Marian Kuczek
Department of Experimental and Molecular Biology,
University of Opole, Kominka 4, 45-035 Opole, Poland
Stała Michaelisa
W 1913 roku Leonor Michaelis i Maund Menten opisali zależność szybkości
reakcji katalizowanej enzymem inwertazą drożdżową od stężenia substratu, czyli od
stężenia sacharozy. Sacharaza, dawniej zwana inwertazą katalizuje reakcję
równowagową hydrolizy sacharozy.
W wyniku hydrolizy sacharozy, zmienia się skręcalność optyczna roztworu,
z prawoskrętnego staje się lewoskrętny, stąd pochodzi stara nazwa enzymu, inwersja
czyli odwrócenie.
W tamtych czasach można było badać aktywność optyczną stosunkowo
stężonych roztworów cukru. Jeżeli za miarę szybkości reakcji hydrolizy przyjmowano
szybkość zmiany kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego,
wówczas szybkość reakcji nie zależała od stężenia sacharozy i zależała wprost
proporcjonalnie od stężenia enzymu. Reakcje, których szybkość nie zależy od stężenia
substratu nazywa się reakcjami zerowego rzędu (patrz kinetyka reakcji chemicznych).
Wcześniej, Michaelis celem wyjaśnienia zerowego rzędu reakcji wysunął
przypuszczenie, że enzym z substratem wchodzi w reakcję równowagową tworząc
kompleks enzym - substrat, dalsze badania kinetyki tej reakcji powierzył Mount
Menten.
Menten, założyła, że reakcja hydrolizy sacharozy jest reakcją
pierwszego rzędu, czyli pominęła w swoich rozważaniach stężenie wody.
Podejście takie jest często stosowane w badaniach kinetycznych, gdyż
zużycie wody w roztworze wodnym podczas hydrolizy jest praktycznie
niezauważalne. Drugie uproszczenie, to ograniczyła się do badania szybkości
początkowej reakcji, czyli przyjęła:
1. Stężenie substratu nie zmienia się w wyniku powstawania kompleksu enzym
substrat (ES), oraz nie zmienia się w istotnym stopniu podczas przebiegu reakcji, czyli
reakcja biegnie ze stałą szybkością.
2. Zaniedbała szybkość reakcji odwrotnej, syntezy sacharozy z glukozy i fruktozy.
Szybkość reakcji.
Szybkością reakcji nazywamy pochodną stężenia substratu(ów) lub
produktu(ów) po czasie reakcji. Ze względów praktycznych zamiast równia
różniczkowego stosuje się równanie różnicowe a umownie nazywa się je różniczkowym.
v
d S
dt
=
−
[ ]
v
S
t
≈
∆
∆
[ ]
Szybkość reakcji inwersji (hydrolizy) sacharozy Menten badała wagowo
i w przeciwieństwie do wcześniejszych badaczy mogła oznaczyć stężenia produktów
reakcji przy bardzo małych stężeniach sacharozy.
Wykonanie
W pierwszych latach ubiegłego stulecia stężenie cukrów redukujących badano
wagowo. W wyniku reakcji zasadowego roztworu soli miedzi 2 powstaje osad tlenku
miedzi 1. Osad ten odsączano, przemywano, suszono i ważono. Metoda ta była bardzo
pracochłonna. W 1944 roku opisano kolorymetryczną metodę oznaczania cukrów
redukujących i od tego czasu jest to najczęściej stosowania metoda.
Do kolejnych probówek dodaje się 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 3, 9 cm
3
0.2 M
roztworu sacharozy w 0.1 M buforze octanowym o pH 4.5, dopełnia się do 9 cm
3
buforem octanowym, miesza się i wstawia do łaźni wodnej o temperaturze 323 K. Po
10 minutach inkubacji w łaźni wodnej, kolejno do każdej probówki, w odstępach co 10
min, dodaje się po 1 cm
3
ekstraktu białek z drożdży ponownie miesza się i umieszcza
w łaźni wodnej. Stężenia sacharozy wynoszą kolejno: 0, 1, 2, 4, 10, 20, 60, 180 mM.
W takich samych odstępach czasu (co 10 min), po każdych 10 minutach dalszej
inkubacji, z kolejnych probówek pobiera się po 0.1 cm
3
roztworu, dodaje do 2.9 cm
3
odczynnika odbiałczającego, miesza, po 5 mim odwirowuje osad białka.
Do 1 cm
3
supernatantu dodaje się 1 cm
3
odczynnika miedziowego (zasadowy
roztwór winianu miedziowego), miesza, wstawia do wrzącej łaźni wodnej na 20 min. Po
ostudzeniu dodaje się 1 cm
3
odczynnika arseno-molibdenowego, wstrząsa do usunięcia
wydzielonego dwutlenku węgla, dodaje się 7 cm
3
wody, miesza i mierzy absorbancję
przy 660 nm. Stężenie cukrów redukujących odczytuje się z wcześniej przygotowanej
krzywej wzorcowej.
Przedstawiona poniżej na wykresie zależność stężenia produktów reakcji od
czasu początkowo układa się liniowo, czyli reakcja w początkowej części wykresu
zachodzi z prawie stałą szybkością. Po długim czasie szybkość reakcji zmniejsza się,
reakcja osiąga stan końcowy.
Wykres nachylenia krzywych początkowego przyrostu stężenia produktów
reakcji od czasu, czyli wykres szybkości początkowej reakcji od stężenia substratu,
przedstawia wycinek hiperboli.
Wraz ze wzrostem stężenia substratu, zwiększa się szybkość reakcji
i asymptotycznie zbliża się do wartości zwanej szybkością maksymalną Vm. Krzywą
zależności szybkości początkowej reakcji od stężenia sacharozy Menten opisała
równaniem zwanym równaniem Michaelis-Menten. Równanie to jest uproszczonym
rozwiązaniem równania reakcji równowagowej po której następuje reakcja
nieodwracalna:
E + S = ES
ES = E + P
gdzie: E - enzym, S - substrat, ES - kompleks enzym substrat, P - produkt.
Zakładając, że szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia
kompleksu ES, że szybkość maksymalna, czyli szybkość początkowa reakcji przy
nieskończenie wielkim stężeniu substratu, jest wprost proporcjonalna do całkowitego
stężenia enzymu, gdyż przy maksymalnie dużym stężeniu substratu, wystąpi
maksymalne przesunięcie równowagi reakcji w kierunku powstawania kompleksu ES.
W warunkach gdy mierzy się szybkość początkową reakcji można zaniedbać ubytek
stężenia substratu oraz przy znikomym stężeniu produktu reakcji można założyć, że
nie powstaje kompleks EP (enzym-produkt) w wyniku reakcji: E + P = EP.
Stała równowagi reakcji dysocjacji ES
K
E S
ES
=
[ ][ ]
[
]
Przyjmując, że stężenie enzymu [E] w stanie równowagi jest równe stężeniu
całkowitemu enzymu [E(0)] pomniejszonemu o stężenie [ES], molowe stężenie
substratu jest tysiące razy większe od stężenia enzymu zatem powstawanie
kompleksu ES nie zmienia w istotnym stopniu stężenia substratu, równanie to
przyjmuje postać:
K
E
ES
S
ES
=
−
([ ( )] [
])[ ]
[
]
0
[
]
[ ( )][ ]
[ ]
ES
E
S
K
S
=
+
0
Podstawiając Vm za [E(0)] i v (oznaczoną szybkość początkową reakcji) za [ES], co
można zrobić gdyż zależność pomiędzy podstawianymi wartościami jest wprost
proporcjonalna, powiązane są ze sobą tą samą stałą proporcjonalności zwaną stałą
katalityczną, otrzymuje się równanie Michaelis - Menten, z tego równania można
obliczyć stałą równowagi reakcji dysocjacji kompleksu ES. Stała równowagi K została
nazwana stałą Michaelisa Km.
v
Vm S
Km
S
=
+
[ ]
[ ]
Km
Vm v S
v
=
−
(
)[ ]
Michaelis L. and Menten M. (1913) Biochem. Z. 49, 333-369.
Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. (1944) J. Biol. Chem.
153, 375-80.
Inhibitory
Enzymami nazywane są białka wykazujące funkcje katalizatorów. Katalizator
to związek, który dodany do środowiska reakcji zwiększa jej szybkość. Związki
zmniejszające szybkość reakcji nazwano inhibitorami. Jest stosunkowo mało reakcji,
zwłaszcza związków organicznych, które zachodzą w temperaturze pokojowej bez
katalizatorów. Katalizator, by zmieniał szybkość reakcji, musi brać udział w niej, nie
ma sytuacji by sama jego obecność wystarczyła. Wszystkie znane mechanizmy katalizy
enzymatycznej polegają na katalizie kwasowo-zasadowej. Należy jednak zwrócić
uwagę, że kwasami mogą być kationy metali, podczas gdy ligandy tych kationów, czyli
związki tworzące z kationami metali związki kompleksowe, mogą być zasadami.
Inhibitor może zatem zmieniać szybkość reakcji gdyż reaguje z substratem
(substratami) lub też dlatego, że reaguje z katalizatorem. W tym kontekście enzymy
nie wykazują żadnych nadprzyrodzonych cech. Kinetyka reakcji enzymatycznych jest
zgodna z prawami kinetyki chemicznej, również z tym zastrzeżeniem, że nie wszystkie
z tych praw znamy. Biorąc jednak pod uwagę Teorię Stanu Przejściowego, nie
obserwuje się w kinetyce enzymatycznej niczego co by ją odróżniało od kinetyki innych
reakcji chemicznych. Nawet taka cecha jak swoistość enzymów, okazuje sie dogmatem.
Dzięki temu, że enzymy są stosunkowo mało swoiste względem substratów, czasem
spotyka się związki, które reaguję z enzymem (katalizatorem) i zmniejszają jego
stężenie, są to właśnie inhibitory. Tego typu inhibitory zazwyczaj są bardzo "silnymi
inhibitorami", często znane są jako bardzo dobre trucizny, czasem zwane lekami.
Pozostałe inhibitory, to związki reagujące zazwyczaj z substratami, kompleksami
enzymów z substratami (ES), ewentualnie są to związki denaturujące białka lub
związki denaturujące białko a wykazujące ograniczone powinowactwo do konkretnych
enzymów, tzw. znaczniki centrum aktywnego.
Ze względów komercyjnych, konieczności głoszenia dogmatu o doskonałych
lekach, już trzeciej generacji, ile jeszcze tych generacji będzie ?, w literaturze
podręcznikowej i popularno-naukowej spotykamy głównie częściową interpretację
zjawiska inhibicji enzymów i podział na swoiste, są to konkurencyjne (kompetycyjne),
akompetycyjne oraz nieswoiste, są to niekompetycyjne. Jednakże najczęściej inhibitory
udaje się zakwalifikować do określonego typu tylko na podstawie badań kinetyki
reakcji w wąskim zakresie stężeń substratów i inhibitorów, podczas gdy w szerszym
zakresie wykazuję cechy dwóch typów.
Najczęściej wymienianym inhibitorem konkurencyjnym jest sól kwasu malonowego
dla dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu związanego z błoną mitochondrialną.
Dehydrogenaza bursztynianowa, katalizuje utlenianie bursztynianu (soli kwasu
bursztynowego) przez koenzym Q (ubichinon). Enzym, tak jak większość enzymów jest
mało swoisty, równie dobrze katalizuje reakcję utleniania bursztynianu innymi
utleniaczami. Badając szybkość reakcji w roztworach wodnych wygodnie jest użyć
błękit metylenowy zamiast naturalnego koenzymu. W roztworze wodnym, w obecności
dehydrogenazy bursztynianowej oraz soli kwasu bursztynowego błękit metylenowy
ulega redukcji do bezbarwnego związku. Za miarę szybkości reakcji przyjmuje się
szybkość zmniejszania się absorbancji roztworu w zakresie światła czerwonego.
Jeżeli do roztworu doda się trochę soli kwasu malonowego i przy zmiennym
stężeniu bursztynianu wyznaczy się szybkość maksymalną oraz stałą Michaelisa,
okazuje się że stała Michaelisa ulega znacznemu zwiększeniu, nie ulega zmianie
szybkość maksymalna. Czyli reakcja w obecności inhibitora osiąga taką samą szybkość
maksymalną lecz przy znacznie większym stężeniu substratu. Na tej podstawie
wysunięto przypuszczenie o konkurencji substratu (bursztynianu) z inhibitorem
(malonianem) o miejsce w centrum katalitycznym enzymu. Czyli, inhibitorem
konkurencyjnym (kompetycyjnym) nazywa się związek podobny do substratu, który
pasuje do centrum katalitycznego enzymu, tworzy z enzymem kompleks podobny do
kompleksu enzymu z substratem, lecz niereaktywny.
Przykład ten jest wyjątkowym przypadkiem. Inne przypadki inhibitorów
konkurencyjnych wykazują zazwyczaj mieszane działanie, inhibitora konkurencyjnego
i akompetycyjnego.
Inhibitorem akompetycyjnym nazywa się związek, który dodany do reagującego
roztworu enzymu z substratami zmniejsza wartość osiąganej szybkości maksymalnej
i zmniejsza stałą Michaelisa. W wyniku analogicznych przekształceń algebraicznych
do tych, które zastosowała Menten, można wysunąć hipotezę o równowagowej reakcji
kompleksu enzymu z substratem oraz z inhibitorem.
Trzeci przypadek, gdy zmniejszeniu ulega wartość asymptotyczna szybkości
maksymalnej a pozostaje bez zmiany stała Michaelisa, spotykany jest najczęściej, te
inhibitory nazwano niekompetycyjnymi.
Po analogicznych do wykonanych przez M. Menten uproszczonych
przekształceniach algebraicznych równań różniczkowych szybkości reakcji otrzymuje
się uproszczone równanie szybkości reakcji enzymatycznej w obecności inhibitorów.
+
+
+
=
Ka
Ia
S
Kc
Ic
Km
S
Vm
v
1
]
[
]
[
1
]
[
Kc
Ic
Fs
]
[
1
1
+
=
Ka
Ia
Fes
]
[
1
1
+
=
Gdzie Ic inhibitor konkurencyjny, Ia inhibitor akompetycyjny, Fs, Fes ułamki
molowe odpowiednio enzymu lub substratu oraz kompleksu enzym-substrat dostępne
w reakcji
1
.
1 Marian Kuczek. (2002) Biosystems 66, 11-20.
Wyżej przedstawione przypadki inhibicji nie wyjaśniają mechanizmu działania
“bardzo silnych” inhibitorów, które przy stężeniach tysiące razy mniejszych od
stężenia naturalnego substratu, wyraźnie zmniejszają szybkość reakcji. Często takie
inhibitory wykazują cechy inhibitorów kompetycyjnych. Jeden przykład jest
powszechnie znany, jest to kwas szczawiowy. In vivo nie jest tak bardzo trujący,
dawką półletalną podobno jest około 100 g płynu do chłodnicy samochodowej. In vitro
połowicznie hamuje dehydrogenazę mleczanową w stężeniu nieco poniżej 2 10^(-5) M.
Ten typ inhibicji był wyjaśniony w 1946 roku przez Paulinga
2
, praca jego została
przypomniana po ponad dwudziestu latach przez Wolfendena
3
. Tego typu inhibitory
nazywane są analogami stanu przejściowego substratu. Stan przejściowy substratu
pospolicie jest nazywany stanem wzbudzonym substratu, istnieje niezwykle krótko,
nie można go otrzymać. Analog stanu przejściowego to związek trwały o bardzo
podobnej budowie, który może analogicznie oddziaływać z enzymem jak stan
przejściowy substratu.
Prawie wszystkie znane inhibitory kompetycyjne, czyli analogi substratów lub
produktów, są kiepskimi inhibitorami, ich K
i
jest co najwyżej równe stałej
substratowej. Zatem by całkowicie zahamować aktywność enzymu inhibitor
kompetycyjny musi być użyty w stężeniu wielokrotnie przewyższającym stężenie
substratu, takie stężenia prawie nigdy nie są możliwe do osiągnięcia w warunkach in
2 L. Pauling, Molecular Architecture and Biological Reactions, Chem.Eng.,News. 1946. 24, 1375.
3 R. Wolfenden. Nature. 1969, 223, 704
vivo.. W 1969 roku było znanych zaledwie kilka analogów substratów, które
wykazywały znacznie wyższe powinowactwo do enzymów niż substraty, Wolfenden
wysunął przypuszczenie iż te związki są analogami strukturalnymi substratów w ich
stanie przejściowy.
Generalnie wszystkie reakcje zachodzą przez szereg krótkotrwałych stanów
przejściowych. Jeżeli założyć, że kluczowym dla przebiegu reakcji jest stan substratu,
w którym może nastąpić zerwanie jakiegoś wiązania chemicznego, wówczas stanem
przejściowym substratu będzie stan naprężenia tego wiązania i czas trwania takiego
stanu będzie odpowiadał czasowi pojedynczej wibracji wiązania, około 10
-
13
s. Jest to
czas w którym nie można konwencjonalnymi metodami spektroskopowymi wykazać
jego istnienia. Jednakże poznanie struktury stanu przejściowego ma zasadnicze
znaczenie dla zrozumienia mechanizmu reakcji katalitycznej. Jeżeli rozważać reakcje
katalityczne, wówczas należy założyć, że taki stan przejściowy substratu jest
niezwykle silnie związany z katalizatorem. Oznacza to że, enzym reaguje z substratem
tworząc kompleks "Michaelisa" o stałej dysocjacji Km, następnie przechodzi
w kompleks aktywny, w którym zarówno substrat jak i enzym występują w stanie
wzbudzonym. Powinowactwo substratu i enzymu w tym stanie wzbudzonym jest tak
duże i stała dysocjacji kompleksu tak mała, że zazwyczaj nie można zauważyć
uwalniania z centrum katalitycznego stanu wzbudzonego substratu, czyli stanu
przejściowego. Reakcja enzymatyczna tylko dlatego zachodzi, że stan przejściowy jest
nietrwały i natychmiast przechodzi w jeden ze stanów stabilnych, czyli z kompleksu
aktywnego powstaje na powrót kompleks enzym-substrat lub kompleks
enzym-produkt o znowu małym powinowactwie enzymu do produktu i stosunkowo
dużej Kp (stałej równowagi dysocjacji kompleksu enzym-produkt) porównywalnej co do
wielkości z Km.
Szybkość reakcji enzymatycznych ulega przyspieszeniu w stosunku do
niekatalitycznych reakcji zazwyczaj 10
10
do 10
15
razy, czyli jeżeli reakcja
enzymatyczna przebiega w przeciągu 1 sekundy, to identyczny efekt niekatalitycznej
reakcji wystąpi po 300 do 30.000.000 lat. Każda reakcja enzymatyczna przebiega przez
minimum trzy pośrednie etapy, często metodami kinetycznymi można wykazać
znacznie więcej takich pośrednich etapów, których czas półtrwania wynosi kilka
milisekund. Według teorii stanu przejściowego bardzo krótki okres czasu całego cyklu
reakcji, cząsteczka substratu spędza w postaci kluczowego dla procesu katalizy stanu,
który nazywa się stanem przejściowym. Kompleks tego stanu przejściowego
z enzymem powinien wykazywać stałą dysocjacji rzędu 10
-14
do 10
-23
M. Jeżeli
możliwe było by otrzymane związku, który jest stanem przejściowym substratu,
wówczas byłby to doskonały inhibitor, jednakże taki związek z natury swojej jest
nietrwały. Jeżeli nie można otrzymać stanu przejściowego substratu, to może można
otrzymać związek inny, podobny do stanu przejściowego, który będzie wykazywał nieco
słabsze powinowactwo do enzymu, lecz będzie związkiem trwałym.
Poniżej przedstawiono fragment reakcji w centrum katalitycznym hydrolaz
"serynowych". Stanem przejściowym podczas hydrolizy estrów i amidów kwasów
karboksylowych jest "tetraedryczna struktura grupy karbonylowej". Związki
analogiczne z tą strukturą znalazły zastosowanie jako doskonałe trucizny a czasem
jako środki owadobójcze.
Stan przejściowy substratu to inaczej substrat w stanie wzbudzonym, czyli
wysokoreaktywny. Wszystkie hydrolazy to katalizatory przyspieszające reakcje
przenoszenia ugrupowań takich jak acylowe, glikozydowe itp. na wodę, zwykle na
anion OH, rolę takiego akceptora przenoszonej grupy mogą pełnić także inne związki
niż woda. Taka sytuacja występuje w przypadku niektórych toksyn bakteryjnych.
Poniżej hydrolaza nukleozydowa.
Takim właśnie inhibitorem transpeptydazy d-alanylowej jest penicylina, uważana
jest za analog stanu przejściowego d-alanylo-d-alaniny.
Bakterie uzyskują odporność na antybiotyki w wyniku wytworzenia enzymów
rozkładających antybiotyki. Z enzymów rozkładających penicylinę najważniejsze są
dwa enzymy (rysunek poniżej).
Amidaza penicylinowa jest enzymem o znaczeniu technicznym. Z płynów
hodowlanych wyselekcjonowanych bakterii, odpornych na naturalną penicylinę,
odzyskuje się ten enzym. Enzym związany ze stałym podłożem, często tym stałym
podłożem jest porowaty polistyren w postaci drobnych granulek, nazywany jest
enzymem immobilizowanym. Można używać takiego enzymu wielokrotnie
w reaktorach działających ciągle, przepływowych. Za pomocą amidazy penicylinowej
otrzymuje sie z naturalnej penicyliny kwas penicylinoaminowy, który jest substratem
do syntezy półsyntetycznych penicylin, czyli takich, które mają z kwasem
penicylinoaminowym związany kwas o reszcie analogicznej do stanu przejściowego
hydrolizowanej penicyliny.
Drugą grupę antybiotyków grupy penicylin, opornych na enzym hydrolizujący
pierścień -laktamowy, otrzymuje się wg strategii zaproponowanej przez Blocha.
β
Bloch, odkrywca biosyntezy cholesterolu, nazwał takie związki "samobójczymi
substratami". Najwcześniej poznano dwa samobójcze substraty “ -laktamazy”: kwas
β
klawulanowy – wyizolowany ze szczepów Streptomyces i syntetycznie otrzymany
sulbaktam.
H
HO
OH
O
ADP
N
R
N
O
Toksyny:
cholery
dyfterytu
kokluszu
R = OH
-
wody lub grupa
S
-
białka wiążącego GTP
Km białka wzrasta ok. 10
3
NAD
+
N
S
H
N
H
H
C
O
O
H
COOH
Penicylina G
Amidaza
penicylinowa
N
S
H
2
N
H
H
O
H
COOH
Kwas
aminopenicylinowy
Acylowanie
Ampicylina
NH
2
COOH
HN
COOH
Piperacylina
SO
3
H
COOH
Sulbecylina
Cefoperazon
O
N
N
C
2
H
5
O
O
Analogiczne do
ugrupowań
stanu przejściowego
penicylinazy
SULBAMETACYNA = ampicylina + sulbaktam
SULPERAZON = cefaloperazon + sulbaktam
AUGMENTAN = amoksycylina + kwas klawulanowy
Penicylina utleniona - analog sulbaktamu
Kwas 6-bromopenicylinowy i 6-bromopenicylina
N
S
H
N
H
H
C
R
O
O
H
COOH
N
H
N
R''
H
C
R
O
O
S
COOH
CH
2
R'
penicyliny
R' = H; OH; OCH
3
; O-CO-CH
3
R'' = H - cefalosporyny
R'' = OCH
3
- cefalomycyny
penicylinaza
β −
laktamaza
Penicillinum notanum
Cephalosporinum aceremonium
Streptomyces lipmani
S. clavuligerus
N
H
N
C
R
O
O
OH
H
COOH
Nokardycyny
N
CH
O
COOH
RO
H
3
C
Tienamycyny
S
N
H
R'
On
N
O
H
H
H
O
H
COOH
Kwas klawulanowy
N
SO
3
H
H
N
R'
C
R
O
O
MONOBAKTAMY
OH
NH
2
NH
O
N
S
O
C
O
O
CH
2
O
C
O
N
S
O
O
O
(Amoksacylina)
INHIBITORY
β
-LAKTAMAZY
Monobaktam
KARBAPENY
HO
SULTAMYCYLINA
(Sulbaktam)
Samobójcze substraty enzymów
Pomysł syntezy bardzo swoistych inhibitorów enzymów zrodził się po słynnej pracy
Konrada Blocha z 1968 roku
4
. Inhibitory takie reagują z enzymem na wzór inhibitorów
konkurencyjnych i wywołują nieodwracalną inaktywację enzymów. Inaktywacja
występuje tylko wtedy gdy enzym w kompleksie z takim związkiem, katalizuje reakcję
tak jak z naturalnym substratem. Do hodowli bakterii, które wymagały obecności
w pożywce nienasyconych kwasów tłuszczowych, Bloch dodał kwas tłuszczowy
zawierający wiązanie potrójne zamiast podwójnego. Okazało się, że enzym, hydrataza
enoilo-CoA, ten enzym który katalizuje reakcję przyłączenia wody do nienasyconego
acylu w procesie degradacji kwasów tłuszczowych, ulega trwałej inaktywacji a ów
acetylenowy analog kwasu tłuszczowego zostaje trwale przyłączony do enzymu.
Enzym zawiera w centrum katalitycznym dwie reszty histydyny. Te też reszty,
a konkretnie atomy azotu pierścieni imidazolowych, biorą udział w katalizie reakcji.
Atom azotu z przyłączonym jonem wodorowym jest kwasem, nieuprotonowany jest
zasadą, czyli reakcja przebiega zgodnie z mechanizmem katalizy kwasowo-zasadowej.
Hydrataza enoilo-CoA katalizuje równowagową reakcję przyłączenia wody do wiązania
podwójnego, enzym wg. tego samego mechanizmu także izomeryzację cis-trans.
Jeżeli do centrum katalitycznego enzymu zostanie przyłączony analog acetylenowy
substratu, wówczas identycznie jak w przypadku naturalnego substratu, zostaje
odłączony jon wodorowy od atomu węgla
α
(przy grupie karboksylowej). Reakcja ta
pociąga za sobą przegrupowanie wiązania potrójnego i powstaje silnie reaktywne
wiązanie podwójne skumulowane (ugrupowanie allenowe). Centralny atom węgla
ugrupowania allenowego jest tak nienasycony w elektrony, czyli posiada duży ładunek
dodatni), że natychmiast reaguje z najbliższym elektrodonorowym atomem. Substrat
zostaje trwale połączony z azotem pierścieniem imidazolowym histydyny w centrum
aktywnym enzymu
5
.
4 Helmkamp GM Jr, Brock DJ, Bloch K. Beta-hydroxydecanoly thioester dehydrase. Specificity of
substrates and acetylenic inhibitors. J Biol Chem. 1968 Jun 25;243(12):3229-31.
5 Miesowicz FM, Bloch K. Purification of hog liver isomerase. Mechanism of isomerization of
3-alkenyl and 3-alkynyl thioesters. J Biol Chem. 1979 Jul 10;254(13):5868-77.
Inaktywacja hydratazy enoilo-CoA w wyniku reakcji z acetylenowym analogiem
substratu.
Związki wywołujące tego typu inaktywację enzymów początkowo nazwane zostały
samobójczymi substratami enzymów.
Rezultatem kilku następnych prac było:
1. wyjaśnienie mechanizmu działania znanych leków.
2. zaproponowanie ogólnej drogi planowania swoistych kowalencyjnych inaktywatorów
enzymów. (E.J. Ariens, Ed., Drug Design Academic Press 1971).
Zjawisko było znane znacznie wcześniej. W 1956 r. został opisany mechanizm
inaktywacji transaminazy przez 2-aminocyjanoetan (
β−
aminopropionitryl). Związek
ten występuje w postaci amidu kwasu glutaminowego w groszku pachnącym. Gdy nasi
obecni przyjaciele, celem wytępienia amerykańskich autochtonów, wytępili bizony, na
prerii zaczęły plenić się rośliny, które dawniej występowały stosunkowo rzadko. Jedną
z takich roślin jest groszek pachnący. Krowy pasące sie w miejscach jego masowego
występowania chorują na chorobę zwaną latyryzmem (nazwa pochodzi od nazwy
rodzajowej rośliny). W przewodzie pokarmowym krowy amid kwasu glutaminowego
ulega hydrolizie i aminopropionitryl jest inhibitorem transaminaz, dezaminaz,
dekarboksylaz aminokwasowych. Szczególnie dobrze inaktywuje
ε−
dezaminazę
lizynową, w efekcie nie powstają "wiązania krzyżowe" kolagenu, krowy dostają
rozstępów skóry. Zapewne mają znacznie więcej dolegliwości, lecz istotne jest tylko to,
że skóra nie nadaje się do przerobu. Mechanizm reakcji jest bardzo zbliżony do
mechanizmu inhibitorów acetylenowych. Substrat przyłącza się trwale do grupy
prostetycznej enzymu (fosforan pirydoksalu), lub też łączy go trwale z apoenzymem.
Mechanizm inaktywacji enzymów pirydoksalowych 2-aminocyjanoetanem.
W 1943 roku stosując chymotrypsynę jako modelowy enzym zbadano mechanizm
inaktywacji esterazy acetylocholinowej przez diizopropylofluorofosforam (DIFP).
Związek ten będzie omówiony w skrypcie "Związki neurotoksyczne i psychotropowe".