komórkowe (hemoglobina,
ziarnistości granulocytów kwasochłonnych).

• Azur i błękit metylenowy to barwniki zasadowe,

barwiące kwaśne struktury komórkowe (kwasy
nukleinowe, białka jądra komórkowego, ziarnistości).

Ogólny schemat barwienia: metodą MGG

• Wysuszony preparat należy barwić zgodnie z instrukcją

podaną przez producenta barwników.

Zalać preparat barwnikiem May-Grünwalda na 3-5 min.

Spłukać wodą destylowaną lub wodociągową

Zalać preparat rozcieńczonym barwnikiem Giemsy na

13-15 min.

Spłukać wodą destylowaną lub wodociągową

Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze

pokojowej

• Odczynnik Giemsy bezpośrednio przed użyciem należy

rozcieńczyć buforem fosforanowym o pH 6.8 lub wodą

destylowana w stosunku 1 część barwnika do 9 części buforu
lub wody.

Wyniki barwienia

cytoplazma :
• zasadochłonna – niebieska (limfocyty, monocyty, plazmocyty)
• kwasochłonna – w różnych odcieniach różu i czerwieni

(erytrocyty, granulocyty)

• amfoteryczna – w różnych odcieniach fioletu
jądra komórkowe:
• odcienie fioletu – młodsze postacie jaśniejsze, starsze ciemniejsze
ziarnistości:
• azurochłonne – w odcieniach fioletu, od granatu do czerwieni

(w granulocytach obojętnochłonnych, monocytach, limfocytach)

• kwasochłonne – żółtobrunatne (w eozynofilach)
• zasadochłonne – ciemnofioletowe z czerwoną poświatą
   (w bazofilach)

Różnicowanie rozmazów:

• Wybarwiony i wysuszony rozmaz oglądamy w powiększeniu

1000-krotnym (10 okular x - 100 obiektyw) z użyciem olejku
immersyjnego.

Oceniamy wszystkie komórki obecne w rozmazie:

• Leukocyty

- oceniamy morfologię

i różnicujemy na poszczególne klasy

• Erytrocyty

- oceniamy morfologię (wielkość, kształt,

wybarwienie, występowanie wtrętów,rulonizację, aglutynację)

• Płytki krwi - oceniamy morfologię i występowanie agregatów

Różnicowanie rozmazów:

• Decydujący wpływ na wynik badania ma wybór odpowiedniego

miejsca do oceny morfologii komórek.

• Preparaty oceniamy najczęściej w 2/3 długości rozmazu gdzie:

• Erytrocyty są ułożone równomiernie, nie nakładają się na siebie,

ale nie ma też między nimi wolnych przestrzeni

• W erytrocytach dobrze widoczna jest della, czyli przejaśnienie

pośrodku komórki

• Leukocyty są odpowiednio rozpostarte, co pozwala na ocenę

struktury jądra i cytoplazmy; w zbyt grubym rozmazie leukocyty
przyjmują formę kulistą

Różnicowanie rozmazów:

• Po rozmazie poruszamy się linią

meandrową, inaczej ruchem konika
szachowego, ponieważ większe
komórki np.: monocyty, granulocyty,
maja tendencję do układania się na
brzegach i końcu rozmazu

• Różnicujemy co najmniej 100 kolejno

napotkanych leukocytów.
Wynik podajemy jako procent
poszczególnych klas leukocytów

Różnicowanie rozmazów:

Właściwy sposób oglądania preparatu

podczas liczenia wzoru odsetkowego

Rozmieszczenie komórek w preparacie krwi obwodowej

w zależności od obszaru oględzin preparatu uzyskuje się

różne wyniki

Rozmaz krwi obwodowej

a - erytrocyty

b -

granulocyt obojętnochłonny

c -

granulocyt kwasochłonny

d - limfocyt

Rozmaz krwi obwodowej

a - erytrocyty b -

granulocyt obojętnochłonny c - granulocyt zasadochłonny ( bazofil)

Różnicowanie rozmazów:

• Wartości prawidłowego

leukogramu

• Granulocyty:
• obojętnochłonny:
•  o jądrze pałeczkowatym 3-6 %
•  o jądrze podzielonym 58-66 %
•  kwasochłonne 2-4 %
•  zasadochłonne 0-0,5 %

• Limfocyty 20-45 %

• Monocyty 4-8 %

Granulocyt obojętnochłonny o jądrze
pałeczkowatym

• kształt okrągły lub owalny
• cytoplazma-różowa ziarnistość nieliczna azurochłonna
  i obojetnochłonna
• Jądro: nie jest podzielone na płaty, pałeczkowate

Granulocyt obojętnochłonny o jądrze
podzielonym

• kształt okrągły lub owalny
• cytoplazma-różowa ziarnistość nieliczna azurochłonna
  i obojętnochłonna
• Jądro: płatowe < 6 płatów

Granulocyt kwasochłonny - eozynofil

• Kształt okrągły lub owalny
• Cytoplazma - różowa zwykle zakryta ziarnistościami
• ziarnistości - bardzo liczne, barwy od złocistej do
  brunatnej, kwasochłonne
• jadro-dwupłatowe

Limfocyty

•

Średnica limfocytów jest różna około 9-12 μm

• Jądro- okrągłe, owalne
• Jąderka – w barwieniu MGG są niewidoczne
• Cytoplazma – niebieskawa w różnych odcieniach
• W cytoplazmie niektórych komórek mogą występować
ziarnistości azurochłonne (czerwonofioletowe, błyszczące dość
grube o ostrych nieregularnych granicach

Monocyty

• Największe komórki krwi widoczne w prawidłowym
  rozmazie krwi obwodowej( średnica 16-20 μm
  Nieregularny kształt okrągły lub owalny
• Jądro- nieregularne, przypomina litery: C,E,L,U
• Cytoplazma niebieskosina
• Ziarnistości – nieobecne lub azurochłonne
  (jasnofioletowe) ziarnistości ułożone są w jednym lub
  kilku skupiskach.

• W cytoplazmie obecne są wodniczki