W
YSOKOSPRAWNA
C
HROMATOGRAFIA
C
IECZOWA
materiały do ćwiczeń seminaryjno-
laboratoryjnych z HPLC
G
d
a
ń
s
k
W
YSOKOSPRAWNA
C
HROMATOGRAFIA
C
IECZOWA
materiały do ćwiczeń seminaryjno-
laboratoryjnych z HPLC
G
d
a
ń
s
k
SPIS TRE
Ś
CI
Ć
wiczenie 1
Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych.
Dr in
Ŝ
. B. Makuch, mgr in
Ŝ
. J. Wilga
Ć
wiczenie 2
Walidacja metodyki analitycznej.
Dr M.
Ś
lebioda
Ć
wiczenie 3
Rozwi
ą
zywanie problemów chromatograficznych – problemy zwi
ą
zane z
dozowaniem próbki, kolumn
ą
, detektorem; dobór warunków rozdzielania w
układzie NP.-HPLC; chromatografia
Ŝ
elowa w zastosowaniu do oznaczania
rozkładu masy molekularnej polimerów.
Prof. dr hab. in
Ŝ
. M. Kami
ń
ski, mgr in
Ŝ
. E. Gilgenast
Ć
wiczenie 4
Analiza jako
ś
ciowa i ilo
ś
ciowa zwi
ą
zków w próbkach (HPLC-DAD-MS).
Dr in
Ŝ
. A. Kot-Wasik
Ć
wiczenie 5
Oznaczanie anionów/kationów z wykorzystaniem chromatografii jonowej.
Prof. dr hab. in
Ŝ
. B. Zygmunt
Ć
wiczenie 6
Oznaczanie anionów nieorganicznych w wodach ró
Ŝ
nego pochodzenia z
wykorzystaniem izotachoforezy.
Mgr in
Ŝ
. J. Curyło, prof. dr hab. in
Ŝ
. W. Wardencki
Niniejsze materiały powstały dzi
ę
ki współpracy
wielu współpracowników i doktorantów
Katedry Chemii Analitycznej
oraz osób z ni
ą
zaprzja
ź
nionych.
Wszystkim serdecznie dzi
ę
kuj
ę
za pomoc w przygotowaniu
niniejszego kompendium.
Agata Kot-Wasik
ĆWICZENIE 1
D
OBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH
Dr in
Ŝ
. B. Makuch, mgr in
Ŝ
. J. Wilga
Pani Bogumiła Makuch jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pani Joanna Wilga jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;
jawil@wp.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie
faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.
Rysunek 1. Li
ś
cie Ginkgo bilobae
JuŜ przed wiekami odkryto, Ŝe liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki
flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają
pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krąŜenia krwi, a takŜe w zaburzeniach pracy mózgu
spowodowanych zaburzeniami krąŜenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią
obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.
Ekstrakty roślinne są złoŜonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie róŜniących się
właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania moŜe być procesem trudnym i
pracochłonnym. Na ogół bywa, Ŝe nie jest moŜliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład
fazy ruchomej) i naleŜy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej).
Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii
Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i moŜna zaryzykować stwierdzenie, Ŝ e90%
wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP – 18
tzn. Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.
W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:
a – zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,
b – zmianą pH fazy ruchomej,
c- zastosowanie pary jonowej,
e – zmiana typu fazy ruchomej.
W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <
iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 – ry rozpuszczalniki w
róŜnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być
regulowane składem fazy ruchomej.
Podstawowa zaleŜność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniŜa
wartość współczynnika retencji (k).
Bywają takie problemy rozdzielcze, które moŜna rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie
ruchomej; moŜna np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy załoŜeniu stałej siły elucyjnej fazy
ruchomej korzysta się z prostej zaleŜności:
S
T
=
ΣΣΣΣ
S
i
θθθθ
i
gdzie:
S
T
– całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,
S
i
– siła elucyjna rozpuszczalnika
θ
i – udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.
Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H
2
O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą
siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyŜszej zaleŜności otrzymując:
S
T
= S
MeOH
θθθθ
+ S
H2O
θθθθ
= 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82
Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy załoŜeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to
obliczenie jest następujące:
1,82 = 4,5 x X + 0 x X
→
ok. 40
czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).
Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadku
rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku
rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost
współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko
opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.
W układach RP mogą być stosowane równieŜ inne typy faz stacjonarnych np. RP – 8, rzadziej RP
– 2, jak równieŜ Ŝel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W kaŜdym przypadku kolejność elucji
jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje
niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zaleŜny od długości
łańcucha fazy związanej z Ŝelem krzemionkowym.
WYKONANIE ĆWICZENIA
W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie
Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.
Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali
λ
= 330 nm.
Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:
-
LiChrospher RP-18
-
Kolumna cyjanowa
Wykorzystywane fazy ruchome:
-
MeOH : H
2
O (7:3 v/v)
-
MeOH : H
2
O (9:3 v/v)
-
MeOH: H
2
O (7:3 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(1%)
-
THF:H
2
O (4:6 v/v)
-
THF:H
2
O (4:6 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(1%)
-
MeOH: H
2
O (7:3 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(0,1%)
-
THF:H
2
O (4:6 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(0,1%)
Parametry aparatury
•
Detektor UV/DAD L – 7450 firmy Merck HITACHI
•
Pętla dozująca 20
µ
l
•
Dozownik Rheodyne 7125
•
Pompa L – 6200 firmy Merck HITACHI
Notatki własne
ĆWICZENIE 2
W
ALIDACJA METODYKI ANALITYCZNEJ
Dr M.
Ś
lebioda
Pan Marek Ślebioda jest pracownikiem Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.
ul. Puławska 303, 02-785 Warszawa;
www.perlan.com.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie uczestników z moŜliwością automatyzacji przygotowania, wykonania i
opracowania testów związanych z walidacją metody chromatograficznej. Przeprowadzone zostanie
wyznaczenia granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) kilku związków zawartych w
mieszaninie w oparciu o metodę krzywej wzorcowej. Ogólny opis wymagań dotyczących walidacji metod
chromatograficznych moŜna znaleźć w odpowiednich artykułach ciał normalizujących ten proces. Skrót
zawarty jest w publikacji [1].
Podstawowe definicje
Granica wykrywalności jest zdefiniowana jako ilość (lub stęŜenie) analitu dająca odpowiedz y
DL
znacząco róŜną
(trzy odchylenia standardowe s
B
) od szumu tła y
B
:
(1)
B
B
DL
s
y
y
3
=
−
Pomimo moŜliwosci zastosowania obliczeń elektronicznych bezpośredni pomiar y
B
oraz s
B
jest zwykle w metodach
chromatograficznych niedogodny i niedokładny ze względu na małe wielkości mierzone. Wartość s
B
moŜe być
zastąpiona przez oszacowanie błędu standardowego s
e
z krzywej regresji ilość analitu względem
odpowiedzi:
(2)
(
)
η
−
−
=
n
y
y
s
est
obs
e
2
gdzie
y
obs
jest wartością obserwowaną
y
est
jest wartością obliczoną z krzywej kalibracyjnej
n jest liczbą punktów kalibracyjnych
η
dla regresji liniowej wynosi 2
W punkcie odpowiadającym granicy wykrywalności y
DL
= A·C
DL
+ y
B
, gdzie C
DL
jest ilością analitu odpowiadającą
granicy wykrywalności oraz A jest czułością analityczna (nachyleniem prostej regresji). Łącząc
te równania otrzymuje się:
(3)
A
s
C
e
DL
3
=
Jako granicę oznaczalności moŜna uwaŜać najmniejszą ilość analitu, która daje się oznaczyć z wystarczającą
precyzją (dziesięć odchyleń standardowych s
B
). Stosując oszacowanie błędu na podstawie linii regresji moŜna ją
obliczyć jako:
(4)
A
s
C
e
QL
10
=
Program obliczeniowy
Do projektowania walidacji, zbierania danych i wykonania obliczeń zastosowany zostanie automatyczny program
obliczeniowy Method Validation Pack [i] współpracujący z programem sterującym chromatografem. Po zebraniu
danych i ich ocenie moŜna w programie Method Validation Pack wygenerować automatycznie raport końcowy
zawierający wyniki analizy statystycznej. Dostępne w programie wzorce walidacji pozwalają na szybką
konfigurację testów zgodnie z zaleceniami ICH Q2A/2B, USP, EP, DIN oraz FDA. Istnieje moŜliwość dołączenia
do raportu z walidacji elektronicznych wersji standardowych procedur operacyjnych oraz innych dokumentów
związanych z procesem walidacji. Sposób działania programu przedstawiony jest schematycznie na rysunku 1.
Rysunek 1. Wymiana informacji w programie Method Validation Pack
Sprz
ę
t i odczynniki
Aparatura
•
Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej składający się z pompy gradientowej, automatycznego
podajnika próbek, termostatu kolumn i detektora UV-Vis [2].
•
Kolumna chromatograficzna ZORBAX Eclipse XDB-C8, dp=5µm, 4.6x150mm [3].
•
Zestaw sterujący zawierający programy ChemStation [4], ChemStore [5] oraz Method Validation Pack [6].
Odczynniki
•
Metanol, do HPLC
•
Woda, Mili-Q
•
Próbka testowa „Isocratic standard” [7] zawierająca 0.15%w/w ftalanu dimetylowego, 0.15%w/w ftalanu
dietylowego, 0.01%w/w bifenylu i 0.03%w/w orto-terfenylu w metanolu.
Metoda analityczna
Oznaczenia zostaną przeprowadzone przy pomocy izokratycznej metody chromatograficznej z detekcją UV-Vis.
•
Faza ruchoma:
metanol + woda (80+30)v/v
•
Przepływ fazy ruchomej:
1.5 ml/min
•
Temperatura:
25ºC
•
Objętość próbki:
5 µl
•
Detekcja:
254/10 nm (jednowiązkowa)
Przebieg
ć
wiczenia
Planowanie walidacji
Zakres badań, jakie podejmuje laboratorium w trakcie walidacji nowej, zmodyfikowanej lub nie stosowanej
dotychczas metody, zaleŜy od istniejącego statusu metody i kompetencji laboratorium. W trakcie walidacji metody
trzeba zdefiniować parametry, granice akceptacji i częstotliwość rutynowych testów przystawalności lub bieŜącej
kontroli jakości analitycznej metody. NaleŜy takŜe określić kryteria wskazujące, kiedy metoda jest poza granica
kontroli statystycznej. Laboratorium prowadzące walidacje metody powinno w pełni udokumentować kompletność
procesu walidacji.
W trakcie ćwiczenia pokazany zostanie sposób dołączania elektronicznych wersji dokumentów do raportu z
walidacji generowanego przez program Method Validation Pack. Jako przykładowy dokument zostanie uŜyty opis
metody chromatograficznej wydrukowany z programu sterującego ChemStation do pliku w formacie pdf.
Identyfikacja pików chromatograficznych
Podstawą działania programu Method Validation Pack jest rozpoznanie pików chromatograficznych związków, dla
których mają być prowadzone testy walidacyjne. W tym celu zostanie przeprowadzona analiza wzorca o
najmniejszym stęŜeniu (wzorzec 1). Chromatogram z tej analizy będzie podstawą do ustalenia parametrów integracji
i identyfikacji pików chromatograficznych. Szczegółowe instrukcje dotyczące sprzętu i programu poda prowadzący
ćwiczenie.
•
NaleŜy uruchomić program ChemStation bez podłączenia do bazy danych:
•
Następnie naleŜy wczytać metodę chromatograficzą MV_lab.m, wypełnić dane dotyczące próbki wpisując
katalog Grupa_x i nazwę pliku danych Test_x (gdzie x jest numerem grupy ćwiczeniowej).
•
Otrzymany chromatogram powinien być zbliŜony do przedstawionego na rysunku 2.
min
1
2
3
4
5
6
mAU
0
20
40
60
80
100
DAD1 A, Sig=254,4 Ref =550,100 (DEMO\005-0101.D)
0
.7
4
7
1
.0
2
1
2
.5
6
5
5
.8
3
7
Rysunek 2. Typowy chromatogram próbki „isocratic standard”
•
NaleŜy przeprowadzić automatyczny dobór parametrów integracji pików chromatograficznych
Ze wzgl
ę
du na ramy czasowe, w trakcie
ć
wiczenia nie b
ę
d
ą
omawiane sposoby doboru parametrów integracji
i ich wpływ na wyniki ilo
ś
ciowe oznaczenia.
•
Do tabeli kalibracyjnej trzeba wprowadzić nazwy związków i odpowiadające im ilości.
•
Na koniec naleŜy zapisać metodę chromatograficzną pod zmienioną nazwą: File -> Save as... -> Method ->
Grupa_x.m
Utworzenie pliku walidacji w programie Method Validation Pack
Przygotowanie testów walidacyjnych oraz dokumentacji zostanie wykonane w programie Method Validation Pack.
PoniŜej opisane są skrótowo niezbędne kroki. Dokładnych wskazówek udzieli prowadzący ćwiczenie.
•
NaleŜy uruchomić program Method Validation Pack podłączając się do bazy danych MV_lab.mdb jako
uŜytkownik admin (hasło admin).
•
W następnym kroku trzeba utworzyć nową walidację Grupa_x
•
Zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji moŜna zmienić jej parametry ogólne. Po pierwsze naleŜy
ustalić, czy wymagany jest podpis elektroniczny zgodnie z normą 21CFR 11? W ramach ćwiczeń to wymaganie
nie będzie stosowane.
•
Do projektu walidacji zostanie dołączony przykładowy dokument zewnętrzny (parametry metody
chromatograficznej wyeksportowane z programu ChemStation). W rzeczywistości powinny to być odpowiednie
dokumenty związane z walidacją, takie jak opis projektu, standardowe procedury operacyjne i inne. Program
Method Validation Pack dołączy je automatycznie do raportu końcowego i będzie przechowywał elektronicznie
powiązania dokumentów. W tym celu naleŜy wybrać kolejno opcje: External Documents -> Add i wybrać z
katalogu Hpchem / 1 /Temp dokument Metoda.pdf.
•
Parametry testów statystycznych stosowanych podczas walidacji moŜna dostosować wybierając opcję
Configuration i odpowiednią zakładkę. W trakcie ćwiczenia będą uŜywane ustawienia domyślne.
•
W oknie dialogowym Properties moŜna równieŜ wpisać domyślne nagłówki, które będą obowiązywały dla
całej walidacji, wybierając opcję Default Header Data.
W
ę
zły walidacji
Węzłami walidacji są nazwy związków obecnych w analizowanej mieszaninie, do których będą przyporządkowane
testy walidacyjne. Uwaga: nazwy węzłów muszą ściśle odpowiadać nazwom związków w tabeli kalibracyjnej
walidowanej metody zadeklarowanym poprzednio w programie ChemStation.
•
Węzeł moŜna utworzyć zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji i wybierając opcję Add
Component...
•
Po wpisaniu nazwy węzła trzeba wybrać rodzaj testu walidacyjnego, czyli w tym ćwiczeniu Limit of detection /
quantitation
•
W kolejnych krokach moŜna dodać następne węzły.
•
Szczegółowe planowanie kaŜdego testu moŜna rozpocząć po zaznaczeniu tego testu prawym okiem myszy i
wybraniu opcji Planning. W czasie ćwiczenia instruktor zasugeruje sposób wypełnienia pojawiającej się tablicy
dialogowej.
Ustawienia globalne
Przed przystąpieniem do eksportowania zadań z programu Method Validation Pack do programu ChemStation
sterującego sprzętem dobrze jest sprawdzić i skorygować ustawienia globalne dotyczące sposobu traktowania
danych źródłowych oraz wyglądu raportu.
•
Wybierając menu rozwijalne Utilities -> Options oraz odpowiednie zakładki moŜna edytować ogólny sposób
działania programu Method Validation Pack. W trakcie ćwiczenia zostanie sprawdzony i odpowiednio
ustawiony sposób traktowania danych źródłowych w zakładce C/S (ChemStore).
Eksport badania do bazy danych
Ostatnim zadaniem podczas planowania walidacji jest eksport zadań do bazy danych, z której mogą być w
dogodnym czasie wczytane do programu ChemStation.
•
Po wybraniu opcji Create Study and MVS for ChemStation Plus w polu MVS Status uruchomiony zostanie
kreator eksportu badania. Odpowiednie kroki działania tego kreatora zostaną omówione w czasie ćwiczenia.
Import zadania do programu ChemStation
Przed rozpoczęciem wczytywania zadania do programu sterującego ChemStation uŜytkownik tego programu musi
być podłączony do odpowiedniej bazy danych.
•
W programie ChemStation naleŜy wybrać Database Logon... , wybrać bazę danych MV_lab i wpisać hasło
•
Po podłączeniu do bazy danych moŜna przeprowadzić import sekwencji wygenerowanej w programie Method
Validation Pack
•
Sekwencja jest wykonywana w programie ChemStation, a wyniki są zapisywane w bazie danych.
Import danych do programu Method Validation Pack
Program Method Validation Pack moŜe pobierać wyniki oznaczeń z danych programu ChemStation, importować je
z róŜnych formatów plików oraz mogą one być wprowadzane ręcznie.
W trakcie ćwiczenia zostanie przeprowadzony:
•
Import danych uzyskanych po wykonaniu sekwencji w programie ChemStation
•
Import danych z pliku w formacie Excel
•
Ręczne uzupełnienie danych
Szczegóły poda prowadzący ćwiczenia
Raport z walidacji metody
W ramach ćwiczenia zostanie pokazany sposób generowania ogólnego lub częściowego raportu z walidacji metody
w programie Method Validation Pack
Literatura
1.
M. Ślebioda, Walidacja metod chromatograficznych, Perlan Technologies (2004)
2.
Agilent Technologies Inc., numer produktu G2184AA
3.
Agilent Technologies Inc., seria 1100
4.
Agilent Technologies Inc., numer produktu 993967-906
5.
Agilent Technologies Inc., numer produktu G2070AA
6.
Agilent Technologies Inc., numer produktu G2181BA
7.
Agilent Technologies Inc., numer produktu 01080-68704
Notatki własne
ĆWICZENIE 3
R
OZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW CHROMATOGRAFICZNYCH
–
PROBLEMY
ZWIĄZANE Z DOZOWANIEM PRÓBKI
,
KOLUMNĄ
,
DETEKTOREM
;
DOBÓR
WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE
NP- HPLC;
C
HROMATOGRAFIA śELOWA W ZASTOSOWANIU DO OZNACZANIA
ROZKŁADU MASY MOLEKULARNEJ POLIMERÓW
Prof. dr hab. in
Ŝ
. M. Kami
ń
ski, mgr in
Ŝ
. E. Gilgenast
Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
mknkj@wp.pl
Pani Ewelina Gilgenast jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby
rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji
gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;
metodyka zastosowania chromatografii Ŝelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej
polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.
Streszczenie przebiegu ćwiczenia
1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /
eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:
-
doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,
-
dozowania bardzo małych i bardzo duŜych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego
rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,
-
doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najwaŜniejszych
detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),
-
problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /
minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w
cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów
proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, „demiksja”
składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się
składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.
2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów
zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i
średnio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu
zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. „czystości
pików”;
3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii Ŝelowej do oznaczenia rozkładu masy
molekularnej polimeru - kalibracja „nisko-dyspersyjnymi” standardami polimeru, a następnie oznaczenie
rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy
styropianowej).
4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w
warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji – przykład
preparatywnego zastosowania HPLC w skali „modelowej”.
Materiały, aparatura, oprogramowanie
Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo – tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),
acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości „do HPLC” („HPLC grade”), albo „do elucji gradientowej”
(„gradient grade”);
Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, „przeprowadzony”
do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-
heksane o stęŜeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stęŜeniach ok. 0.1 g/ml.
Aparatura i wyposaŜenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK – HITACHI serii LaChrom
(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN – 100 7 um, termostat kolumny,
detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie „HSM”; B) Chromatograf
cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy
zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem spręŜonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z
dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)
Chromatograf cieczowy serii „Elite” MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie
rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.
Przydatne w praktyce zaleŜności obliczeniowe
1.
Rozdzielczość (R
S
) - uzaleŜnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności
układu chromatograficznego i jest wyraŜona następującym równaniem:
2
2
1
1
4
k
k
N
R
S
+
−
=
α
α
2.
Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:
2
2
/
1
)
(
54
,
5
l
S
L
H
C
=
2
2
/
1
)
(
54
,
5
S
l
H
L
N
C
=
=
a
b
As
=
1
,
0
0
t
L
u
C
=
•
Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezaleŜnie od
skali rozdzielania – równanie Knoxa
ν
ν
ν
C
A
B
h
teor
+
+
=
33
,
0
, gdzie
p
d
H
h
=
;
M
p
D
ud
=
ν
(dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)
Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do
obliczenia parametrów sprawności kolumny
Znaczenie symboli:
a, b – część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)
α
- współczynnik selektywności
As
0,1
– współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości
A, B, C – stałe dla konkretnej kolumny
D
M
– współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie
d
p
– średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny
h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej
H – wysokość wypełnienia równowaŜna półce teoretycznej
h
teor
– wartość h otrzymana z równania Knoxa
k
2
– współczynnik retencji substancji później eluowanej
l –
odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natęŜenia
przepływu eluentu)
L
C
– długość wypełnienia kolumny
N- liczba półek teoretycznych
R
S
– stopień rozdzielenia
S
1/2
– szerokość piku w ½ wysokości
t
0
– czas martwy kolumny
u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie
ν
- tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu
Uwagi i zalecenia
Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia takŜe dla przedyskutowania z
prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania
HPLC.
Literatura
1.
Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk
2004
2.
Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995
Notatki własne
ĆWICZENIE 4.
A
NALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI
HPLC-DAD-MS
dr in
Ŝ
. A. Kot-Wasik
Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
agata@chem.pg.gda.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie oznaczenia zawartości analitów z grupy WWA obecnych w
próbkach środowiskowych z wykorzystaniem techniki HPLC-DAD lub/i HPLC-DAD-MS.
Charakterystyka oznaczanych związków
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) zaliczane są do tzw. trwałych zanieczyszczeń
środowiska (ang. Persistant Organic Pollutant’s – POP’s) i charakteryzują się wysoką trwałością,
toksycznością, i zdolnością do kumulacji. Związków tych jest ponad sto, lecz z uwagi na ich szkodliwość,
oddziaływanie na człowieka oraz wielkość dostępnych informacji, najczęściej oznaczanych jest 16. Są to:
acenaften, acenaftylen, antracen, benzo(a)antracen, benzo(a)piren, benzo(e)piren, benzo(b)fluoranten,
benzo(j)fluoranten, benzo(k)fluoranten, benzo(g,h,i)perylen, chryzen, dibenzo(a,h)antracen, fluoranten,
fluoren, fenantren, naftalen, piren i indeno(1,2,3-cd)piren.
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne są związkami zawierającymi od 2 do 13
skondensowanych pierścieni aromatycznych. Związki te charakteryzują się płaską budową, gdyŜ atomy
węgla wchodzące w skład pierścieni znajdują się w stanie hybrydyzacji sp2. To powoduje, Ŝe układ
aromatyczny jest trwały a reakcje chemiczne i biochemiczne prowadzące do jego utraty zachodzą z
trudem.
W miarę wzrostu ilości pierścieni w cząsteczce rośnie takŜe stosunek C do H a co za tym idzie równieŜ
odporność cząsteczki na rozerwanie.
WWA wykazują zdolność do fluorescencji w zakresie promieniowania UV, co wynika z obecności
sprzęŜonych wiązań podwójnych między atomami węgla w pierścieniach.
Tabela 1. Charakterystyka wybranych zwi
ą
zków nale
Ŝ
ą
cych do grupy Wielopier
ś
cieniowych
W
ę
glowodorów Aromatycznych
Nazwa
Wzór sumaryczny
Masa
cząsteczkowa
Widmo (UV)
fl
u
o
re
n
C
13
H
10
166,2
fe
n
a
n
tr
en
C
14
H
10
178,2
a
n
tr
a
ce
n
C
14
H
10
178,2
p
ir
en
C
16
H
10
202,3
ch
ry
ze
n
C
18
H
12
228,3
b
en
zo
(a
)p
ir
en
C
20
H
12
252,3
Oznaczenie chromatograficzne zawartości WWA.
Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli
inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:
•
próbki wzorcowej, w której znane jest stęŜenie analitu;
•
próbki badanej.
W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych
związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.
Analiza jakościowa:
Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we
wzorcu
Na podstawie widma UV lub/i MS
Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch róŜnych długości fal
A
1
A
2
A
1
/A
2
= constans dla danego analitu
Analiza ilościowa
metoda wzorca zewnętrznego
W tym celu naleŜy przygotować szereg rozcieńczeń
analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i
wyznaczyć zaleŜność powierzchni piku od stęŜenia.
A następnie dokonać analizy chromatograficznej i
znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego
analitu, po czym obliczyć stęŜenie (z krzywej
kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji
A/C = A
x
/C
x
gdzie, C
x
= C*A
x
/ A )
Rys. Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji o st
ę
Ŝ
eniach 0.5, 1, 2.5 µg/mL.
metoda dodatku wzorca
Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilości (najkorzystniej znanej masy) substancji
oznaczanych (analitów) np. 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 i 0.5 mg/mL, zwykle jest to od 50 do 150% oczekiwanej
zawartości oznaczanej substancji. Na podstawie uzyskanych chromatogramów, wykreśla się krzywą
kalibracyjną, tj. zaleŜność powierzchni piku analitu w funkcji ilości analitu dodanej do próbki. Następnie
przeprowadza się graficzną ekstrapolację krzywej kalibracyjnej do punkt przecięcia z osią odciętych i
odczytuje się wartość Cx.
metoda wzorca wewnętrznego
metoda normalizacji
Warunki analizy chromatograficznej
Parametry
Szczegóły
Faza ruchoma
A: H
2
O
B: ACN:MeOH
Gradient
Time
% A
% B
Przepływ: 0.8 mL/min
0
25
75
8
0
100
15
0
100
Temperatura
25
o
C
Objętość nastrzyku
20 µL
Detekcja
250 nm, 260 nm, 265 nm, 295 nm
Kolumna
LiChrospher RP-18e (5
µ
m)
y = 129,47x - 3,6134
R
2
= 0,9998
0
100
200
300
400
500
600
700
0
1
2
3
4
5
6
St
ę
Ŝ
enie [C]
P
o
le
p
o
w
ie
rz
c
h
n
i
p
ik
u
[
A
]
Przebieg ćwiczenia:
Sporządzenie krzywych wzorcowych
Do sporządzenia serii rozcieńczeń poszczególnych związków w celu przygotowania krzywych
wzorcowych naleŜy wykorzystać wzorce o stęŜeniu 10µg/mL. Do fiolek o pojemności 1.5mL,
wyposaŜonych w plastikowe zakrętki z centrycznym otworem oraz uszczelkę teflonową dodać za pomocą
mikrostrzykawki szklanej odpowiednio: 500, 250, 100, 50, 25, 10µL metanolowego roztworu mieszaniny
wzorców, a następnie kaŜdą z fiolek uzupełnić do objętości 1mL za pomocą metanolu. Punkty
wyznaczające krzywe wzorcowe dla oznaczanych związków będą mieścić się w zakresie 0,1 - 5µg/mL.
Nastrzyknąć mieszaninę wzorcową (6 analitów) o najwyŜszym stęŜeniu;
Zidentyfikować związki;
Nastrzyknąć mieszaninę o niŜszym stęŜeniu;
Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stęŜenie na podstawie jednego punktu (z
analizy pierwszej);
Zastanowić się nad źródłami błędu;
Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywa kalibracyjną;
Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stęŜeniu traktując ją jako analizę próbki i policzyć stęŜenie na
podstawie dotąd otrzymanych wyników;
Zastanowić się nad źródłami błędów;
Uzupełnić krzywa kalibracyjna o kolejny punkt;
Powtórzyć schemat postępowania aŜ do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;
Oszacować granice wykrywalności/ oznaczalności
•
Z chromatogramu;
•
Z przedłuŜenia krzywej kalibracyjnej;
•
Z analizy kolejnych rozcieńczeń.
Wyznaczyć stęŜenie wybranych analitów w mieszaninie o nieznanym stęŜeniu.
Notatki własne
ĆWICZENIE 5
O
ZNACZANIE ANIONÓW
/
KATIONÓW Z WYKORZYSTANIEM
CHROMATOGRAFII JONOWEJ
.
Prof. dr hab. in
Ŝ
. B. Zygmunt
Pan Bogdan Zygmunt jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
tatry@chem.pg.gda.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie
Notatki własne
ĆWICZENIE 6.
O
ZNACZANIE ANIONÓW NIEORGANICZNYCH W WODACH RÓśNEGO
POCHODZENIA Z WYKORZYSTANIEM IZOTACHOFOREZY
.
mgr in
Ŝ
. J. Curyło, dr hab. in
Ŝ
. W. Wardencki
Pan Waldemar Wardencki jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pan Janusz Curyło jest jest doktorantem na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;
metanch4@wp.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie oznaczenia zawartości anionów w próbkach wody pitnej i
powierzchniowej przy uŜyciu techniki izotachoforezy.
Izotachoforeza
Izotachoforezą nazywamy proces rozdzielania jonów (kationów lub anionów), które w polu
elektrycznym przy zastosowaniu odpowiedniego elektrolitu wiodącego i kończącego formują się w strefy
według ich zmniejszającej się ruchliwości i poruszają z jednakową prędkością.
Zasada izotachoforezy
Podczas jednorazowej analizy techniką izotachoforezy mogą być rozdzielane tylko jony o tym
samym znaku (kationy lub aniony). Elektrolit podstawowy dobiera się w taki sposób aby kation lub anion
elektrolitu wiodącego (L) i terminującego(T) miał odpowiednio najwyŜszą i najniŜszą ruchliwość (µ) w
stosunku do badanych analitów. Tak więc wymogiem rozdzielania metodą izotachoforezy jest aby
µ
L
>µ
anality
>µ
T
.
W przypadku przeprowadzania izotachoforezy anionu postępuje się następująco: przestrzeń
anodową i kapilarę napełnia się elektrolitem wiodącym, którego anion jest bardzo ruchliwy, kation zaś
posiada duŜą pojemność buforową. Przestrzeń katodowa powinna zawierać elektrolit, którego anion ma
efektywną ruchliwość duŜo niŜszą od ruchliwości wszystkich składników analizowanej próbki. Elektrolit
nazywa się elektrolitem zatrzymującym, (terminującym), a jego jon terminatorem. Próbkę wprowadza się
przez dozownik pomiędzy elektrolit wiodący i elektrolit terminujący. Następnie do elektrod przykłada się
odpowiednie napięcie, w wyniku czego przepływa prąd. W układzie takim wprowadzone jony po
niedługim czasie układają się w szereg sąsiadujących ze sobą stref wg malejącej ruchliwości, po czym
całość wędruje z jednakową prędkością do odpowiedniej elektrody.
Przebieg procesu rozdzielania przedstawia rysunek rys. 1. Górna część rysunku (a) przedstawia
elektrolit wiodący (L), wprowadzoną próbkę (aniony A i B, dla których µ
A
>µ
B
) i elektrolit terminujący
(T). Na odciętej odłoŜone jest połoŜenie wewnątrz kapilary, a na rzędnej – stęŜenia składników. Kolejne
fragmenty rysunku obrazują stan rozdzielenia w następujących po sobie przedziałach czasowych.
Fragment (b) przedstawia strefę elektrolitu wiodącego przesuwającą się przez kapilarę w kierunku
przestrzeni anodowej. StęŜenie składnika B ustala się na wartość, która zgodnie z prawem Kohlrauscha
odpowiada stęŜeniu elektrolitu wiodącego
B
Q
B
Q
A
A
B
A
c
c
µ
µ
µ
µ
µ
µ
+
+
⋅
=
gdzie µ
A, B, R
– ruchliwości jonów A
-
, B
-
i przeciwjonu Q
+
⋅
s
V
cm
2
, c
A, B
– stęŜenia jonów A
-
, B
-
.
Trzecia część rysunku (c) obrazuje dalszy stan rozdzielenia. Strefa „czystego” składnika A
znacznie się zwiększa i dalej powstaje strefa czystego składnika B o stęŜeniu odpowiadającym
poprzedzającej strefie.
W ostatnim etapie rozdzielania (d) ustala się stan równowagi stęŜeń jonów w poszczególnych
strefach. W ten sposób kaŜdą strefę wewnątrz kapilary tworzy jeden rodzaj jonów, a stęŜenia w strefach
pozostają w równowadze zarówno ze strefą poprzedzającą jak i ze strefą elektrolitu wiodącego. StęŜenie
w strefie elektrolitu terminującego równieŜ powinno być stałe. W idealnych warunkach prowadzenia
pomiaru (niezmienna średnica kapilary, stały poziom elektrolitu wiodącego) długości poszczególnych
stref są juŜ dalej niezmienne. Strefy po osiągnięciu równowagi poruszają się ze stałą szybkością równą
szybkości poruszania się strefy wiodącej i stąd nazwa izotachoforeza, czyli elektroforeza przy stałym
poruszaniu się stref.
Rys. 1. Hipotetyczny model rozdzielania dwóch jonów metod
ą
izotachoforezy.
W praktyce opisany proces bywa zakłócany.
Dochodzi bowiem do przesuwania się stref, z dość
zdawałoby się błahych powodów, np. zmian pH
wskutek reakcji elektrodowych czy membranowych,
zmian temperatury, przenikania CO
2
przez teflonowe
ścianki
kapilary,
elektroosmozy
czy
wskutek
powstawania strumienia hydrodynamicznego.
Ze względu na to, Ŝe wszystkie strefy
posiadają róŜne efektywne ruchliwości jonów, w
kaŜdej z nich wytwarza się własny gradient potencjału, który ustala jednakową szybkość poruszania się
stref zgodnie z zaleŜnością
E
⋅
=
µ
ν
gdzie: ν – szybkość poruszania się strefy
s
cm
, –
efektywna ruchliwość jonów w strefie
⋅
s
V
cm
2
, E –
natęŜenie pola elektrycznego w strefie
cm
V
.
Rys.2. Model rozdzielania anionów (A, B, C,) metod
ą
izotachoforezy, temperatura (T), nat
ę
Ŝ
enie pola
elektrycznego (E) i opór w poszczególnych strefach (R),
Q – przeciwjon.
Gradient potencjału w kaŜdej pojedynczej strefie jest stały, ale wzrasta od jednej strefy do
drugiej. Przyrost gradientu potencjału wynika ze zmniejszających się ruchliwości jonów w kolejnych
strefach, zmniejszania się przewodnictwa tych stref (wzrostu oporu) oraz ze zmiany stęŜenia danego jonu
w rozpatrywanej strefie (rys. 2). Granice wytworzonych stref są niezwykle ostre, a to z powodu efektu
samokorygowania się układu izotachoforetycznego (rys. 3). JeŜeli wolniejszy jon A
przeniknąłby do
szybszej strefy L (tzn. o wyŜszej ruchliwości jonów) musiałby się w niej poruszać wolniej, gdyŜ w strefie
tej spadek potencjału jest niŜszy niŜ w strefie A, więc ruchliwość jonu A musiałaby być wyŜsza niŜ jest
faktycznie – i w tej sytuacji jon A automatycznie wraca do swojej strefy. Z drugiej strony, jeŜeli jon L
dostałby się drogą dyfuzji do następującej po niej strefy A, byłby on przeniesiony do strefy L na skutek
wyŜszego gradientu potencjału, jaki panuje w strefie A
.
Gdy w procesie analizy utrzymywany jest stały prąd, w wyniku istnienia róŜnych gradientów
potencjału poszczególnych stref, wytwarzają się w nich róŜne temperatury. Strefy posiadające jony o
wysokich ruchliwościach wytwarzają mniejsze ilości ciepła niŜ strefy o ruchliwościach niŜszych.
PoniewaŜ następujące po sobie strefy porządkują się z ich zmniejszającymi się ruchliwościami,
temperatura następujących po sobie stref wzrasta od jednej do drugiej strefy (rys. 3).
Rys. 3. Efekt samokorygowania si
ę
układu
izotachoforetycznego.
Detekcja
W technice izotachoforetycznej stosować
moŜna
zarówno
detekcję
bezkontaktową
i
kontaktową. Rysunek 4 przedstawia schematy
detektorów stosowanych w izotachoforezie.
Rys. 4. Detektory stosowane w izotachoforezie.
Dobór parametrów pracy
W procesie analizy izotachoforetycznej jony moŜna rozdzielić wtedy, gdy efektywne ruchliwości
kolejnych składników róŜnią się od siebie w wystarczający sposób. Efektywna ruchliwość jonów zaleŜy
od stopnia dysocjacji i wartości pK, a dodatkowo od temperatury i wartości pH, jakie wytwarzają się w
poszczególnych strefach podczas przebiegu procesu. Na efektywną ruchliwość jonów wpływają, choć w
znacznie mniejszym stopniu takie czynniki jak solwatacja, efekt relaksacji, promień i ładunek jonów,
stała dielektryczna oraz lepkość uŜytych rozpuszczalników. Rozdzielanie jonów moŜna przeprowadzić
róŜnymi sposobami.:
-
na zasadzie róŜnic w absolutnych ruchliwościach jonowych, wartość pH układu dobiera się tak,
aby wszystkie jony były całkowicie zdysocjowane.
-
wykorzystując róŜnice w wartościach pK składników, wartość pH układu dobiera się w taki
sposób, aby większość jonów nie była całkowicie zdysocjowana, a tym samym powiększa się
róŜnice w wartościach efektywnych ruchliwości jonów.
-
stosując zmianę rozpuszczalnika, zwykle z wody na metanol. Sposób ten bywa stosowany, jeŜeli
rozdzielane jony posiadają prawie jednakowe ruchliwości jonowe i niewiele róŜniące się od
siebie wartości pK
-
wykorzystując moŜliwość tworzenia przez rozdzielane jony związków kompleksowych z jonami
elektrolitu wiodącego.
Przykładowe elektrolity stosowane do rozdzielania kationów:
Jon wiodący
Przeciwjon
pH
Jon zatrzymujący
0,010 M HNO
3
-
1,9
0,01 M TRIS
0,010 M HCl
-
2,0
0,01 M LiCl
0,010 M k. sulfonowy
HCl
2,4
0,01 M LiCl
0,010 M KOH
k. askorbinowy
4,1
0,01 M LiCl
0,005 – 0,010 M
CH
3
COOK
k. octowy
4,0 – 5,5
0,01 M TRIS lub β- alanina
0,005 – 0,01 M KOH
k. kakodylowy
6,3 – 7,0
0,01 M kreatinina z dodatkiem 0,005 M HCl
do pH 5
0,01 M KOH
dijodotyrozyna
7,4
0,01 M TRIS
0,005 M Ba(OH)
2
glutamina
9,25
0,02 M trietylenodiamina
0,005 M Ba(OH)
2
0,015 M walina
9,9
0,02 M TRIS z dodatkiem HCl do pH 8,3
Przykładowe elektrolity stosowane do rozdzielania anionów:
Jon wiodący
Przeciwjon
pH
Jon zatrzymujący
0,005 M HCl
0,001 M NaCl
2,25
0,005 M k. bursztynowy lub 0,01 M k.
mrówkowy
0,007 M HCl
gliceryno-glicyna
2,9
0,005 M k. kapronowy
0,005 – 0,010 M HCl
β- alanina
3,0 – 4,2
0,01 M k. kapronowy
0,010 M HCl
histydyna
5,7 – 7,0
0,01 M k. kakodylowy lub k. kapronowy lub k.
fenylooctowy lub MES
0,010 M HCl
imidazol
7,4
0,005 k. askorbinowy
0,005 M gliceryno-glicyna
TRIS
8,4
0,01 M glicyna, Ba(OH)
2
, pH 9
0,010 M HCl
TRIS
8,50
0,01 M EPPS z TRIS, pH 8,5
0,005 – 0,010 M HCl
ammediol
8,4 – 9,6
0,005 – 0,010 M glicyna lub fenol lub β-
alanina
Analiza jako
ś
ciowa i ilo
ś
ciowa
Wynikiem analizy izotachoforetycznej jest wykres przedstawiający zmiany wartości sygnału
detektora w czasie – izotachoforegram. Rysunek 5 przedstawia przykładowy izotachoforegram
mieszaniny kationów uzyskany przy pomocy detektora konduktometrycznego.
Aby dokonać analizy jakościowej nieznanej próbki na podstawie uzyskanego izotachoforegramu
naleŜy zidentyfikować poszczególne strefy odpowiadające szukanym analitom. Na podstawie wysokości
(h) stref w stosunku do linii podstawowej (RSH – relative step height, RSH = h/H) i przez porównanie z
wzorcami analitów moŜliwe jest przeprowadzenie analizy jakościowej.
W oparciu o długość (L) zidentyfikowanych stref i
na
podstawie
wcześniej
sporządzonych
krzywych
kalibracyjnych
moŜemy
dokonać
analizy
ilościowej
badanych związków w próbce.
Ogólnie mówiąc wartość sygnału detektora dla danej
strefy (wysokość strefy - h) jest informacją jakościową, a
długość strefy (L) jest informacją ilościową.
Rys. 5. Przykładowy izotachoforegram mieszaniny kationów,
uzyskany za pomoc
ą
detektora konduktometrycznego.
Aparatura
1.
Zbiornik elektrolitu zatrzymującego (TE);
2.
Blok nastrzykowy, A, B, C pozycje
robocze pętli dozowniczej, w pozycji C
moŜliwy jest nastrzyk mikrostrzykawką;
3.
Kolumna wstępnego rozdzielania (160
mm
×
800
µ
m śr. wew.);
4.
Detektor koduktometryczny;
5.
Blok rozgałęziający;
6.
Blok zatrzymujący;
7.
Membrana półprzepuszczalna;
8.
Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE);
9.
Kolumna analityczna (160 mm
×
300
µ
m
śr. wew.);
10.
Detektor konduktometryczny
11.
Detektor UV;
12.
Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE);
13.
Membrana półprzepuszczalna;
LE/CE zasobniki z elektrolitem wiodącym dla
kolumny wstępnego rozdzielania i
analitycznej.
Rys. 6. Schemat izotachoforegrafu model ItaChrom EA 101.
Obsługa aparatu
Przygotowanie aparatu do pracy:
1.
Zmontować układ analityczny wg schematu na rys. 6
2.
Podłączyć przewody wysokiego napięcia
3.
Podłączyć detektory konduktometryczne
4.
Połączyć światłowodami detektor spektrofotometryczny z celką pomiarową
5.
Sprawdzić poprawność połączeń
6.
Przepłukać układ wodą dejonizowaną
7.
Ustawić zawór nastrzykowy w pozycję A
8.
Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 2 i kolumnę analityczną
9.
Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 1, blok buforujący i kolumnę wstępnego
rozdzielania
10.
Napełnić zbiornik elektrolitu zatrzymującego
11.
Usunąć z układu pęcherzyki powietrza
12.
Włączyć aparat
13.
Uruchomić program komputerowy sterujący aparatem
14.
Wprowadzić odpowiednią metodę analityczną
Po wykonaniu wyŜej wymienionych czynności aparat jest gotowy do pracy.
Przeprowadzanie analiz
1.
Sprawdzić poprawność przygotowania aparatu do pracy
2.
Analizowaną próbkę umieścić w strzykawce
3.
Wsunąć strzykawkę do dozownika, gdy zawór dozujący znajduję się w pozycji A
4.
Przekręcić zawór w pozycję C
5.
Zamknąć przezroczystą pokrywę aparatu
6.
Uruchomić analizę w programie komputerowym
7.
Do zakończenia analizy nie otwierać drzwiczek aparatu
8.
Po zakończeniu analizy przekręcić zawór dozujący w pozycję B na 1 s. i dalej w pozycję A
9.
Przepłukać i napełnić kolumny elektrolitem wiodącym zaczynając od kolumny analitycznej
(dolnej)
Aparat jest gotowy do kolejnej analizy.
Ć
wiczenie
Izotachoforetyczne oznaczanie anionów w wodach pitnych i powierzchniowych
Opis wykonania ćwiczenia:
1.
Zapoznać się z budową i zasadą działania aparatu do izotachoforezy
2.
Przygotować aparat do analizy uwzględniając uwagi prowadzącego zajęcia
3.
Wykonać pomiary dla roztworów wzorcowych poszczególnych anionów
4.
Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem jakościowym
5.
Przygotować roztwory kalibracyjne
6.
Wykonać pomiary dla roztworów kalibracyjnych
7.
Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem ilościowym i jakościowym.
8.
Sporządzić krzywe wzorcowe
9.
Wykonać analizę próbek rzeczywistych
10.
Określić zawartość poszczególnych jonów w próbkach rzeczywistych, wyciągnąć
wnioski z uzyskanych izotachoforegramów
Literatura
1.
S.-G. Hjalmarsson, A. Baldesten, A critical review of capillary isotachophoresis, Anal. Chem., July 1981, 261
352.
2.
I. Miedziak, A. Waksmundzki, Izotachoforeza, aparatura, zasada pomiaru i zastosowanie, Wiad. Chem., 2 (368)
1978, 71-92.
3.
STN 75 747430, Kvalita vody. Izotachoforeticke stanovenie chloridov, dusicanov, siranov, dusitanov, fluoridov a
fosforecanov vo vodach
4.
STN 75 7431, Kvalita vody. Izotachoforetickie stanovenie amoniaku, sodika, draslika, vaonika a horicika vo
vodach
5.
Noty aplikacyjne Villa Labeco
6.
M. Hutta, D. Kaniansky, E. Śimunićova, V. Zelenska, V. Madajova, A. Śiśkova, Solid phase extraction for sample
preparation i trace analysis of ionogenic compounds by capillary isotachophoresis, J. Radioanal. and Nuclear
Chemistry, 163 (1992) 1, 87-98
7.
F. M. Everaerts, J. l. Beckers, T. P. E. M. Verheggen, Isotahophoresis. Theory, Instrumentation and Applications,
J. Chrom. Library, Vol.6, 1976
8.
P. Boćek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, Analytical Isotachophoresis, VCH 1988
9.
http://www.pg.gda.pl/chem/Dydaktyka/Analityczna/
→
Techniki elektromigracyjne
Notatki własne
Wszelkie prawa zastrze
Ŝ
one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie cało
ś
ci lub fragmentów
niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo
Ŝ
e by
ć
powielany ani rozpowszechniany
za pomoc
ą
urz
ą
dze
ń
elektronicznych, mechanicznych, kopiuj
ą
cych, nagrywaj
ą
cych i innych bez
pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jak
ą
kolwiek metod
ą
powoduje
naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.