Ćwiczenie 4a

Opracował dr inż. Tadeusz Janiak

Ćwiczenie 5

Fluorymetryczne oznaczanie tryptofanu w białkach

(instrukcja poprawiona)

I Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się ze zjawiskiem fluorescencji. Student zapozna się

również z metodą fluorescencyjnego oznaczania zawartości tryptofanu w białkach. W czasie

ćwiczenia wykonuje się:

1. Widmo absorpcyjne tryptofanu
2. Widmo wzbudzenia tryptofanu
3. Widmo fluorescencyjne tryptofanu
4. Pomiar zależności intensywności fluorescencji od stężenia tryptofanu. Służy ono do
wyznaczania krzywej wzorcowej
5. Pomiar zależności intensywności fluorescencji białka (np. albuminy) od ilości dodanego
tryptofanu (wzorca wewnętrznego). Służy do oznaczenia zawartości tryptofanu w białku.

II Wstęp teoretyczny

Zjawisko fluorescencji polega na emisji promieniowania elektromagnetycznego

cząsteczek wzbudzonych elektronowo. Można je wyjaśnić w oparciu o diagram
przedstawiony na Rys. 1. Na diagramie przedstawiono, co dzieje się jeżeli cząsteczka związku
o

właściwościach

fluorescencyjnych

zostaje

naświetlona

promieniowaniem

elektromagnetycznym. Przy odpowiedniej długości fali cząsteczka ze stanu podstawowego S

zostaje przeniesiona do stanu wzbudzonego elektronowo i wibracyjnie S

’

(przejście 1).

Rys. 1 Diagram ilustrujący powstawanie fluorescencji (diagram Jabłońskiego)

Stan taki jest nietrwały i następuje utrata energii poprzez przejście na niższy poziom
wibracyjny S

(przejście 2). Pozostałej części energii cząsteczka pozbywa się emitując kwant

promieniowania i przechodzi ze wzbudzonego poziomu S

na poziom podstawowy S

Pomiary  fluorescencji  wykonuje  się  za  pomocą  fluorymetrów  lub  spektrofluorymetrów.
Pierwsze  z  nich  służą  do  pomiarów  punktowych,  drugie  dają  możliwość  ciągłego
„przemiatania”  promieniowania  wzbudzającego  i  promieniowania  emitowanego.  Schemat
spektrofluorymetru  przedstawiony  jest  na  Rys.  2.  Promieniowanie  elektromagnetyczne  z
odpowiedniego źródła światła (lampa) dostaje się do monochromatora M

(najczęściej siatka

dyfrakcyjna). Z monochromatora wiązka światła o zadanej długości przechodzi przez kuwetę
zawierającą substancję o właściwościach fluorescencyjnych. Monochromator emisyjny M

analizuje wiązkę światła, emitowanego przez wzbudzone cząsteczki, prostopadle do wiązki

światła wzbudzającego. Fluorescencja dla wydzielonej długości fali mierzona jest za pomocą
detektora natężenia promieniowania (najczęściej jest to fotopowielacz).
Rys. 2 Schemat poglądowy spektrofluorymetru.

Rodzaje widm fluorescencyjnych:
Widmo wzbudzenia
Monochromator emisyjny M

ustawiony jest na określoną długość fali w zakresie

fluorescencji,

natomiast

monochromator

wzbudzający

przemiata długością fali

promieniowania wzbudzającego
(λ

= constant, λ

wzb

zmienia się)

Widmo emisji
Monochromator wzbudzający M

ustawiony na określoną długość fali absorbowaną przez

próbkę, natomiast monochromator emisyjny przemiata i analizuje emitowane światło
(λ

wzb

= constant, λ

zmienia się)

Zastosowanie spektroskopii fluorescencyjnej

Bardzo niskie granice oznaczalności (do 10

-10

M) sprawiają, że metody fluorescencyjne

znajdują zastosowanie w dziedzinach takich jak:

1) Medycyna i analiza kliniczna –oznaczanie witamin, enzymów, hormonów, środków

dopingujących.

2) Farmacja –badania metabolizmu (barbiturany, amfetamina, LSD)

3) Biochemia – detekcja i oznaczanie śladów enzymów, koenzymów, lipidów, kwasów

nukleinowych, protein, chlorofilu

4) żywność – detekcja śladowych komponentów w produktach spożywczych

(aminokwasy, witaminy, proteiny, toksyny)

5) Środowisko –powietrze, woda i gleby (policykliczne węglowodory aromatyczne PAH,

aflatoksyny, PCB, fenole, pestycydy)

6) Analiza organiczna i nieorganiczna – oznaczanie wszelkich substancji fluoryzujących

Inne – detekcja w HPLC, sensory fluorescencyjne, badania fotochemiczne i fotofizyczne

stanów wzbudzonych, spektroskopia czasów życia - techniki impulsowe

Fluorymetryczne oznaczanie zawartości tryptofanu w białkach

Fluorescencyjne właściwości reszt tryptofanu są uzależnione od otoczenia chromoforu, w tym

przede wszystkim od lokalizacji w łańcuchu polipeptydowym oraz ładunku sąsiednich reszt

aminokwasowych. Analiza widm fluorescencji tryptofanu uzyskanych dla białek natywnych o

różnorodnej strukturze wykazała istnienie istotnych różnic dotyczących położenia maksimum

wzbudzenia, kwantowej wydajności fluorescencji oraz szerokości widma. Zjawisko to,

stanowiące poważne utrudnienie w praktycznym zastosowaniu metod fluorymetrycznych do

ilościowego oznaczania zawartości tryptofanu w białkach, można wyeliminować, poddając

badane białka uprzedniej denaturacji w 6 mol/l roztworze chlorowodorku guanidyny z

dodatkiem 2-merkaptoetanolu. Ponadto zastosowanie wewnętrznego standardu pozwala na

wykorzystanie omawianej metody do ilościowego oznaczania tryptofanu w białkach

zawierających ugrupowania pochłaniające w zakresie 290-370 nm, takie jak nukleotyd

flawinowy, hem lub fosforan pirydoksalu.

III Wykonanie ćwiczenia

A Wykonanie widma absorpcyjnego L-tryptofanu

1. Wykonać widmo absorpcyjne tryptofanu o stężeniu 0,5mM za pomocą przyrządu UV-VIS.

Perkin Elmer Lambda 40. Pomiar wykonać w kuwetach kwarcowych w zakresie długości fali

220-330 nm w sposób przedstawiony poniżej.

Uruchomić spektrofotometr, komputer oraz monitor przyciskami zasilania.

Jeżeli komputer wyświetli okienko do wprowadzenia hasła sieciowego, to kliknąć

myszą na przycisk Anuluj.
c)

Uruchomić program Lambda 40 ikoną na pulpicie lub poprzez Start-Programy-

Lambda 40-Lambda 40.
d)

Utilities-Configuration

ścieżce

Data

wpisać

C:\UVWINLAB\DATA\Lab i potwierdzić klikając myszą na przycisk OK.
e)

W oknie Methods uruchomić metodę Lab.

Sprawdzić ustawienie następujących parametrów: w zakładce Scan w polu Start

wavelength - 330 nm, w polu End wavelength - 220 nm. Pole Autosave - On, Autoprint - Off,
pole Display - Overlay. W, zakładce Inst. pole Ordinate mode - A, pola: LamUV i LampVis -
ON. W polu Scen speed -120 nm/min., a Smooth - O. W zakładce Sample w polu Result
Filename podać nazwę pliku, a w polu Number of Samples wpisać liczbę roztworów. W polu
Sample Identity wpisać nazwę kolejnych roztworów oraz ewentualnie ich opis w polu Sample
Info.
g)

Włożyć puste kuwety kwarcowe do obu uchwytów w komorze próbek. Matowe

ścianki  kuwet  muszą  być  skierowane  w  stronę  bocznych  ścianek  uchwytów.  Zamknąć
pokrywę  oraz  kliknąć  myszą  na  Autozero.  Pojawi  się  okno  Sample  Change  z  prośbą  o
umieszczenie  odnośnika  Blank.  Kliknąć  przycisk  OK.  Ponownie  wykonać  pomiar  linii
zerowej.
h)

Pobrać do jednej z kuwet kwarcowych 3 ml roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w

buforze fosforanowym pH=7 a do drugiej 3 ml roztworu buforowego fosforanowego pH=7.
Włożyć kuwetę z 3 ml 0,5 mM roztworu tryptofanu do uchwytu bliżej położonego a kuwetę
z odnośnikiem, roztwór buforu fosforanowego pH=7 do drugiego chwytu położonego dalej.
Kliknąć myszą na przycisk Start. Pojawi się okienko Sample Change z prośbą o umieszczenie
kolejnej próbki. Kliknąć myszą na przycisk OK. Zostanie zarejestrowane widmo absorpcyjne.
i)

Z menu View wybrać Vertical Cursor Cont. Pojawi się pionowa linia, która służy do

odczytywania długości fali oraz odpowiadającej jej absorbancji (na dole ekranu). Linię tę
przesuwa się wzdłuż widm za pomocą myszy. Znaleźć maksimum na krzywej absorpcji.
k)

Po zakończeniu pomiarów wyjść z programu przez File-Exit. Jeżeli wyświetli się

okno(a) z prośba o zapisanie metody lub danych to kliknąć na przyciski Cancel lub Exit
i)

Wyłączyć komputer i spektrofotometr.

B Pomiary fluoroscencyjne

Uwaga! Nie można dotykać palcami ścianek kuwety fluorescencyjnej gdyż

tłuszcz z opuszek spowoduje zmianę charakterystyki widm.

Pomiary widma fluorescencyjnego dla krzywej wzorcowej tryptofanu i dla

albuminy z wzorcem wewnętrznym (tryptofanem) wykonać dla takich samych

ustawień przyrządu (szczególnie ważne są szczeliny).

1. Pobrać do kuwety do fluorescencji 3 ml roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w

buforze fosforanowym pH=7 i umieścić w komorze spektrofluorymetru.

2. Wykonać widmo wzbudzenia pobranego roztworu stosując: wzbudzenie (excitation) w

zakresie 230-340 nm oraz emisję (emission) λ=354 nm.

3. Wykonać widmo fluorescencji tego samego roztworu stosując: wzbudzenie (excitation)

λ=295 nm oraz emisję (emission) w zakresie 320-420 nm.

4. Opróżnić kuwetę. Przemyć ją kilkakrotnie wodą dejonizowaną. Delikatnie usunąć całą

wodę. Przepłukać kuwetę alkoholem etylowym. Osuszyć ją ręcznikiem papierowym.

5. Pobrać 3 ml buforu fosforanowego do kuwety fluoroscencyjnej. Dodać, za pomocą

mikropipety lub mikrostrzykawki, 15 μl roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w buforze

fosforanowym pH=7. Wymieszać zawartość kuwety.

6. Wykonać widmo fluorescencji roztworu tryptofanu stosując: wzbudzenie (excitation)

λ=295 nm oraz emisję (emission) w zakresie 320-420 nm i odczytać, korzystając z kursora,

emisję dla długości fali λ=354 nm.

7. Dodać jeszcze 5 razy po 15 μl roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w buforze

fosforanowym pH=7. Po każdym dodaniu roztworu tryptofanu do kuwety zawartość jej

dobrze wymieszać i wykonać widmo fluorescencji. Odczytać, korzystając z kursora, emisję

dla długości fali λ=354 nm.

8. Wyniki zapisać w tabeli 1

Tabela 1. Krzywa wzorcowa emisji fluorescencji tryptofanu.

Dodana objętość
roztworu tryptofanu
0,5 mM
[μl]

Emisja fluorescencji
dla λ=354
[j.u.]

Stężenie końcowe
tryptofanu bez
korekcji
[mM]

Stężenie końcowe
tryptofanu z korekcją
[mM]

9. Opróżnić kuwetę. Przemyć ją kilkakrotnie wodą dejonizowaną. Delikatnie usunąć całą

wodę. Przemyć kuwetę alkoholem i osuszyć ją ręcznikiem papierowym.

10. Odpipetować 3 ml roztworu białka o stężeniu 0,05 g/l (roztwór wodny w 6 M

chlorowodorku guanidyny z dodatkiem β-merkaptoetanolu) do kuwety fluorescencyjnej.

11. Wykonać widmo fluorescencji roztworu białka stosując: wzbudzenie (excitation) λ=294

nm oraz emisji (emission) w zakresie 320-420 nm.

12. Dodać 10 μl roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w buforze fosforanowym pH=7 do

kuwety fluoroscencyjnej zawierającej badane białko. Wymieszać zawartość kuwety.

13. Wykonać widmo fluorescencji otrzymanego roztworu stosując wzbudzenie (excitation)

λ=294 nm dla emisji (emission) w zakresie 320-420 nm i odczytać, korzystając z kursora,

emisję dla długości fali λ=354 nm.

14. Dodać jeszcze 5 razy po 10 μl roztworu tryptofanu o stężeniu 0,5 mM w buforze

fosforanowym pH=7. Po każdym dodaniu roztworu tryptofanu do kuwety zawartość jej

dobrze wymieszać i wykonać widmo fluorescencji, odczytać, korzystając z kursora, emisję

dla długości fali λ=354 nm.

15. Wyniki zapisać w tabeli 2.

16. Powtórzyć czynności z pkt.11-15 dla roztworu drugiego białka.

Tabela 2. Emisja fluorescencji roztworu białka o stężeniu 0,05 g/l (roztwór wodny w 6 M

chlorowodorku guanidyny) z wzorcem wewnętrznym (tryptofanem)

Białko I …………………………………………..

Dodana objętość
roztworu tryptofanu
0,5 mM [μl]

Emisja fluorescencji
dla λ=354
[j.u.]

Stężenie końcowe
tryptofanu
bez korekcji [mM]

Stężenie końcowe
tryptofanu
z korekcją [mM]

Białko II …………………………………………..

Dodana objętość
roztworu tryptofanu
0,5 mM [μl]

Emisja fluorescencji
dla λ=354
[j.u.]

Stężenie końcowe
tryptofanu
bez korekcji [mM]

Stężenie końcowe
tryptofanu
z korekcją [mM]

Wykonanie pomiarów fluoroscencyjnych

1. Włączyć komputer, włączyć monitor, włączyć fluorymetr.
2. Uruchomić program Cary Eclipse.
3. Wybrać opcje scan – otwiera się okno programu.
4. Wybrać opcję set up. Pojawia się okno z zakładkami Excitation oraz Emission.

Wykonywanie widma wzbudzenia:

a) włożyć kuwetę z badanym roztworem do uchwytu
b) przejść do zakładki Excitation,
c) ustawić nastawy według tabeli

Pole zakładki

Długość fali

Szczeliny

Emission

354 nm

Emission slit 5

Start 230 nm

Excitation slit 2.5

Stop 340 nm

c) wcisnąć O.K.
d) przycisnąć przycisk START na górnym pasku programu,
e) pojawia się nowe okno wpisać nazwę próbki, wcisnąć O.K.
f) po wykonaniu widma zapisać go

Wykonywanie widma fluorescencji (emisji fluorescencji):
a) przejść do zakładki Emission,
b) ustawić nastawy według tabeli

Pole zakładki

Długość fali

Szczeliny

(wykonanie widma

tryptofanu)

Szczeliny

(krzywa wzorcowa i

pomiary w obecności

białka)

Excitation

294 nm

Excitation slit 2.5

Excitation slit 5

Start 320 nm

Emission slit 5

Emission slit 10

Stop 420 nm

c) wcisnąć O.K.
d) Przycisnąć przycisk START na górnym pasku programu
e) Pojawia się nowe okno wpisać nazwę próbki, wcisnąć O.K.
f) Odczytać za pomocą kursora wartość emisji dla λ=354 nm.

4. Opracowanie wyników

1.  Na  papierze  milimetrowym  zaznaczyć  punkty  do  krzywej  wzorcowej  fluorymetrycznego
oznaczania  zawartości  tryptofanu  w  próbie,  zależność  natężenia  fluorescencji  od
skorygowanego stężenia tryptofanu (wyniki z Tabeli 1). Wyznaczyć, metodą najmniejszych
kwadratów  prostą  opisującą  tą  zależność.  Sporządzić  wykres  prostej  na  papierze
milimetrowym. Podać współczynnik kierunkowy prostej (a

2. Wykreślić zależność natężenia fluorescencji I

od stężenia dodanego do roztworu białka

tryptofanu C

- dla wyników z Tabeli 2. Obliczyć liniową regresję metodą najmniejszych

kwadratów. Podać współczynnik kierunkowy prostej (a

). Wykres zawierający punkty

pomiarowe oraz prostą (l

) umieścić na papierze milimetrowym.

3. Ekstrapolować prostą (l

) do stężenia tryptofanu (c

) równego zeru. Odczytać z wykresu

wartość natężenia fluorescencji pochodzącej od reszt tryptofanu zawartych w badanym białku
4. Korzystając z krzywej wzorcowej, wyznaczyć stężenie tryptofanu w badanym białku.
5. Skorygować odczytaną wartość, mnożąc ją przez empiryczny współczynnik
proporcjonalności równy a

6. Wyznaczyć liczbę reszt tryptofanu R

przypadających na jedną cząsteczkę białka,

korzystając z zależności:

= c

gdzie: C

- stężenie molowe białka w próbie.

Masę molową białka poda prowadzący zajęcia.

Literatura

1. http://analiza.ovh.org/wyk/3.pdf
2. http://www.fuw.edu.pl/IIPRACOWNIA/home/Opisy-cwiczen/SF5.pdf

Fluorescence of Proteins in 6-M Guanidine Hydrochloride A Method for the Quantitative

Determination of Tryptophan
Patrick PAJOT European Journal of Biochemistry Volume 63 Issue 1, Pages263-269