Ć
wiczenie 10
Cukry zło
Ŝ
one
Wyci
ą
g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
-
odczynnik Benedicta – T+
-
kwas siarkowy – C
-
kwas solny – C
Cz
ą
steczki cukrów zło
Ŝ
onych s
ą
budowane z 2 lub wi
ę
cej cz
ą
steczek monosacharydów poł
ą
czonych
wi
ą
zaniami glikozydowymi. W zale
Ŝ
no
ś
ci od ilo
ś
ci buduj
ą
cych je jednostek cukrowych mówi si
ę
o: oligosacharydach – zbudowane z 2-10 monosacharydów (po
ś
ród nich wyró
Ŝ
nia si
ę
disacharydy –
zbudowane z dwóch monosacharydów) oraz polisacharydach – zbudowane z ponad 10 monosacharydów.
Cz
ą
steczki polisacharydów mog
ą
by
ć
proste lub rozgał
ę
zione. Poszczególne jednostki cukrowe poł
ą
czone
s
ą
w ła
ń
cuchu głównym wi
ą
zaniami typu
α
(1-4)- lub
β
(1-4)-glikozydowego a rozgał
ę
zienia powstaj
ą
przez
tworzenie wi
ą
za
ń
α
(1-6)-glikozydowych. Podczas hydrolizy wielocukry rozpadaj
ą
si
ę
na prostsze jednostki
cukrowe np. dekstryny (rozpad skrobi) lub celobioz
ę
(hydroliza celulozy) a ostatecznie na cukry proste.
Literatura:
„Biochemia” J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer, PWN, 2005
„Biochemia Harpera” R.K. Murray i in., Wydanictwo Lekarskie PZWL, 2006
Di- i polisacharydy - analiza jako
ś
ciowa
1. Odczyn Benedicta
W odczynie Benedicta redukcji ulegaj
ą
jony miedzi z Cu
2+
do Cu
+
. Odczynnik Benedicta zawiera CuSO
4
,
cytrynian trisodowy i NaCO
3
. Cytrynian zapobiega wytr
ą
caniu si
ę
osadu Cu(OH)
2
, co mo
Ŝ
e mie
ć
miejsce
przy małym st
ęŜ
eniu cukru. Zalkalizowanie za pomoc
ą
Na
2
CO
3
, a nie za pomoc
ą
NaOH powoduje,
Ŝ
e
reakcja przebiega w pH nieco ni
Ŝ
szym ni
Ŝ
w próbie Fehlinga, w zwi
ą
zku z tym jony Cu
2+
nie s
ą
w tych
warunkach redukowane przez szereg zwi
ą
zków daj
ą
cych dodatni odczyn Fehlinga (kreatynina, kwas
moczowy). Reakcja Benedicta jest wi
ę
c bardziej specyficzna dla cukrów ni
Ŝ
odczyn Fehlinga.
odczynniki: 0,5% glukoza, 0,5% maltoza, 0,5% laktoza, 0,5% sacharoza, odczynnik Benedicta.
sprz
ę
t
: 4 probówki szklane długie, ła
ź
nia wodna, worteks, stoper, pipety automatyczne
wykonanie
: do czterech probówek odpipetowa
ć
po 1 ml odczynnika Benedicta. Do ka
Ŝ
dej z nich
doda
ć
po kilka kropli odpowiedniego roztworu cukru, wymiesza
ć
i wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni
wodnej na 3 min. Po ozi
ę
bieniu wytr
ą
ca si
ę
pomara
ń
czowoczerwony osad Cu
2
O.
2. Hydroliza sacharozy
Sacharoza jest disacharydem składa si
ę
z cz
ą
steczki
α
-glukopiranozy i cz
ą
steczki
β
-fruktofuranozy. Pod
wpływem kationów H
+
i podwy
Ŝ
szonej temperatury sacharoza rozpada si
ę
na monosacharydy (glukoz
ę
i fruktoz
ę
)
odczynniki
: 0,5% sacharoza, 2 M HCl, 2 M NaOH
sprz
ę
t
: 3 probówki szklane długie, ła
ź
nia wodna, worteks, stoper, pipety automatyczne
wykonanie
: w probówce umie
ś
ci
ć
2 ml roztworu sacharozy, doda
ć
0,6 ml 2M roztworu HCl,
wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej na 10 min. Po ochłodzeniu zoboj
ę
tni
ć
dodaj
ą
c 0,8 ml 2 M
roztworu NaOH.
Na zoboj
ę
tnionym hydrolizacie przeprowadzi
ć
reakcje Benedicta i Seliwanowa.
3. Analiza jako
ś
ciowa polisacharydów (reakcja z jodem)
Skrobia składa si
ę
z dwóch wielocukrów: amylozy i amylopektyny, które s
ą
zbudowane z poł
ą
czonych reszt
α
-D-glukopiranozy. Amyloza tworzy ła
ń
cuchy proste, w których cz
ą
steczki glukozy poł
ą
czone s
ą
ze sob
ą
wi
ą
zaniem
α
(1-4)-glikozydowym. Natomiast amylopektyna charakteryzuje si
ę
budow
ą
rozgał
ę
zion
ą
; oprócz
wi
ą
zania
α
(1-4) co 25-30 reszt glukozowych w głównym la
ń
cuchu wyst
ę
puj
ą
wi
ą
zania
α
(1-6), tworz
ą
ce
punkty rozgał
ę
zienia. W tych miejscach formuj
ą
si
ę
ła
ń
cuchy boczne zbudowane z 30-50 reszt
glukozowych. Z budowy wynikaj
ą
odmienne wła
ś
ciwo
ś
ci fizyczne obu wielocukrów. Amyloza barwi si
ę
jodem na kolor niebieski, a amylopektyna na fioletowy. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest zdolna do
tworzenia kompleksów z jodem. Aby cz
ą
steczki jodu mogły si
ę
wi
ą
za
ć
z cz
ą
steczk
ą
wielocukru musi ona
1
przyj
ąć
konfiguracj
ę
helisy, w której cz
ą
steczki jodu regularnie si
ę
rozło
Ŝą
. Jedna cz
ą
steczka jodu przypada
wówczas na sze
ść
reszt glukozowych, czyli na jeden skr
ę
t helisy.
Glikogen podobnie jak skrobia zbudowany jest z
α
-D-glukopiranozy. W porównaniu ze skrobi
ą
składa si
ę
on z wi
ę
kszej liczby monomerów i tworzy bardziej rozgał
ę
zion
ą
helis
ę
. Rozgał
ę
zienia wyst
ę
puj
ą
w ła
ń
cuchu
przeci
ę
tnie, co dziesi
ęć
reszt glukozowych i zbudowane s
ą
z 10 – 20 monomerów glukozy.
Skrobia tworzy z jodem poł
ą
czenie fioletowo-niebieskie, za
ś
w przypadku glikogenu barwa pozostaje
brunatna.
odczynniki
: 1% kleik skrobiowy, 1% glikogen, płyn Lugola
sprz
ę
t
: 2 probówki długie, pipety automatyczne
wykonanie
: do jednej probówki wla
ć
2 ml roztworu skrobi, a do drugiej 2 ml roztworu glikogenu.
Do obu probówek doda
ć
po 1 kropli silnie rozcie
ń
czonego roztworu jodu w jodku potasu (płyn
Lugola – barwa słomkowa)
4. Wpływ temperatury na reakcj
ę
skrobi i glikogenu z jodem
Barwa skrobi i glikogenu z jodem jest trwała w temperaturze pokojowej. Ogrzewanie powoduje rozkr
ę
cenie
si
ę
heliksu, adsorpcja jodu nie jest mo
Ŝ
liwa, w efekcie zabarwienie znika. Jest to zjawisko odwracane.
sprz
ę
t
: ła
ź
nia wodna
wykonanie
: probówki z poprzedniego
ć
wiczenia zawieraj
ą
ce skrobi
ę
i glikogen, zabarwione
jodem, ogrza
ć
do wrzenia. Barwa zanika. Powraca ona po ozi
ę
bieniu probówek w strumieniu
zimnej wody.
5. Wpływ pH na hydroliz
ę
skrobi
Podczas hydrolizy skrobia ulega rozpadowi na prostsze cukrowce, w
ś
ród których mo
Ŝ
na wyró
Ŝ
ni
ć
nast
ę
puj
ą
ce stadia po
ś
rednie:
1)
stadium dekstryn (polisacharydy), w
ś
ród których wyró
Ŝ
nia si
ę
kolejno: amylodekstryny barwiace
si
ę
jodem na kolor niebiesko-fioletowy, erytrodekstryny barwi
ą
ce si
ę
jodem na kolor brunatno-
czerwony, achrodekstryny nie daj
ą
ce z jodem zabarwienia
2)
stadium maltozy i izomaltozy (disacharydy)
3)
stadium glukozy (monosacharyd)
odczynniki: płyn Lugola, odczynnik Benedicta, 2 M NaOH, 1% kleik skrobiowy, 1 M H
2
SO
4
,
sprz
ę
t
: 20 probówek szklanych długich, statyw, erlenmayerka, cylinder miarowy, ła
ź
nia wodna,
pipety, stoper
wykonanie
: przygotowa
ć
20 probówek, ustawiaj
ą
c je w statywie w dwóch szeregach. Do jednego
szeregu probówek doda
ć
do ka
Ŝ
dej po 5 kropli rozcie
ń
czonego roztworu jodu w jodku potasu
(płyn Lugola), a do drugiego szeregu po 1,5 ml 2 M roztworu NaOH. Do erlenmayerki odmierzy
ć
30 ml 1% roztworu kleiku skrobiowego i doda
ć
20 ml 1 M H
2
SO
4
; wymiesza
ć
i pobra
ć
2 ml płynu
do pierwszej probówki z płynem Lugola i 2 ml płynu do pierwszej probówki z roztworem NaOH.
Zawarto
ść
erlenmayerki ogrzewa
ć
we wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej; co 2 minuty pobiera
ć
po 2 ml płynu
i rozlewa
ć
do uprzednio przygotowanych probówek, zawieraj
ą
cych płyn Lugola i roztwór NaOH.
Hydroliz
ę
prowadzi
ć
do czasu a
Ŝ
barwa z jodem zaniknie. Do szeregu probówek z roztworem
NaOH doda
ć
po 1 ml odczynnika Benedicta i gotowa
ć
przez 2 min w ła
ź
ni wodnej. Obserwuj
ą
c
zmiany barwy wyró
Ŝ
ni
ć
stadia hydrolizy skrobi. Okre
ś
li
ć
etap, w którym pojawiaj
ą
si
ę
cukry
redukuj
ą
ce.
6. Reakcja celulozy z jodem
Zwarta struktura włókien celulozowych uniemo
Ŝ
liwia trwał
ą
adsorpcj
ę
jodu. Pod wpływem jodu
pierwiastkowego włókna celulozowe barwi
ą
si
ę
na kolor
Ŝ
ółtobrunatny, natomiast silnie p
ę
czniej
ą
w obecno
ś
ci kwasu siarkowego, co umo
Ŝ
liwia wnikanie drobin jodu do wn
ę
trza micelli i jego adsorpcj
ę
na
cz
ą
steczkach celulozy. Powstaje wówczas intensywna barwa niebieska.
odczynniki: H
2
O dest., 60% H
2
SO
4
, płyn Lugola, lignina
sprz
ę
t
: 2 szkiełka zegarkowe, pipety automatyczne, stoper
wykonanie
: na dwóch szkiełkach zegarkowych umie
ś
ci
ć
skrawki ligniny. Jeden z nich zwil
Ŝ
y
ć
5
ml wody destylowanej, a drugi 5 ml 60% roztworu H
2
SO
4
. Po upływie 2 minut oba skrawki
zabarwi
ć
płynem Lugola.
2
Odczynniki:
0,5% glukoza, 0,5% maltoza, 0,5% laktoza, 0,5% sacharoza, 1% glikogen, 1% kleik skrobiowy, 2 M HCl,
2 M NaOH, 1 M H
2
SO
4
, 60% H
2
SO
4
, płyn Lugola, odczynnik Benedicta
3