Cholesterol i lipidy

LIPIDY OSOCZA
1. Triacyloglicerole
2. Cholesterol wolny i zestryfikowany
3. Fosfolipidy
4. Wolne kwasy tłuszczowe

Transport lipidów w środowisku wodnym (we krwi) jest możliwy po ich połączeniu się z
białkami (apoproteinami) w związki wielkocząsteczkowe zwane lipoproteinami.

LIPOPROTEINY

sferyczne cząstki

- niestechiometryczne kompleksy białkowo-lipidowe

- rdzeń - triacyloglicerole i estry cholestrolu

- powierzchnia – cząsteczki amfipatycznych lipidów (fosfolipidy i cholesterol wolny)
i białek

oddziaływania pomiędzy cząsteczkami – niekowalencyjne

- wiązania wodorowe

- siły van der Waalsa

następuje wymiana lipidów i apoprotein pomiędzy lipoproteinami osocza oraz
pomiędzy lipoproteinami i błonami komórkowymi

PODZIAŁ LIPOPROTEIN

Klasa/

Parametr

ChM

VLDL

IDL

LDL

HDL

Lp(a)

Gęstość

[g/mL]

<0,95

0,95-

1,006

1,006-

1,019

1,019-

1,063

1,063-

1,210

1,040-

1,130

Ruchliwość w
EF

start

prebeta

beta

alfa

prebeta

rednica [nm]

>70

26-70

22-24

19-23

4-10

26-30

Główne lipidy

egzogenn

e TAG

endogenne

TAG

endogenne

TAG, estry

cholesterol

estry

cholesterol

fosfolipidy

estry

cholesterolu,

fosfolipidy

Główne białka

A-I

B-48

C-I

C-II

C-III

B-100

C-I

C-II

C-III

B-100

A-I

A-II

(a)

B-100

Podział uwzględniający różnice gęstości poszczególnych frakcji lipoproteinowych –
uzyskany metodą ultrawirowania

chylomikrony: 0,98 g/mL

lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL): <1,006 g/mL

lipoproteiny o pośredniej gęstości (IDL): 1,006- 1,019 g/mL

lipoproteiny o małej gęstości (LDL): 1,019-1,063 g/mL

lipoproteiny o dużej gęstości (HDL): 1,063-1,21 g/mL

Lp(a) – 1,040-1,130 g/mL

Podział uzyskany podczas elektroforezy (agaroza; pH 8,6):

-lipoproteiny (HDL)

pre-

-lipoproteiny (VLDL, IDL, Lp(a))

-lipoproteiny (LDL)

chylomikrony (ChM)

CHEMICZNY SKŁAD (%)PRAWIDŁOWYCH LIPOPROTEIN

Frakcja/

Skład (%)

ChM

VLDL

IDL

LDL

HDL

Triacyloglicerole

80-90

50-70

20-25

5-10

3-5

Cholesterol wolny

1-3

7-10

5-8

3-5

Estry cholesterolu

2-5

4-13

10-12

40-45

15-20

Fosfolipidy

3-7

15-20

20-22

20-30

Białka (apoproteiny)

1-2

8-12

18-20

20-25

45-55

APO(LIPO)PROTEINY

Apoproteina

Masa

cząsteczkowa

[Da]

Miejsce

syntezy

Stężenie w osoczu [g/L]

28 300

Jelito, wątroba

1,0-1,2

AII

17 000

Wątroba, jelito

0,3-0,5

AIV

46 000

Wątroba, jelito, płuca,

ledziona

0,16

B-48

265 000

Jelito

B-100

550 000

Wątroba

0,7-1,0

6500

Wątroba, jelito

0,04-0,06

CII

8800

Wątroba, jelito

0,03-0,05

CIII

8900

Wątroba, jelito

0,12-0,14

20 000

Mózg, wątroba, nerki,

komórki endothelium

E-2, E-3, E-4

39 000

Wątroba, mózg, płuca,

ledziona, mięśnie

0,025-0,100

Apoproteina

Funkcja

Aktywator LCAT, ligand receptora HDL, rola strukturalna w HDL-ach

AII

Rola strukturalna, kofaktor HTGL, inhibitor LPL

AIV

Transport zwrotny cholesterolu, aktywator LCAT i LPL

B-48

Rola strukturalna

B-100

Ligand receptora apo B/E, rola strukturalna

Kofaktor LCAT

CII

Aktywator LPL

CIII

Inhibitor apo-CII

Transport lipidów

E-2, E-3, E-4

Ligand receptora apo B/E i receptora LRP, transport cholesterolu

ENZYMY METABOLIZMU LIPOPROTEIN

Lipaza lipoproteinowa (LPL)

glikoproteina (55 000)

hydrolaza acyloglicerolu

występuje w: tkance tłuszczowej, mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym,
płucach, wątrobie, śledzionie

związana z powierzchnią komórek – głównie śródbłonka naczyniowego (za
pośrednictwem siarczanu heparanu)

aktywność w tkankach zależy od czasu jaki upłynął od posiłku oraz od wydzielania
hormonów (gł. insuliny)

- duża aktywność w tkance tłuszczowej po posiłku

- duża aktywność w mięśniach w okresie poresorpcyjnym

wstrzyknięcie heparyny powoduje:

- uwolnienie LPL do krwi

- zmianę wykorzystania kwasów tłuszczowych przez narządy

aktywatory: apo CII (na czczo na HDL-ach) i fosfolipidy (wiążą apo CII z
lipoproteiną)

Wątrobowa lipaza lipoproteinowa (HTGL/HL)

glikoproteina

syntetyzowana w wątrobie

wiąże się z powierzchnią śródbłonka w zatokach wątroby

hydrolizuje triacyloglicerole w:

- IDL-ach

- remnantach chylomikronów

- HDL (przekształca HDL

w HDL

)

Acylotransferaza acylo-CoA:cholesterol (ACAT)

enzym mikrosomalny

katalizuje reakcję estryfikacji cholesterolu w obecności CoA i ATP

inhibitory:

- kwasy żółciowe
- czynniki blokujące grupy sulfhydrylowe

wykazuje swoistość w stosunku do różnych kwasów tłuszczowych – szybkość
estryfikacji maleje w zależności od rodzaju kwasu w kolejności:

oleinian>palmitynian>stearynian>linoleinian

aktywność ACAT zależy od zawartości cholesterolu w komórce

Hydrolaza estrów cholesterolu (esteraza cholesterolowa)

w wątrobie, ścianie naczyniowej, nabłonku jelitowym, korze nadnerczy i jajnikach
(synteza hormonów steroidowych)

katalizuje odwracalną reakcję estryfikacji cholesterolu i hydrolizy estrów cholesterolu:

estry cholesterolu + H

O cholesterol wolny + kwas tłuszczowy

Acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)

sekrecyjny enzym osocza

synteza w wątrobie

związana z frakcją HDL

katalizuje reakcję:

lecytyna + cholesterol ester cholesterolu + lizolecytyna

powstają głównie estry cholesterolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych (kwasu
linolowego, oleinowego, arachidonowego)

aktywator: AI (CI)

BIAŁKO PRZENOSZĄCE ESTRY CHOLESTEROLU (CETP)

glikoproteina

posiada domeny wiążące triacyloglicerole, estry cholesterolu, fosfolipidy

synteza – wątroba, nadnercza, trzustka, mięśnie, tkanka tłuszczowa, jelito cienkie,
serce i nerki

odpowiada za transfer:

- estrów cholesterolu pomiędzy lipoproteinami osocza i ich wymianę na triacyloglicerole

(100%)

- fosfolipidów (w ok. 30%)

BIAŁKO PRZENOSZĄCE FOSFOLIPIDY (PTP)

odpowiedzialne za 70 % transferu fosfolipidów pomiędzy lipoproteinami osocza:

- z lipoprotein bogatych w TAG na HDL-e

- z HDL

na VLDL-e i LDL-e

- z CETP z HDL na inne lipoproteiny

RECEPTORY UCZESTNICZĄCE W PRZEMIANACH LIPOPROTEIN OSOCZA

receptor dla remnantów (LRP)

- w wątrobie

- rozpoznaje apo E

receptor dla LDL (receptor apo B100/E)

- w wielu komórkach organizmu
- rozpoznaje apo B100 i apo E
- jego synteza jest ściśle uzależniona od zapotrzebowania komórki na cholesterol i

zawartości w niej estrów cholesterolu

receptor SR-B1 (receptor zmiatający B1)

- w wątrobie i tkankach steroidogennych wiąże HDL za pośrednictwem apo AI i estry
cholesterolu są dostarczane do komórek

- w pozostałych tkankach pośredniczy w przenoszeniu cholesterolu z komórek do

HDL

(zwrotny transport choleterolu)

transportery kasetowe wiążące ATP: ABCA1 i ABCG1

- rodzina białek transportujących z towarzyszącą hydrolizą ATP w celu związania
substratu (co umożliwia jego transport przez błonę)

- ABCG1 – pośredniczy w transporcie cholesterolu z komórek do HDL-i (np. z

makrofagów)

- ABCA1 – preferencyjnie ułatwia wypływ cholesterolu i fosfolipidów do cząstek

pre

-HDL lub apo AI przekształcanych następnie w dyskoidalne HDL i HDL

LIPOPROTEINA (a)

glikoproteina, białko ostrej fazy, zmodyfikowana cząstka LDL

apo (a) i apo B100 – połączone mostkiem dwusiarczkowym

apo (a) – peptyd sygnałowy, domena proteazowa i struktury obwarzankowe (kringles)
utrzymywane przez 3 wiązania dwusiarczkowe (podobne struktury są w
plazminogenie, protrombinie, tkankowym i urokinazowym aktywatorze
plazminogenu)

zakres stężeń w osoczu 1-100 mg/dL (prawidłowe nie powinno przekraczać 30
mg/dL)

podobieństwo budowy apo (a) do plazminogenu może hamować procesy fibrynolizy
(działanie prozakrzepowe)

pobudza regenerację i naprawę uszkodzonych naczyń

apo (a) występuje w izoformach:

- F (fast) – o ruchliwości elektroforetycznej większej niż apo B100

- B – o ruchliwości elektroforetycznej zbliżonej do apo B100

- S1, S2, S3, S4 (slow) o ruchliwości elektroforetycznej mniejszej niż apo B100

u osób z małym stężeniem Lp(a) przeważają duże izoformy apo (a) S3 i S4

u osób ze zwiększonym stężeniem Lp(a) przeważają izoformy małe F, B, S1, S2

Lp(a) nasila chemotaksję monocytów do blaszki miażdżycowej i aktywację płytek
krwi

Lp(a) jest pobierana przez receptory typu „scavenger”

LIPOPROTEINA X (LpX)

u pacjentów z cholestazą wątrobową

budowa – liposomy:

- podwójna warstwa fosfolipidowa (gł. lecytyny) – 66%

- wolny cholesterol – 25%

- białka (1/2 albumina) – 5%

nie wykazuje właściwości aterogennych

LIPOPROTEINA

-VLDL

powstaje w osoczu:

- podczas stosowania diety bogatotłuszczowej

- w otyłości brzusznej

- w insulinooporności

- cukrzycy typu 2

- gdy wytwarzana jest izoforma apo E2

gęstość <1,006 g/mL (VLDL)

ruchliwość elektroforetyczna b-lipoprotein (LDL)

zawartość

- 40% TAG + ok. 35% cholesterolu

aterogenna

ZMODYFIKOWANE LDL

utlenione LDL – retencja LDL i zaburzenie równowagi prooksydacyjno-
antyoksydacyjnej

- mm-LDL (wczesna faza modyfikacji)

- ox-LDL (późna faza modyfikacji)

insulinooporność i cukrzyca – podwyższone stężenia glukozy

- gli-LDL

- glioksy-LDL

APOPROTEINA E (Apo E)

chylomikrony, VLDL, IDL, HDL

rozpoznawana przez receptory: LRP i B/E

osłania apo AI

nasila aktywność białka CETP

wykazuje polimorfizm (3 allele w jednym locus + modyfikacja potranslacyjna)

6 fenotypów: apo E 2/2, apo E 3/2, apo E 3/3, apo E 4/2, apo E4/3, apo E 4/4

Poszczególne izoformy wykazują różną siłę wiązania z receptorami LRP:

izoforma apo E2

– wykazuje mniejsze powinowactwo do receptora LRP -> zmniejsza się zawartość

cholesterolu w komórkach wątroby -> zwiększa się ilość receptorów B/E

izoforma apo E4

- wykazuje większe powinowactwo do receptora LRP -> zwiększa się zawartość
cholesterolu w komórkach wątroby -> zmniejsz się ilość receptorów B/E

- bierze udział w patomechanizmie choroby Alzheimera (powstają kompleksy apo E4 i

peptydu powstającego z białka prekursorowego amyloidu)

DYSLIPIDEMIE / DYSLIPOPROTEINEMIE
Klasyfikacja hiperlipoproteinemii według Fredricksona

Typ

Wygląd

surowicy

TAG

ChT/TAG

mleczna

N/↑

↑↑↑

ChM

< 0,2

IIa

klarowna

↑↑↑

nadmiar LDL

> 1,5

IIb

klarowna,

opalizująca

↑↑

nadmiar

LDL i VLDL

> 1,5

III

mętna

↑↑

IDL

ok.1

mętna

N/↑

↑↑↑

nadmiar VLDL

< 0,2

mleczna

↑↑

↑↑↑

ChM i nadmiar

VLDL

0,15-0,6

KLASYFIKACJA HIPERLIPIDEMII
(wg Europejskiego Towarzystwa Miażdżycowego)

mmol/L (mg/dL)

TAG

mmol/L (mg/dL)

Hipercholesterolemia izolowana:
      - łagodna
      - umiarkowana
      - znaczna

5,2-6,5 (200-250)
6,5-7,8 (250-300)

> 7,8 (> 300)

<1,7 (150)
<1,7 (150)
<1,7 (150)

Hipertriglicerydemia izolowana:
- umiarkowana
- znaczna

<5,2 (200)
<5,2 (200)

2,3-4,6 (200-400)

>4,6 (>400)

Hiperlipidemia mieszana:
- umiarkowana
- znaczna

5,2-6,5 (200-250)

>7,8 (>300)

2,3-4,6 (200-400)

>4,6 (400)

HIPERCHOLESTEROLEMIA

Klasyfikacja

genetyczna

Pierwotna przyczyna

Zaburzenia metaboliczne

Typ

Pospolita hiper-
cholesterolemia

liczne czynniki genetyczne/
ś

rodowiskowe

nadprodukcja LDL i
obniżony katabolizm

IIa

Rodzinna złożona
hipelipidemia

nieznana

nadprodukcja apo B frakcji
VLDL i LDL

IIa

Rodzinna hiper-
cholesterolemia

liczne mutacje powodujące
upośledzenie funkcji lub brak
receptora komórkowego dla
LDL

upośledzony katabolizm
LDL i nadprodukcja LDL

IIa

HIPERTRIGLICERYDEMIA

Klasyfikacja

genetyczna

Pierwotna przyczyna

Zaburzenia

metaboliczne

Typ

Pospolita hiper-
triglicerydemia

czynniki genetyczne/
ś

rodowiskowe

nadprodukcja VLDL

Rodzinna złożona
hiperlipidemia

nieznana

nadprodukcja apo B
frakcji VLDL i LDL

Rodzinna
hipertriglicerydemia

nieznana

nadprodukcja TAG
frakcji VLDL i/lub
upośledzony katabolizm

HIPERLIPIDEMIA MIESZANA

Klasyfikacja

genetyczna

Pierwotna przyczyna

Zaburzenia

metaboliczne

Typ

Rodzinna złożona
hiperlipidemia

nieznana

nadprodukcja apo B
frakcji VLDL i LDL

IIb

Rodzinna hiper-
cholesterolemia

liczne mutacje powodujące
upośledzenie funkcji lub brak
receptora komórkowego dla
LDL

upośledzony katabolizm
LDL i nadprodukcja
LDL

IIb

Rodzinna hiper-
triglicerydemia

nieznana

nadprodukcja TAG
frakcji VLDL i/lub
upośledzony katabolizm

Zespół hiper-
chylomikronemii

brak/niedobór LPL lub jej
aktywatora apo CII

upośledzony katabolizm
ChM, czasem wtórne
upośledzone usuwanie
VLDL

I lub V

INNE RODZAJE KLASYFIKACJI DYSLIPIDEMII

pierwotne i wtórne

jednogenowe,wielogenowe, złożone

PIERWOTNE DYSLIPIDEMIE
Związane z zaburzeniami transportu lipidów egzogennych

sitosterolemia (zwiększone wchłanianie steroli roślinnych)

abetalipoproteinemia (brak syntezy VLDL i ChM)

choroba Andersona (brak syntezy ChM)

rodzinna hipertriglicerydemia (chylomikronemia) związana z niedoborem LPL

rodzinna hipertriglicerydemia (chylomikronemia) związana z niedoborem apo CII

hiperlipidemia typu III (rodzinna dysbetalipoproteinemia) – izoforma apo E2 + inne
przyczyny

Związane z zaburzeniami transportu lipidów endogennych

złożone hiperlipidemie (złożone podłoże genetyczne) – izoforma apo E4 (najczęściej)

rodzinna złożona hiperlipidemia (nasilona sekrecja apo B100 i synteza VLDL w
wątrobie, wzrost aktywności apo CIII + inne)

rodzinna hipercholesterolemia (upośledzona funkcja receptora dla LDL )

rodzinny defekt apoproteiny apo B100

dyslipidemia z nadprodukcją Lp(a)

hipobetalipoproteinemia

brak aktywności lipazy wątrobowej

Związane z zaburzeniami drogi transportu zwrotnego cholesterolu do wątroby

rodzinna hipoalfalipoproteinemia

brak apo AI

zmieniona budowa apo AI

choroba tangierska (mutacje genu transportera ABCA-1)

upośledzenie aktywności LCAT

hiperalfalipoproteinemia związana z niedoborem CETP

brak apo AII

Przyczyna

Podwyższona frakcja

lipoprotein

HDL

Endokrynna, metaboliczna

- cukrzyca

LDL i/lub VLDL/ChM

↓

- niedoczynnośc tarczycy

LDL i/lub VLDL/ChM/IDL

↓

- choroba Cushinga

LDL i/lub VLDL

- akromegalia

VLDL

Nerkowa

- niewydolność nerek

IDL lub VLDL

↓

- zespół nerczycowy

LDL i/lub VLDL/ChM

↓

Wątrobowa

- cholestaza

LDL (LpX)

↓

- alkoholizm

VLDL, ChM

Przyczyna

Podwyższona frakcja

lipoprotein

HDL

Immunologiczna:

- toczeń rumieniowaty

ChM lub IDL

- gammapatie monoklonalne

LDL i/lub VLDL/ChM lub IDL

↓

Leki:

-blokery

VLDL, LDL

↓

- tiazydy

LDL i/lub VLDL

N/↓

- glikokortykoidy

VLDL i/lub ChM z/bez LDL

N/↓

- estrogeny

VLDL/ChM

- gestageny

LDL i VLDL

↓

WSKAZANIA DO PRZEPROWADZENIA BADAŃ LIPIDOWYCH

ocena ryzyka wieńcowego

pierwotne dyslipoproteinemie (objawy: żółtaki, obwódka starcza, zmętnienie rogówki,
barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, hepatosplenomegalia)

wtórne dyslipoproteinemie

wyjaśnienie etiologii ostrego zapalenia trzustki

profilaktyka

kontrola leczenia obniżającego stężenie tłuszczów (dietetycznego, farmakologicznego)
i leczenia chorób wywołujących wtórne hipercholesterolemie

MATERIAŁ DO BADAŃ LIPIDOWYCH

krew żylna – krótkotrwały ucisk stazy

pacjent minimum 12-14 godzin na czczo (bez głodówek)

ostatni posiłek przed badaniem – z małą ilością tłuszczu, bez alkoholu (szczególnie
ważne podczas oznaczania stężenia TAG)

w ciągu 24 godzin przed pobraniem krwi nie wykonywać żadnej ciężkiej pracy
fizycznej

surowica lub osocze wersenianowe (1 mg EDTA na 1 mL krwi)

przechowywanie materiału – w szczelnie zamkniętych probówkach:

- do 4 dni w lodówce

- w temp. -20°C do 6 miesięcy

- w temp. -70°C do roku

Test zimnej flotacji

ocena wyglądu surowicy/osocza (na czarnym tle)

- mętny wygląd – zależy od nadmiaru TAG (VLDL lub ChM)

do wąskiej probówki nalewamy 2-5 mL surowicy i wstawiamy do lodówki na 12-18
godzin

wynik:

- gęsty kożuszek - kożuszek

- mętna

na powierzchni

- mętna surowica surowica

- przejrzysta surowica

↑

ChM - typ I ↑ ChM typ V ↑ VLDL – typ IV/IIB

↑ VLDL

OZNACZANIE CHOLESTEROLU CAŁKOWITEGO

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

! Krew nie może być zhemolizowana – hemoliza wpływa na stężenie cholesterolu w osoczu
(zwiększa)!

w osoczu in vitro:

ChW : ChE = 1 : 3

w erytrocytach

ChW : ChE = 4 : 1

Bilirubina w stężeniu powyżej 10 mg% wpływa na oznaczenie cholesterolu – przyjmuje się
poprawki zależne od stężenia bilirubiny:
- przy stężeniu bilirubiny >5mg% na każdy 1 mg% należy dodać 2,5 mg% cholesterolu

Metody kolorymetryczne oznaczania cholesterolu dzielimy na:

jednostopniowe – reakcja barwna(rutynowe)

wielostopniowe

- czterostopniowe

ekstrakcja cholesterolu

zmydlanie

izolowanie

reakcja barwna

- trzystopniowe

ekstrakcja cholesterolu

zmydlanie

reakcja barwna

EKSTRAKCJA
Cholesterol jest związany z lipoproteinami – należy go z tych połączeń wyekstrahować
mieszaniną odczynników:

etanolu i eteru – całkowita ekstrakcja cholesterolu

etanolu i acetonu

metanolu i chloroformu (mieszanina Folcha)

ZMYDLANIE
Hydroliza estrów cholesterolu za pomocą alkoholowego roztworu KOH (na ciepło) –
uzyskanie postaci wolnej cholesterolu
IZOLOWANIE

najczęściej strącanie digitoniną

- powstają digitonidy

- stosunek molekularny cholesterolu do digitoniny 1:1

- podczas strącannia stosuje się nadmiar digitoniny (10:1)

- przed reakcją barwną należy pozbyć się digitonidów (pirydyną lub CH

COOH

REAKCJE BARWNE
A. Reakcja Liebermanna – Burcharda - najstarsza

do roztworu dodaje się mieszaninę bezwodnika CH

COOH i stężonego H

Roztwór: cholesterol w chloroformie, kwasie octowym, dioksanie lub bezpośrednio
próbka surowicy/osocza

reakcja L-B nie jest swoista dla cholesterolu – z odczynnikiem reagują także
bilirubina, witaminy, inne steroidy.

B. Kwas p-toluenosulfonowy

z bezwodnikiem CH

COOH, CH

COOH lodowatym i H

C. Reakcja z FeCl

, CH

COOH lodowatym i H

Referencyjna metoda oznaczania cholesterolu całkowitego

Metoda Abell-Kendalla (chemiczna 3-stopniowa):

ekstrakcja: mieszanina alkoholu etylowego i eteru

zmydlanie : alkoholowy roztwór KOH

reakcja barwna: Libermanna-Burcharda

Metody enzymatyczne

HYDROLIZA

esteraza cholesterolowa

cholesterol zestryfikowany + H

O cholesterol + RCOOH

UTLENIENIE

oksydaza cholesterolowa

cholesterol + O

∆

4- cholestenon + H

OZNACZANIE

elektroda tlenowa – oznaczanie tlenu zużytego w tej reakcji

spektrofotometrycznie – pomiar powstałego D4- cholestenonu (l

max

- 240 nm)

reakcja Hanztscha – katalaza + metanol

- metanol utlenia się do aldehydu mrówkowego, który w obecności acetyloacetonu i

amoniaku daje barwny kompleks 3,5-diacetylo-1,4dihydrolutydyny (405-415 nm)

reakcja Trindera - kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną
w obecności fenolu (500-550 nm)

4-aminoantypiryna + fenol = odczynnik Trindera

peroksydaza

+ fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H

Metoda CHOD-PAP = oksydaza + odczynnik

cholesterolowa Trindera

test optyczny

katalaza

+ etanol aldehyd octowy + 2H

dehydrogenaza aldehydu octowego

aldehyd octowy + NADP

kwas octowy + NADPH+H

Interferencje – metody enzymatyczne oznaczania cholesterolu
Interferują związki barwne lub uczestniczące w reakcji utleniania:

bilirubina o stężeniu powyżej 5 mg/dL (85,5

mol/L) - dodaje się oksydazę bilirubiny

kwas askorbinowy

hemoglobina – stosuje się pomiar bichromatyczny

inne sterole zawierające grupę –OH (np. sitosterol) mogą reagować z zastosowanymi
odczynnikami

Oznaczanie estrów cholesterolu

ChT – ChW = ChE

ChT – cholesterol całkowity
ChW – cholesterol wolny (oznaczony bez etapu zmydlania)
ChE – estry cholesterolu

Metoda rozcieńczeń izotopowych z wykorzystaniem spektrometrii masowej

metoda definitywna oznaczania cholesterolu (ID/MS)

Ch + Ch znakowany (1:1) -> hydroliza estrów -> ekstrakcja

z przekształceniem cholesterolu w etery (analiza GC/MS)

oblicza się stosunek cholesterolu znakowanego do nieznakowanego i stężenie
cholesterolu w próbce

bardzo wysoka czułość i precyzja

Zakresy wartości prawidłowych stężeń cholesterolu całkowitego

zakres wartości prawidłowych trudny do zdefiniowania (odbiega od zakresu wartości
pożądanych = nie powodujących wzrostu ryzyka choroby niedokrwiennej serca)

- duża zmienność biologiczna (wiek, płeć, dieta, wahania

sezonowe, dobowe, faza cyklu menstruacyjnego, ciąża, zawał mięśnia sercowego,
zabiegi chirurgiczne)

- duża częstość hipercholesterolemii

- długi okres latencji do klinicznych objawów następstw hipercholesterolemii

zakłada się zakres wartości pomiędzy 10 i 90 percentylem

Wiek

Stężenie cholesterolu całkowitego

[mg/dL]

[mmol/L]

> 40 r. ż.

< 240

< 6,2

30-40 r. ż.

< 220

< 5,7

20-30 r. ż.

< 200

< 5,2

< 20 r. ż.

< 170

< 4,4

> 1 r. ż.

< 225

< 5,8

< 1 r. ż.

< 190

< 5,0

Przelicznik [mg/dL] na [mmol/L]: 0,026

Nieprawidłowe stężenia cholesterolu całkowitego
Wartości podwyższone:

pierwotne hipercholesterolemie

wtórne hipercholesterolemie - w przebiegu:

- przewlekła niewydolność nerek

- zespół nerczycowy

- przewlekłe choroby wątroby i dróg żółciowych (szczególnie pierwotna żółciowa
marskość wątroby)

- niedoczynność tarczycy

- cukrzyca (źle wyrównana)

leki: gestageny (doustne środki antykoncepcyjne), glikokortykoidy, leki moczopędne

złe nawyki żywieniowe

Wartości obniżone:

poniżej 140 mg/dL (3,6 mmol/L)

ciężkie choroby wyniszczające (nowotwory, przewlekłe zakżenia, operacje, urazy
wielonarządowe)

nadczynność tarczycy

niewydolność wątroby

głodzenie

OZNACZANIE STĘŻENIA TRIACYLOGLICEROLI (TAG)

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

EKSTRAKCJA

odczynnikiem Bloora (etanol:eter etylowy; 3:1 v/v)

- ekstrakcji ulegają także fosfolipidy

- suszenie ekstraktu i ważenie

ADSORPCJA

usuwanie fosfolipidów – adsorpcja mieszaniną albuminy i zeolitu

usuwanie glukozy – adsorpcja mieszaniną Ca(OH)

i CuSO

ZMYDLANIE

etanolowym roztworem KOH

następuje uwolnienie glicerolu

REAKCJA BARWNA

glicerol utlenia się pod wpływem kwasu nadjodowego do formaldehydu

formaldehyd kondensuje z acetonem w obecności amoniaku – powstaje kompleks
barwny: 3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydyna (405 nm)

Metody fluorymetryczne

3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydyna (DDL) – może być oznaczana metodą
fluorymetryczną

Metody enzymatyczne

HYDROLIZA

lipaza

triacyloglicerol + 3H

O glicerol + 3 kwasy tłuszczowe

OZNACZANIE GLICEROLU

z wykorzystaniem testu optycznego

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + NAD

fosfodihydroksyaceton + NADH+H

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian

pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H

mleczan + NAD

z wykorzystaniem pomiaru kolorymetrycznego

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + NAD

fosfodihydroksyaceton + NADH+H

diaforaza

NADH+H

+ barwnik tetrazoliowy formazan + NAD

Pomiar: 500 nm

2.

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

oksydaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + O

fosfodihydroksyaceton + H

peroksydaza

+ fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H

Pomiar: 500-550 nm (metoda z odczynnikiem Trindera, PAP)

Reakcja Trindera - kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną w
obecności fenolu (500-550 nm)

4-aminoantypiryna + fenol = odczynnik Trindera

Interferencje – metody enzymatyczne oznaczania TAG

endogenny glicerol – w prawidłowych warunkach w niewielkich ilościach
(równowartość ok. 10 mg/dL TAG)

zwiększenie stężenia glicerolu:

- cukrzyca

- stres (emocjonalny)

- dożylne podawanie leków zawierających glicerol

- przedłużone przechowywanie w temperaturze >-20°C

Metoda stałego odcinka czasu (fixed time method)
- oparta na rożnicy wartości pomiarów w dwóch punktach czasowych
- pozwala na eliminację błędu wynikającego z obecności glicerolu

Zakres wartości prawidłowych stężeń TAG
50 -180 mg/dL (0,55-2,0 mmol/L)
Przelicznik z [mg/dL] na [mmol/L]: 0,0114
Nieprawidłowe stężenia TAG
Wartości podwyższone:

pierwotne hipertriglicerydemie

wtórne hipertriglicerydemie – w przebiegu:

- cukrzyca

- dna moczanowa

- choroba Cushinga

- gammapatie monoklonalne

- toczeń rumieniowaty układowy

- choroby spichrzania glikogenu

- ciąża

- skłonność: otyłość, nadużywanie alkoholu, dieta bogatowęglowodanowa

leki: blokery receptorów b, tiazydy, glikokortykoidy, estrogeny (doustne leki
antykoncepcyjne)

Oznaczanie stężenia cholesterolu frakcji HDL
Metody strąceniowe

precypitacja lipoprotein VLDL, IDL, Lp(a), LDL, ChM

- za pomocą polianionów (heparyna, siarczan dekstranu, fosforowolframian)
reagujących z dodatnio naładowanymi grupami lipoprotein

- w obecności kationów dwuwartościowych reakcja ulega przyśpieszeniu

- precypitacja 10-15 minut -> wirowanie 45 000g; 1 minuta lub 1500g; 30 minut

w supernantancie: cholesterol HDL (oznaczany metodą enzymatyczną)

Najczęściej stosowane mieszaniny polianionów z dwuwartościowymi kationami:

heparyna z Mn

siarczan dekstranu z Mg

(najlepszy przy wysokich stężeniach TAG)

kwas fosforowolframowy z Mg

glikol polietylenowy 20 000 (wytrąca także HDL

)

!Gdy stężenie TAG>400 mg/dL precypitacja jest utrudniona – należy zastosować
wirowanie, filtrację lub rozcieńczenie badanej próbki osocza!

Metody bezpośrednie
Oznaczenie cholesterolu we frakcji HDL – metodą enzymatyczną z zastosowaniem:

przeciwciał poliwalentnych przeciwko apo-B

czynników kompleksujących

- cyklodekstryna – opłaszcza lipoproteiny (głównie z apo-B, HDL

są opłaszczone w niewielkim stopniu) = osłania cholesterol we frakcjach poza HDL
przed enzymami uczestniczącymi w reakcji

- specyficzny detergent usuwa cyklodekstrynę z frakcji HDL

Oznaczanie stężenia cholesterolu frakcji LDL
Metody pośrednie
1. Wzór Friedewalda
– oznaczenie stężenia cholesterolu całkowitego (ChT), triacylogliceroli (TAG), cholesterolu
frakcji HDL (Ch-HDL)-> podstawienie do wzoru:

TAG

Ch-LDL = ChT – Ch-HDL –

[mg/dL]

TAG

Ch-LDL = ChT – Ch-HDL –

[mmol/L]

2,2

Wzór Friedewalda nie powinien być stosowany, gdy:

stężenie TAG przekracza 300 mg/dL (400 mg/dL)

surowica zawiera znaczące ilości chylomikronów

- nie zostały pobrane na czczo

- u pacjentów z dysbetalipoproteinemią

2. Oznaczanie lipoprotein

ββββ

- metoda ultrawirowania z precypitacją polianionami

(metoda referencyjna)

- osocze wersenianowe (2 mL) z roztworem burowym o gęstości 1,006 g/mL (1 mL)
poddajemy wirowaniu (105 000 x g, 18 godzin, 10°C)

- uzyskujemy rozdział:

VLDL,

-VLDL, ChM (warstwa flotująca)

osocze

LDL, HDL (infranatant) + Lp(a), IDL

- infranatant - mieszany, rekonstytuowany do znanej objętości

- oznaczenie cholesterolu w infranatancie
- obliczenie stężenia cholesterolu frakcji LDL i VLDL:

[Ch-LDL] = [Ch frakcji o gęstości >1,006 g/mL] – [Ch-HDL]

[Ch-VLDL] = [ChT] - [Ch frakcji o gęstości >1,006 g/mL]

3. Elektroforeza lipoprotein

metoda półilościowa

pozwala uwidocznić różnice w szybkości wędrówki lipoprotein (wskazuje na
zmiany lub defekty genetyczne nie dające się ocenić innymi metodami) – np. szerokie
pasmo

ββββ

, odpowiadające flotującym b-lipoproteinom jest charakterystyczne dla

hipelipidemii typu III.

nośnik: bibuła, octan celulozy, agaroza, żel poliakrylamidowy

barwienie:

- czerwień olejowa O w 40-55% etanolu (najczęściej stosowana)

- czerń sudanowa B

- czerń amidowa

(lub) wytrącenie w żelu za pomocą polianionów

ocena densytometryczna

Metody bezpośrednie

selektywna precypitacja z:

- siarczanem poliwinylu

- heparyną w niskim pH

metody wykorzystujące mieszaninę przeciwciał poliklonalnych przeciwko apo-AI i
apo-E związanych z żywicą, które wiążą i usuwają VLDL, IDL, HDL

metody z homogennymi reagentami - pomiar stężenia cholesterolu LDL (metodą
enzymatyczną) po zamaskowaniu cholesterolu związanego z frakcjami innymi niż
LDL (przeciwciała poliklonalne przeciwko apo-AI i apo-E)

Zakresy wartości stężeń cholesterolu frakcji HDL i LDL

Ryzyko

choroby

wieńcowej

Cholesterol LDL

Cholesterol HDL

[mg/dL]

[mmol/L]

[mg/dL]

[mmol/L]

Kobiety

normalne

< 160

< 4,2

> 65

> 1,7

podwyższone

> 180

> 4,7

< 45

< 1,2

Mężczyźni

normalne

< 160

< 4,2

> 55

> 1,5

podwyższone

> 180

> 4,7

< 35

< 0,9

Wartości docelowe leczenia hipolipemicznego

Wynik badania

Ryzyko zawału

Docelowa wartość cholesterolu

LDL

Rozpoznana choroba
wieńcowa

Bardzo wysokie

< 100 mg/dL

Cholesterol > 300 mg/dL i
więcej niż jeden dodatkowy
czynnik ryzyka

Wysokie

< 130 mg/dL

Cholesterol 200-300 mg/dL i
jeden dodatkowy czynnik
ryzyka

Dość duże

< 155 mg/dL

Czynniki wpływające na stężenia cholesterolu frakcji LDL i HDL

LDL

HDL

Aktywność fizyczna

↓

↑

Brak aktywności fizycznej

↑

↓

Glikokortykoidy, androgeny,

-blokery, leki moczopędne

↑

↓

Estrogeny

N/↑

↑

Gestageny

↑

↓

Czynniki ryzyka choroby wieńcowej

palenie papierosów

nadciśnienie

hipercholesterolemia

niskie stężenie cholesterolu HDL

płeć męska (w okresie pomenopauzalnym ryzyko u kobiet jest takie samo jak u
mężczyzn)

cukrzyca

wczesna choroba wieńcowa u bliskich krewnych

choroba naczyń obwodowych i mózgowych u krewnych

otyłość

Układ odniesienia dla wyników laboratoryjnych

interpretacja stężeń lipidów i frakcji lipoproteinowych – ocena ryzyka zagrożenia
miażdżycą i chorobą niedokrwienna serca (wartości decyzyjne)

zalecane wartości decyzyjne: cholesterol całkowity < 200 mg/dL

Poziom

LDL

[mg/dL]

HDL

[mg/dL]

kobiety

HDL

[mg/dL]

mężczyźni

Pożądany

< 135

> 66

> 58

Graniczny

135-175

66-42

58-35

Wysokiego
ryzyka

> 175

< 42

< 35

Lipidowe czynniki ryzyka choroby wieńcowej

cholesterol całkowity / cholesterol HDL > 5

cholesterol LDL / cholesterol HDL > 4

duże stężenie TAG przy niskim stężeniu cholesterolu HDL

obecność małych gęstych LDL

Oznaczanie apolipoprotein
Metody:

radioimmunologiczne

immunoenzymatyczne

immunodyfuzja radialna (metoda referencyjna)

immunoturbidymetryczne

Zakresy wartości prawidłowych stężenia apolipoprotein

Apoproteina

Zakres normy [mg/dL]

Apo B100

50-130

Apo CI

110-205

Apo E

3-5

Apo CII

3-8

OZNACZANIE STĘŻENIA FOSFOLIPIDÓW

Metody chemiczne
I. 1. Ekstrakcja – odczynnikiem Bloora (etanol + eter etylowy), eterem naftowym,
izopropanolem, odczynnikiem Folcha (chloroform + metanol)
2. Hydroliza – uwolnienie fosforu i utlenienie fosforu organicznego do nieorganicznego
(HClO

, HNO

+ H

)

3. Reakcja barwna – reakcja fosforu nieorganicznego z molibdenianem amonu ->
fosfomolibdenian amonu -> reakcja z Zn

do błękitu molibdenowego (660 nm)

II. 1. Wytrącanie fosfolipidów z białkami (TCA)

2. Utlenienie fosforu organicznego do fosforu nieorganicznego (HClO

)

3. Reakcja barwna

Metody enzymatyczne

lecytyna – główny fosfolipid osocza

fosfolipazy

- A

– uwalnia resztę acylową w pozycji

- A

– uwalnia resztę acylową w pozycji

- C – uwalnia resztę fosfocholiny

- D – uwalnia resztę choliny

fofataza alkaliczna

fosfocholina + H

O cholina + P

kinaza choliny

cholina + ATP

fosfocholina + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian

pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H

mleczan + NAD

oksydaza choliny

cholina + 2O

+ H

betaina + H

+ fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H

Pomiar: 500-550 nm (metoda z odczynnikiem Trindera, PAP)

Znaczenie kliniczne oznaczania fosfolipidów

zakres wartości prawidłowych w osoczu

- fosfor fosfolipidów 6-11 mg/dL

- stężenie fosfolipidów 150-300 mg/dL

- stosunek cholesterol/fosfolipidy ≈ 0,98 (wzrasta z wiekiem do ok. 1,4)

zwiększone stężenie fosfolipidów

- miażdżyca naczyń

- niewydolność wątroby

- cukrzyca

oznaczanie lecytyny w płynie owodniowym – ocena dojrzałości układu
oddechowego płodu

- stężenie > 5,1 mg/dL – prawidłowe dojrzewanie

- stężenie 4,7-5,1 mg/dL – zaburzenia dojrzewania

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (WKT)

ocena poheparynowej aktywności lipolitycznej osocza (aktywność LPL)

znaczenie w hiperlipoproteinemii typu I i V

metoda miareczkowa

- ekstrakcja izopropanolem i heptanem

- miareczkowanie mianowanym roztworem NaOH wobec

wskaźnika (błękit tymolowy)

prawidłowe stężenie WKT w surowicy: 0,2-0,8 mmol/L

zwiększone stężenie WKT: cukrzyca, głodzenie, adrenalina, hormon wzrostu