M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ć
WICZENIE
3: I
DENTYFIKACJA I CHARAKTERYSTYKA
BIOCHEMICZNA WYIZOLOWANYCH SZCZEPÓW
B
ACILLUS
Wstęp
Do rodziny Bacillaceae zalicza się laseczki, ba ogół gramdodatnie zdolne do wytwarzania
przetrwalników o wysokiej oporności na działanie czynników chemicznych i fizycznych.
Należą tu dwa rodzaje: tlenowce Bacillus i beztlenowce Clostridium.
Występowanie
Bakterie rodzaju Bacillus, dzięki możliwości tworzenia przetrwalników, są szeroko
rozpowszechnione w przyrodzie. Zawdzięczają to także zdolnościom adaptowania się do
warunków środowiska i aktywny rozwój w otoczeniu o dużej rozpiętości temperatur, pH
i zasolenia. Można je spotkać w glebie, w wodach słodkich i słonych, mule, osadach wód
powierzchniowych, gorących źródłach, na rożnych częściach roślin, w przewodzie
pokarmowym zwierząt czy psującej się żywności.
Bakterie z rodzaju Bacillus najpospolitsze są w glebie. Występują tu zarówno gatunki
mezofilne, jak i psychrofilne. Zaliczane są do zymogenicznej mikroflory gleby, a
więc w przeciwieństwie do autochtonicznej, ich intensywny rozwój występuje w
przypadku dużego napływu do gleby materii organicznej (np. opad liści w lesie,
nawożenie obornikiem itp.). Uczestniczą w mineralizacji gleby. W przypadku
niekorzystnych warunków mogą penetrować środowisko w poszukiwaniu dostępu do
substancji odżywczych (gatunki urzęsione) lub tworzą endospory. Głównym
przedstawicielem laseczek glebowych jest Bacillus cereus, nieco mniej liczne są B.
licheniformis, B. subtilis, B. pumilus. Są to bakterie o niewielkich wymaganiach
pokarmowych. Bardziej wymagające gatunki (B. psychrosaccharolyticus, B.
polymyxa, B. macerans, B. azotofixans) rosną głównie w strefie ryzosfery, korzystając
z substancji odżywczych wydzielanych przez rośliny i odwdzięczając się im
wiązaniem azotu atmosferycznego.
Bakterie występują też w wodzie. W wodach słodkich klimatu umiarkowanego
spotyka się te same gatunki co w glebach, tylko w mniejszych ilościach. W gorących
źródłach, gejzerach i jeziorach o wysokich temperaturach swoją niszę znalazły gatunki
termofilne, które nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC (Bacillus stearothermophilus
i Bacillus thermoruber). W przybrzeżnych wodach morskich i ujściach rzek
(zwłaszcza zanieczyszczonych) spotyka się bakterie glebowe: B. subtilis i B.
licheniformis. W wodach morskich o dużej czystości rozwija się B. cereus. W wodach
i glebach zasadowych spotyka się laseczki alkalofilne (B. firmus, B. alcalophilus, B.
lentus).
Bakterie z rodzaju Bacillus powszechnie występują w ściółce i na martwych
tkankach roślin, aktywnie uczestnicząc w II fazie ich rozkładu (B. megaterium, B.
cereus, B. mycoides). Bakterie te wydzielają liczne enzymy, w tym rozkładające
biopolimery i pochodne aromatyczne, przyczyniając się do rozkładu martwych
liści drzew bogatych w taniny i ligniny.
Bakterie występujące na powierzchni żywych roślin, często są dostarczycielami
azotu (asymilowanego z powietrza), chronią przed szkodliwymi owadami (wydzielają
δ-endotoksyny), zapobiegają lub hamują rozwój chorób grzybiczych.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Niektóre gatunki Bacillus występują w przewodzie pokarmowym zwierząt
uczestnicząc w procesach trawienia. B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B.
laterosporus, B. pumilus znaleziono w żwaczu przeżuwaczy, gdzie pomagają w
degradacji białek, hemiceluloz, ksylenu, glikozydów.
Morfologia i fizjologia
Bakterie z rodzaju Bacillus są tlenowymi lub względnie beztlenowymi,
gramdodatnimi laseczkami, często tworzące układy łańcuszkowe. Tworzą cylindryczne,
ruchliwe komórki o przeciętnych długościach 1-3
µm, ale bywają też większe (Bacillus
meganterium zalicza się do jednych z największych bakterii).Urzęsienie głównie
peritrichalne lub biegunowe. Spotyka się jednak również szczepy nieurzęsione i
nieruchliwe (B. anthracis).
Ze względu na kształt i rozmieszczenie przetrwalników w komórce bakterie
rodzaju Bacillus dzieli się na trzy grupy:
- laseczki
wytwarzające przetrwalniki o średnicy mniejszej od sporangium, o kształcie
owalnym lub cylindrycznym: B. anthracis, B. cereus, B. megaterium, B. licheniformis,
B. subtilis, B. thuringiensis,
- laseczki
wytwarzające przetrwalniki o średnicy większej od sporangium (komórka
macierzysta ulega rozszerzeniu), o kształcie owalnym lub kulistym: B. macerans, B.
stearothermophilus, B. circulans, B. polymyxa,
- laseczki
wytwarzające duże kuliste endospory o średnicy większej niż komórka
macierzysta, położone terminalnie: B. pasteurii, B. sphaericus.
Wśród bakterii Bacillus znane są gatunki mezofilne, termofilne, psychrofilne, a
nawet psychrotrofowe. Większość dobrze rośnie w temperaturze pokojowej oraz w 37ºC (B.
licheniformis, B. subtilis). Gatunki termofilne nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC, należą
do nich m.in. Bacillus stearothermophilus i Bacillus thermoruber. Do typowych
zimnolubnych bakterii zalicza się Bacillus macquariensis, B. psychrophilus i B.
psychrosaccharolyticus. Liczne gatunki z rodzaju Bacillus mogą bez wyraźnych zmian
metabolicznych adaptować się do warunków środowiska, np. gatunki mezofilne (B.
licheniformis, B. subtilis, B. coagulans, B. badius, B. smithii) mogą rosnąć w temperaturach
sięgających 60-70ºC. Są to tzw. termotolerancyjne laseczki.
Bakterie Bacillus, w zależności od gatunku wymagają do wzrostu środowiska o
różnym pH. Grupa laseczek alkalofilnych (B. firmus, B. alcalphilus, B. lentus, B. pasteurii)
preferuje pH zasadowe, natomiast B. subtilis, B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B.
laterosporus, B. pumilus lepiej rosną w pH obojętnym.
Niektóre laseczki są halofilne (B. globisporus, B. marinus, B. halophilus).
Metabolizm
Bacillus należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów. Dobrze rosną
na podłożach bulionowych (wyj. B. larvae). Na agarze rosną w postaci dużych kolonii o
rozmiarach 3-5 mm. W płynnym bulionie rosną w postaci kożucha lub tworzą zmętnienie w
całej objętości pożywki.
Wymagania pokarmowe są bardzo zróżnicowane gatunkowo. Są gatunki, którym
wystarczają pojedyncze źródła węgla, azotu i energii (B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus,
B. subtilis), inne potrzebują kompleksowych podłoży z dodatkowymi czynnikami wzrostu
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
(witaminy, aminokwasy) np. B. azotofixans, B. macerans, B. polymyxa, B.
psychrosaccharolyticus.
Wykorzystywane do wzrostu substancje organiczne, metabolizowane są w komórkach
Bacillus w procesach tlenowych i/lub fermentacyjnych. U niektórych gatunków tlen, jako
akceptor elektronów, może być zastąpiony przez jony NO
3
-
(oddychanie azotanowe u
B. licheniformis). Niektóre gatunki (B. polymyxa, B. macerans i B. azotofixans) mogą wiązać
azot atmosferyczny. Gatunki oddychające beztlenowo przeprowadzają fermentację
sacharydów. B. cereus i B. licheniformis wytwarzają 2,3-butandiol, glicerol, CO
2
i niewielkie
ilości mleczanu oraz etanolu. B. polymyxa i B. macerans rozkładają skrobię i pektyny, przy
czym B. polymyxa daje 2,3-butandiol, CO
2
H
2
i etanol, a B. macerans – etanol, aceton, octan i
mrówczan, CO
2
i H
2
. Właśnie na podstawie produktów fermentacji rozróżnia się
poszczególne gatunki z rodzaju Bacillus. Alkalofilna bakteria B. pasteurii może rozkładać
mocznik (ureaza).
Podczas wzrostu wegetatywnego bakterie Bacillus gromadzą kwasy organiczne
powodując zakwaszanie środowiska nawet do pH 4,0-5,0. Jest to spowodowane tym, że
powstający w glikolizie pirogronian nie jest włączany jako acetylo-CoA do cyklu Krebsa
(niektóre enzymy tego cyklu są zablokowane – represja kataboliczna), tylko wchodzi w cykl
glioksalowy. Cykl Krebsa jest uruchamiany dopiero w trakcie przygotowania do sporulacji.
W końcowej fazie wzrostu wykładniczego, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne
źródła węgla i energii, a komórki zaczynają się przygotowywać do wytworzenia endospor,
odblokowywane są enzymy cyklu Krebsa i acetylo-CoA ulega całkowitemu utlenieniu do
CO
2
. Powstaje też wtedy dużo ATP niezbędnego przy sporulacji. Wtedy też, w warunkach
tlenowych, zostają utlenione nagromadzone wcześniej kwasy organiczne, a pH środowiska
wzrasta.
Chorobotwórczość
Wśród bakterii Bacillus jedynie B. anthracis jest uważany za gatunek silnie
patogenny dla człowieka i innych ssaków (a nawet kręgowców). Endospory tego gatunku, są
bardzo odporne na warunki środowiska i mogą wiele lat oczekiwać w glebie czy wodzie. Ich
przedostanie się do żywności powoduje chorobę zwaną wąglikiem, której śmiertelność wśród
zwierząt sięga 100%. U ludzi – stykających się zawodowo z materiałem pochodzenia
zwierzęcego (szczególnie skóry, wełna, sierść) – choroba ma łagodniejszy przebieg, choć jej
postaci płucna lub jelitowa także mogą przebiegać ciężko i prowadzić do śmierci.
Z B. anthracis blisko spokrewniony jest B. cereus, wywołujący zatrucia pokarmowe, lokalne
infekcje ran, choroby oczu, posocznicę i in. Ze względu na swoje występowanie w glebie,
zatrucia tymi laseczkami są dość powszechne (łatwość przedostania się do produktów
spożywczych, szczególnie niedokładnie umytych owoców, warzyw). Patogenami są także
Bacillus alvei, B. popilliae i B. larvae wywołujące choroby pszczół i chrząszczy.
Pozostałe gatunki uważa się za saprofity, jakkolwiek mogą wywołać infekcje w przypadku
osłabienia organizmu.
Znaczenie dla przemysłu
Względnie tlenowe laseczki z rodzaju Bacillus mogą odgrywać negatywną rolę w
przemyśle spożywczym, powodując psucie się różnego rodzaju produktów
konserwowanych: mięsnych, warzywnych i mlecznych. Najczęściej przyczyną jest B.
licheniformis (produkuje gaz wywołując psucie się konserw połączone z bombażem), a w
konserwach zawierających skrobię B. stearothermophilus (psucie z zakwaszeniem, bez
bombażu puszek). B. coagulans odpowiada za psucie się konserw mlecznych.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Najważniejszą rolę bakterie z rodzaju Bacillus odgrywają jednak w przemyśle
enzymatycznym. Prawie 60% produkowanych w światowej skali preparatów
enzymatycznych przypada na proteinazy (w tym subtilizyny, enzymu stosowanego do
produkcji środków piorących) i
α-amylazy otrzymywane w oparciu o hodowlę bakterii
Bacillus (tab. 1.). W odróżnieniu od bakterii gramujemnych nie posiadają w swej ścianie
komórkowej toksycznych lipopolisacharydów oraz mają tylko pojedynczą warstwę
membrany cytoplazmatycznej co ułatwia sekrecję wytwarzanych przez nie enzymów.
T
ABELA
1. N
AJWAŻNIEJSZE POZAKOMÓRKOWE ENZYMY BAKTERII Z RODZAJU
B
ACILLUS
GATUNEK
ENZYM
Hydrolazy polisacharydów
Alkalofilne szczepy Bacillus sp.
α-amylaza, β-1,3-glukanaza, liaza pektynowa, pululanaza
Bacillus amyloliquefaciens
α-amylaza, galaktanaza, izoamylaza, mannanaza, ksylanaza
Bacillus brevis
celulaza
Bacillus circulans
chitynaza,
β-1,3-glukanaza, liaza pektynowa, β-1,6-glukanaza, fosfomannanaza
Bacillus cereus
β-amylaza
Bacillus coagulans
α-amylaza, izomeraza glukozowa
Bacillus firmus
celulaza, ksylanaza
Bacillus licheniformis
α-amylaza
Bacillus macerans
α-amylaza, glukonotransferaza cyklodekstryn
Bacillus megaterium
β-amylaza, glukonotransferaza cyklodekstryn, dekstranaza
Bacillus polymyxa
β-amylaza, celulaza, β-1,3-glukanaza, izoamylaza, liaza pektynowa, ksylanaza
Bacillus pumilus
liaza pektynowa, celulaza, lichenaza
Bacillus sphaericus
liaza pektynowa
Bacillus subtilis
α-amylaza, arabinaza, celulaza, α-glukozydaza, dekstranaza, galaktanaza, , liaza
pektynowa, ksylanaza,
β-1,3-glukanaza
Bacillus stearothermophilus
α-amylaza
Bacillus sp.
agaraza, chitosanaza
Hydrolazy peptydowe
Alkalofilne szczepy Bacillus sp.
proteinaza serynowa alkalofilna
Bacillus amyloliquefaciens
metaloproteinaza, subtilizyna
Bacillus cereus
metaloproteinaza
Bacillus licheniformis
subtilizyna, aminopeptydaza
Bacillus megaterium
metaloproteinaza
Bacillus polymyxa
metaloproteinaza
Bacillus pumilus
subtilizyna
Bacillus subtilis
metaloproteinaza, subtilizyna, esteraza, aminopeptydaza
Bacillus stearothermophilus
metaloproteinaza
Bacillus sp.
proteinaza halofilna
Penicylazy
Bacillus anthracis
β-laktamaza
Bacillus cereus
β-laktamaza
Bacillus licheniformis
β-laktamaza
Bacillus megaterium
β-laktamaza, acylaza penicylinowa
Bacillus sphaericus
acylaza penicylinowa
Bacillus subtilis
β-laktamaza
Nukleazy i fosfatazy
Bacillus amyloliquefaciens
alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza
Bacillus cereus
alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza, 5-nukleotydaza
Bacillus megaterium
5-nukleotydaza
Bacillus subtilis
alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza, 5-nukleotydaza, 3-
nukleotydaza
Enzymy bakteriolityczne
Bacillus licheniformis
endo-N-acetyloglukozoaminidaza, amidaza-N-acetylomuramylo-L-alaninowa
Bacillus subtilis
endo-N-acetyloglukozoaminidaza, egzo-N-acetyloglukozoaminidaza, endo-N-
acetylomuramidaza, amidaza-N-acetylomuramylo-L-alaninowa
Inne enzymy
Bacillus anthracis
fosfolipaza C
Bacillus cereus
fosfolipaza C
Bacillus licheniformis
lipaza
Bacillus subtilis
lipaza
Bacillus thiaminolyticus
tiaminaza
Bacillus thuringiensis
fosfolipaza C
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Bakterie Bacillus podzielono na 3 grupy (tab. 2.). Bakterie należące do grup A i B są
tradycyjnie używane w produkcji żywności lub są uważane za nieszkodliwe – produkowane
przez nie enzymy nie wymagają testowania lub testowane są jedynie pod kątem ewentualnej
toksyczności. Należą tu 22 gatunki niepatogenne. Natomiast 26 gatunków, które mogą być
patogenne zalicza się do grupy C, stosowanie wytwarzanych przez nie enzymów w produkcji
żywności wymaga specjalistycznych testów.
T
ABELA
2. P
ODZIAŁ BAKTERII Z RODZINY
B
ACILLUS
GRUPA
OPIS
GATUNKI
A
Wytwarzane enzymy nie wymagają
testowania
Bacillus subtilis (wraz ze szczepami
znanymi jako B. mesentericus, B.
natto, B. amyloliquefaciens)
B
Wytwarzane enzymy testowane są
pod kątem ewentualnej
toksyczności
B. stearothermophilus,
B. licheniformis,
B. coagulans,
B. Megaterium,
B. circulans,
B. pumilus
C
Ewentualne stosowanie enzymów
produkowanych przez te gatunki w
przetwórstwie żywności wymaga
specjalistycznych testów
B. cereus,
B. anthracis
Zestaw enzymów wytwarzanych przez bakterie z rodzaju Bacillus jest bardzo szeroki
(tab. 1.) i nie do końca wykorzystany. Enzymy te znajdują zastosowanie w procesach
biotransformacji i biodegradacji. Na skalę przemysłową laseczki Bacillus wykorzystuje się
także do produkcji antybiotyków (bacytracyny, gramicydyny S) i bioinsektycydów (
δ-
endotoksyn). W inżynierii genetycznej są wykorzystywane są do klonowania genów
przeznaczonych dla innych biorców. Dodatkowym atutem jest dość duża podatność szczepów
bakterii Bacillus na doskonalenie na drodze mutacji i selekcji, powodując coraz większą ich
produktywność.
Enzymy
Enzymy pozakomórkowe, zwane też egzoenzymami, to enzymy wydzielane z
komórek do otaczającego środowiska. Zalicza się tu także niektóre enzymy związane z
błonami komórkowymi, które w odpowiednich warunkach są uwalniane poza komórkę. Z
fizjologicznego punktu widzenia, służą najprawdopodobniej komórce do pozyskiwania
związków odżywczych z otoczenia. Niektóre są wydzielane podczas sporulacji. Większość
enzymów pozakomórkowych ma charakter indukcyjny. To znaczy, że w nieobecności
substratu są produkowane w komórkach w niewielkich ilościach (poziom bazowy). W chwili
pojawienia się substratu w pożywce, ta niewielka ilość enzymu wystarcza by przereagować z
substratem. W wyniku tej reakcji (najczęściej rozkładu) uwalniany jest induktor, który wnika
do komórki i uaktywnia syntezę enzymu na dużą skalę. W momencie wyczerpania substratu,
ilość enzymu wraca do poziomu bazowego.
Obok indukcji, drugim podstawowym mechanizmem regulacji metabolizmu bakterii z
rodzaju Bacillus na poziomie genetycznym, jest represja. Represja kataboliczna polega na
nieustannym hamowaniu biosyntezy enzymów w pożywkach zawierających glukozę lub
inne łatwo przyswajalne źródła węgla. Biosynteza proteinaz oraz wielu enzymów
działających na substraty zawierające azot jest silnie hamowana u bakterii Bacillus przez jony
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
amonowe (podobny mechanizm jak represja kataboliczna-glukozowa), a u niektórych
gatunków represyjnie działają mieszaniny aminokwasów.
Technologia produkcji enzymów pozakomórkowych
Technologia produkcji dzieli się na 2 etapy: proces biosyntezy enzymu i proces jego
wyodrębniania. Biosyntezę prowadzi się przeważnie w oparciu o wgłębną, okresową hodowlę
bakterii w klasycznych fermentorach w ciekłych pożywkach o ściśle określonym składzie
i przy zastosowaniu specyficznych dla każdego szczepu warunków fizycznych i chemicznych.
Skład pożywki dobiera się indywidualnie dla każdego gatunku, musi uwzględniać
mechanizmy regulacji biosyntezy (represję) oraz być ekonomiczny.
Substancje wchodzące w skład pożywki:
źródło węgla – mogą to być mono-, di- i polisacharydy, czasami stosuje się także
glicerol, alkohole czy kwasy organiczne. Często wykorzystuje się surowce odpadowe
(melasę buraczaną lub trzcinową), ziarna zbóż, hydrolizaty skrobi ziemniaczanej,
mąkę kukurydzianą,
źródło azotu – zwykle stosuje się substancje organiczne, będące jednocześnie źródłem
azotu, węgla, witamin i mikroelementów (serwatka, odpady sojowe, otręby zbożowe,
mąka, ekstrakty lub wyciągi z kukurydzy, soi, jęczmienia, czasami kiełki słodowe,
mączkę rybną). Szeroko stosowane są pożywki z białkami, aminokwasami lub
peptydami, kazeiną lub peptonem,
związki czynne – np. witaminy, zasady purynowe i pirymidynowe, ich źródłem są
drożdże lub ich ekstrakt,
mikroelementy – jak jony manganu, żelaza, cynku czy potasu wprowadzane są zwykle
w wystarczającej ilości z innymi składnikami pożywki.
Warunki hodowli:
pH 6,5-7,5, dla szczepów alkalofilnych 8,0-11,0, przy czym pH optymalne do
produkcji egzoenzymów nie zawsze pokrywa się z optimum dla wzrostu,
temperatura – w zakresie 28-40ºC, i jak wyżej temperatura optymalna dla produkcji
enzymu nie zawsze pokrywa się z optymalną dla wzrostu, np. B. mesentericus rośnie
najlepiej w 42ºC, a maksymalna synteza subtilizyny występuje w 28ºC,
odpowiednie napowietrzenie – dobierane indywidualnie, zwykle w granicach 0,7-1,0
objętości powietrza na objętość podłoża na 1 minutę, często zmienne w zależności od
fazy rozwoju.
Po zakończeniu hodowli wydzielony enzym wyodrębnia się z pożywki metodą wirowania lub
filtracji. Filtrat podlega następnie oczyszczaniu (w zależności od przeznaczenia z różną
dokładnością) i ewentualnemu jałowieniu.
Bioinsektycydy
Białka
δ-endotoksyn otrzymywane z hodowli różnych szczepów bakterii Bacillus
thuringiensis stały się alternatywą dla stosowania chemicznych środków owadobójczych
stosowanych w rolnictwie i leśnictwie. Toksyny te są produkowane w czasie sporulacji
i odkładane w komórkach poza przetrwalnikiem. Charakteryzują się wysoką aktywnością,
ukierunkowaną specyficznością w stosunku do poszczególnych rzędów, rodzin, rodzajów, a
nawet gatunków owadów i nieszkodliwością dla innych organizmów.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ze względu na specyficzność dzieli się je na 4 klasy: od CryI do CryIV, a te dalej na
podklasy i odmiany. Poszczególne szczepy Bacillus thuringiensis produkują
δ-endotoksyny
aktywne w stosunku do wybranej grupy owadów.
W obecnej chwili trwają badania nad zwiększeniem trwałości i wyeliminowaniem z
dotychczasowych preparatów wtórnych metabolitów (np.
β-egzotoksyn, hemolizyn), które
mogą być toksyczne dla innych organizmów.
Antybiotyki
W oparciu o hodowlę wgłębną bakterii z rodzaju Bacillus produkuje się obecnie kilka
antybiotyków o budowie oligopeptydowej: gramicydynę S, tyrocydynę A, B i C (B. brevis),
bacytracyna (B. subtilis). Poszczególne szczepy Bacillus subtilis produkują ponad 65
antybiotyków o budowie polipeptydowej. Bacillus polymyxa wytwarza polimyksyny.
Wszystkie te antybiotyki działają na bakterie gramujemne. Gramdodatnie i grzyby,
najczęściej poprzez blokadę syntezy ściany komórkowej, zakłócanie funkcji błon
komórkowych, rzadziej przez zakłócanie replikacji, transkrypcji czy translacji.
Wyjątkowy wśród bakterii z rodzaju Bacillus jest B. circulans, który wytwarza
antybiotyk aminoglukozydowy – butyrozynę. Na drodze biotransformacji uzyskuje się z
niej jeden z najefektywniejszych antybiotyków – amikacynę.
Biotransformacja
Biotransformacja to jedno-, rzadziej dwuetapowe, chemiczne przekształcenie
egzogennych związków w strukturalnie im podobne, dokonywane przez żywą komórkę.
Produkty końcowe często nie mają znaczenia dla komórki, a niekiedy są wręcz toksyczne.
Biotransformacja nie jest celem działania komórki, zachodzi niejako „na boku”. Biotechnolog
wykorzystuje naturalny aparat enzymatyczny komórki, podsuwa jej pewne związki i czeka aż
zostaną one przekształcone zgodnie z jego przewidywaniami. Proces ten jest niezależny od
funkcji życiowych komórki.
Bakterie z rodzaju Bacillus znalazły zastosowanie w wielu procesach biotransformacji:
• hydroliza estrów – esterazy produkowane przez Bacillus wykazują się wysoką
specyficznością, w tym także stereospecyficznością, i regioselektywnością, co zostało
wykorzystane przy rozdziale enancjomerów
- hydroliza octanu II-rzędowego, wydajność enancjomeru R ~94%
- rozdział mieszaniny podstawionych enancjomerów
α-arylo- i α-aryloksypochodnych
kwasu propionowego, są to m.in. znane leki przeciwzapalne (Naproxem), przy czym
aktywność farmaceutyczną wykazuje tylko enancjomer S
- hydroliza racemicznych estrów kwasów i alkoholi z kilkoma chiralnymi atomami
węgla
- regioselektywna hydroliza estrów karboksylowych katalizowana przez subtilizynę
- hydroliza estrów L-aminokwasów (bez hydrolizy estrów D-aminokwasów) przez
subtilizynę
• produkcja aminokwasów
- szczególnie
duże znaczenie odgrywają bakterie z rodzaju Bacillus w otrzymywaniu
czystych L- lub czystych D-aminokwasów
- niektóre gatunki mogą w odpowiednich warunkach produkować aminokwasy: B.
subtilis – L-izoleucynę lub L-treoninę
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
• antybiotyki
- wykorzystanie acylazy penicylinowej z bakterii E. Coli, B. sphaericus, B.
meganterium do transformacji penicyliny G i penicylinę V w kwas 6-
aminopeicylanowy, główny półprodukt półsyntetycznych penicylin
• steroidy
- bakterie z gatunku Bacillus meganterium jako jedne z nielicznych hydroksylują
progesteron w pozycji a i b przy węglu 15-tym
- B. lentus i B. sphaericus mogą przeprowadzać reakcję odwodorowania przekształcając
kortyzon w prednizon.
Biodegradacja
Biodegradacja to chemiczny rozkład związków organicznych na prostsze
składniki chemiczne zachodzący przy udziale żywych organizmów. W odróżnieniu od
mineralizacji, termin ten używa się w odniesieniu do substancji obcych i szkodliwych dla
środowiska naturalnego, syntetyzowanych sztucznie przez człowieka i nie występujących
naturalnie przyrodzie (ksenobiotyków).
Biodegradacja n-alkanów o długości łańcucha C9-C44
Znane są 3 drogi:
mono- lub diterminalna oksydacja
subterminalna oksydacja
poprzez alkeny
Bakterie z rodzaju Bacillus uczestniczą w pierwszej z nich, w szczególności
odgrywają znaczącą rolę przy biodegradacji n-alkanów o łańcuchu powyżej C16 (parafiny),
które są ciałami stałymi, a wykorzystywane były do produkcji kremów, kosmetyków,
smarów, świec, pokrywania papieru itp. Problem z ich degradacją polega na tym, że są one
katabolizowane wewnątrzkomórkowo, a więc ich rozkład jest uzależniony od dostępu do
komórki mikroorganizmu. B. subtilis pokonuje ten problem wydzielając do otoczenia
bioemulsator ułatwiający wnikanie cząstek n-alkanu do komórek własnych i innych
mikroorganizmów.
Oksydacja polega na wprowadzeniu grupy OH do łańcucha przy węglu 1. (terminalna), 2,3
lub 4 (subterminalna). Bacillus macerans może hydroksylować 4, 5 i 6. atom węgla. Mieszane
kultury Bacillus i Streptomyces hydroksylują długie n-alkany w dowolnym miejscu.
Wprowadzona grupa OH pod wpływem dehydrogenaz i esteraz ulega dalszemu utlenieniu, a
łańcuch alkanu skróceniu.
Biodegradacja związków amidowych
Pochodne aromatycznych amidów (anilidów) i fenylokarbamidów (fenylomocznika)
są powszechnie stosowanymi pestycydami. Ich biodegradację prowadzą B. firmus i B.
sphaericus, wytwarzające enzym: arylo-acyloamidazę rozkładający anilidy do kwasu
karboksylowego i aniliny.
Biodegradacja innych związków
Bacillus cereus jest zdolny do biodegradacji wielu barwników azowych.
Bacillus pumilus wytwarza dihydratazę cyjanidową i degraduje cyjanowodór.
Bacillus subtilis mogą eliminować grupę nitrową z pochodnych fenoli, w
szczególności 2- i 4-nitrofenole, częstych substancji zanieczyszczających środowisko
(ścieki przemysłowe, gleba zanieczyszczona insektycydami)
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
8
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Biodegradacja związków aromatycznych np. pochodnych toluenu, protokatecholu,
pirydyny, kwasu nikotynowego.
Taksonomia
Grupa tlenowców jest stosunkowo mało opracowana. Dopiero w ostatnich dekadach, głównie
dzięki pracom Smitha i wsp. wprowadzono pewien ład w systematykę tej grupy, znacznie
uszczuplając jej zasoby. Okazało się bowiem, że wielokrotnie naukowcy opisywali ten sam
mikroorganizm pod różnymi nazwami. Trudności z podziałem taksonomicznym są
spowodowane wysoką niestałością cech morfologicznych i biochemicznych tej grupy
bakterii. Obecnie przyjęty podział przedstawia tabela 3. Uważa się, że cechą odróżniającą
Bacillus od Clostridium jest zdolność wytwarzania katalazy. Jeśli chodzi o wymagania
tlenowe, to wśród Bacillus znajdują się zarówno tlenowce jak i względne beztlenowce.
T
ABELA
3. P
ODZIAŁ RODZAJU BACILLUS
1. Laseczki szer.> 0,9
µm,
w młodych hodowlach barwią
się nierównomiernie
Bac. megaterium
Bac. cereus
Bac. cereus var. mycoides
Bac. anthracis
Bac. thuringiensis
I
Przetrwalniki owalne lub cylindryczne,
nie deformujące laseczki ułożone
pośrodku lub bliżej jednego z końców,
o cienkich ścianach,
laseczki Gram-dodatnie
2. Laseczki szer. < 0,9
µm,
w młodych hodowlach barwią
się równomiernie
Bac. licheniformis
Bac. subtilis
Bac. pumilis
Bac. coagulans
Bac. badius
Bac. firmus
Bac. lentus
1. Wytwarzają gaz na podłożu z
węglowodanami
Bac. polymyxa
Bac. macerans
II Przetrwalniki
owalne,
wyraźnie zniekształcające laseczkę,
ułożone pośrodku lub na końcu,
o grubych ściankach, łatwo barwiące
się,
laseczki barwią się metodą Grama
zmiennie
2. Nie wytwarzają gazu na
podłożach z węglowodanami
Bac. alvei
Bac. stearothermophilus
Bac. circulans
Bac. laterosporus
Bac. pulvifaciens
Bac. brevis
Bac. larvae
Bac. papillae
Bac. lentomorbus
1. Rosną przy pH 6,0,
do wzrostu nie wymagają
obecności mocznika
Bac. panthothenicus
Bac. sphaericus
III Przetrwalniki
okrągłe,
zniekształcające laseczkę,
ułożone końcowo
2. Do wzrostu wymagają
obecności mocznika i reakcji
alkalicznej
Bac. pasteuri
Identyfikacja szczepów nie może być oparta jedynie na samym wyglądzie kolonii, gdyż
drobnoustroje te wykazują dużą zmienność. Ważną cechą diagnostyczną jest wygląd komórek
przetrwalnikujących i samych endospor. Przetrwalniki łatwo można oglądać w preparatach
barwionych rozcieńczoną fuksyną, ale opracowano metody ich barwienia znacznie bardziej
przydatne w badaniach diagnostycznych. Ocenia się wygląd sporangiów, kształt i ułożenie
przetrwalników. W młodych (24-godzinnych) hodowlach zabarwionych fuksyną ocenia się
równomierność zabarwienia (nierównomierne, budowa ziarnista, piankowata – obecność
wodniczek).
W celu dalszej identyfikacji, zgodnie z metodyką stosowaną Międzynarodowym Ośrodku
Mikrobiologii Żywności w Lille, stosuje się posiewy na rząd biochemiczny (tab. 4):
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
9
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
T
ABELA
4. R
ÓŻNICOWANIE TLENOWCÓW PRZETRWALNIKUJĄCYCH
Żelatyna
Grupa
uk
sy
n
Nazwa
gatunku
Barwi
ące si
ę
f
ą
VP
Wzrost w
warunkach
beztlenowyvh
Glukoza
Arabinoza
Ksyloza
Skrobia
Kazeina
kł
uta
bulion
Lecytynaza
Hemolizyna
Azotany
Mocznik
Cytrynian
sodowy
I grupa
przetrwalniki nie
zniekształcające
Bacillus subtilis
Bac. licheniformis
Bac. pumilus
Bac. cereus
Bac. anthracis
Bac. megaterium
Bac. coagulans
Bac. firmus
Bac. lentus
Jednolite
„
„
Niejednolite
„
„
„
„
„
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
±
±
-
-
+
+
+
-
-
±
±
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+s
+p
+s
+s
+p
±s
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
-
++
+
-
-
-
-
-
-
-
+++
zmienne
„
„
„
„
+
+
-
±
±
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
±
-
+?
+
-
-
-
II grupa
przetrwalniki
zniekształcające
Bac. polymyxa
Bac. macerans
Bac. circulans
Bac. brevis
Jednolite
„
„
„
+
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
±
+
+
+
±
+
-
-
-
-
„
„
„
„
+
±
±
±
-
-
-
-
-
-
-
-
III grupa przetrwalniki
zniekształcające
okrągłe
Bac. alvei
Bac. sphaericus
Bac. pasteuri
Jednolite
„
„
+
-
-
+
±
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
+
-
-
+
±
-
-
-
-
„
„
”
-
-
+
-
-
+
-
-
-
s – szybko, p – powoli, + wynik dodatni, – wynik ujemny, ± odczyn dodatni lub ujemny
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
10
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ocenia się:
wytwarzanie acetylometylokarbinolu oceniane na podłożu Smitha (reakcja Voges-
Proskauera, VP+)
fermentację węglowodanów na podłożach syntetycznych bez peptonu
zdolność wzrostu w warunkach beztlenowych (posiew na agar w wysokim słupku)
rozkład skrobi
rozkład kazeiny
rozkład żelatyny
wytwarzanie lecytynazy
wytwarzanie hemolizyny
ruchliwość
Lemille i wsp. na podstawie szczegółowych badań zaproponowali zmodyfikowany klucz
do oznaczania laseczek rodzaju Bacillus, należących do I grupy (tab. 5.).
T
ABELA
5. K
LUCZ DO OZNACZANIA GATUNKÓW
B
ACILLUS
I
GRUPY
(wg Lemille F., de Barjac H., Bonnefoi A.)
VP+
Wzrost w
warunkach
beztlenowych
MR
Ureaza
Mannitol
Rafinoza
Ksyloza
Inulina
+
-
-
-
-
-
Bac. cereus
Ko
mó
rk
i weg
etaty
wn
e o
szeroko
ści
ponad 0,9
µm. Wodni
czki
s
ą
Wzrost na agarze o pH
6+
VP-
Brak wzrostu w
warunkach
beztlenowych
MR
Ureaza
Mannitol
Rafinoza
Ksyloza
Inulina
-
+
+
+
+
+
Bac. megaterium
Kazeina
Żelatyna
Azotany
Gaz na bulionie z azotanami
Mannitol
-
-
-
-
-
Bac. coagulans
VP+
Wzrost w
warunkach
beztlenowych
Kazeina
Żelatyna
Azotany
Gaz na bulionie z azotanami
Mannitol
+
+
+
+
+
Bac. licheniformis
Ureaza
Skrobia
Azotany
-
-
-
Bac. pumilis
VP+
Brak wzrostu w
warunkach
beztlenowych
Ureaza
Skrobia
Azotany
+
+
+
Bac. substilis
Wzrost
na agarze o pH 6+
VP-
Brak wzrostu w
warunkach
beztlenowych
Ureaza
Azotany
Kazeina
Glukoza
-
-
-
-
Bac. badium
Ureaza
Azotany
Kazeina
Żelatyna
+
-
-
-
Bac. lentus
Komórki
weget
at
ywne o szeroko
ści
poni
żej
0,9
µm.
Brak wodniczek, wymiary: 0,6-0,9 x 1,2-5
µm.
Brak wzrostu na agarze
o pH 6,
VP –
brak wzrostu w warunkach
beztlenowych
Ureaza
Azotany
Kazeina
Żelatyna
-
+
+
+
Bac. firmus
W tabeli pominięto B. anthracis i B. thuringiensis.
+ wynik dodatni
–
wynik ujemny
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
11