1 

Ćwiczenie 2 

BUDOWA,  WŁAŚCIWOŚCI  I  FUNKCJA  BIAŁEK 

Część doświadczalna obejmuje: 

- ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową 

- wytrącanie kazeiny w punkcie izoelektrycznym 

- frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu 

- denaturacja białek (termiczna, etanolem o wyŜszym stęŜeniu, niektórymi kationami i anionami) 

 

WPROWADZENIE 

Łączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej makro-

cząsteczki – polipeptydu. Łańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt aminokwasowych 

przyjmuje się określać juŜ jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane równieŜ wiązaniem pep-

tydowym, powstaje z grupy 

α

-karboksylowej i grupy 

α

-aminowej. Na ryc. 1A przedstawiono di-

peptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe jest stabilizowane me-

zomerycznie,  gdyŜ  wiązanie  C-N  ma  częściowo  charakter  wiązania  podwójnego  C=N  (Ryc. 

1B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, Ŝe we wszystkich ułoŜeniach przestrzen-

nych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna rotacja jest moŜliwa tylko wokół wią-

zania N-C

α

 i C

α

-C, a obroty są opisywane przez wartości kątów torsyjnych 

ϕϕϕϕ

 (fi) i 

ψ

ψ

ψ

ψ

 (psi) (Ryc. 

1A).  

 

Ryc. 1. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman, Röhm 2005) 

 

2 

 

Ryc.  2.  Struktury  drugorzędowe  białek  (α-helisa,  helisa  kolagenu,  pofałdowanej  kartki,  β-pętla) 
(Koolman, Röhm 2005) 

 

3 

Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt aminokwasowych 

definiuje strukturę drugorzędową stabilizowaną wiązaniami wodorowymi (Ryc. 2). 

Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i złoŜone. Białka proste zbudowane są 

tylko z aminokwasów, natomiast białka złoŜone zawierają szereg róŜnych komponentów nieami-

nokwasowych, których rodzaj staje się podstawą podziału białek na:  

- glikoproteiny - białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), aminocukry 

(N-acetyloglukozamina,  N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne mono-

sacharydów (kwas uronowy, kwas sjalowy) 

- lipoproteiny – zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe 

- metaloproteiny – zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie 

- fosfoproteiny – reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforowym  

- nukleoproteiny – zawierają RNA lub DNA 

- chromoproteiny – zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią róŜne związki barwne  

Na  ryc.  3  pokazano  potencjalne  miejsca  modyfikacji  łańcucha  polipeptydowego.  Modyfika-

cjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc waŜne źródło róŜnorodności białek. 

 

 

Ryc. 3. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman, Röhm 2005) 

 

 

4 

Białka ze względu na pełnione funkcje moŜna podzielić na:  

- enzymatyczne – najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróŜnicowanej masie cząsteczkowej  

- strukturalne – są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen, ela-

styna, tubulina, aktyna, 

αααα

-keratyna). Do białek strukturalnych zalicza się tak-

Ŝe histony pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie 

- transportujące – np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO

2 

 Niektóre białka oso-

cza  (prealbumina)  transportujące  hormony,  transferyna  przenosząca  Ŝelazo, 

niektóre białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów, 

nośniki w transporcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transpor-

cie aktywnym jonów i metabolitów 

-  regulacyjne  –  białkami  są  niektóre  hormony  (somatotropina,  insulina),  a  takŜe  receptory 

uczestniczące w percepcji róŜnych cząsteczek sygnałowych. Białkami regulato-

rowymi są takŜe czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów 

-  odpornościowe  –  białka  układu  immunologicznego  (np.  immunoglobuliny)  chronią  organizm 

przed  czynnikami  chorobotwórczymi  i  ksenobiotykami  (substancjami  obcymi 

dla organizmu) 

-  motoryczne  –  uczestniczą  w  procesach  związanych  z  ruchem  (aktyna,  miozyna);  kinezyna 

funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce 

- zapasowe – owoalbumina w białku jaja stanowi źródło aminokwasów dla rozwijającego się za-

rodka;  ferrytyna  wiąŜe  Ŝelazo  w  wątrobie,  kazeina  jest  białkiem  zapasowym 

mleka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako mate-

riał energetyczny; takŜe wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową  

Ze  względu  na  rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na: globularne (kuliste) i fibrylarne 

(włókienkowate, skleroproteiny).  

Do  białek  fibrylarnych  naleŜą:  α-keratyny  włosów,  wełny,  piór,  paznokci,  kolageny  zawarte 

głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina jedwabiu. 

 Białka globularne obejmują: 

-białka obojętne (albuminy, globuliny) 

-kwaśne (prolaminy, gluteiny) 

-zasadowe (histony, protaminy)  

Na ryc. 4 przedstawiono półschematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktury 

kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek. 

 

5 

 

 

Ryc. 4. Strukturalne i funkcjonalne zróŜnicowanie białek (półschematyczne struktury w około 1,5 
mln powiększeniu; długość kolagenu w tym powiększeniu wynosi około 30 cm) (Koolman, Röhm 
2005)  
 

 

6 

 

Rozpuszczalność białek globularnych 

Cząsteczki białka są amfoterami tworzącymi w roztworach wodnych koloidy. Fazę rozproszo-

ną stanowią cząsteczki białka o wymiarach 5-100 nm i masach cząsteczkowych sięgających nawet 

miliona Daltonów (Da). Większość białek wykazuje duŜe powinowactwo do wody. Takie koloidy 

nazywamy hydrofilowymi. 

Białka,  podobnie  jak  aminokwasy,  posiadają  ładunek,  lecz  w  pH  równym  punktowi  izoelek-

trycznemu  (pI)  są  elektrycznie  obojętne  (Rys.  5).  RóŜne  białka  mają  róŜne  wartości  punktu  izo-

elektrycznego. W pH powyŜej i poniŜej pI białka mają ładunek odpowiednio ujemny i dodatni, w 

wyniku  czego  białko  zostaje  otoczone  dipolami  wody  (hydratacja).  Zjawisko  to  warunkuje  roz-

puszczalność  w  wodzie  tak  duŜych  cząsteczek  jak  białka.  Pozbawienie  białek  ładunku  powoduje 

dezintegrację  otoczki  wodnej  i  utratę  rozpuszczalności.  Białka  róŜniące  się  wartościami  punktu 

izoelektrycznego w tym samym pH środowiska będą posiadały róŜny ładunek i róŜne powinowac-

two do wody, co umoŜliwia ich frakcjonowanie i rozdział. 

 

 

Ryc. 5. Udział ładunku elektrycznego w procesach wytrącania białka w roztworze 

 

Z  powyŜszego  wynika,  Ŝe  wytrącanie  białka  zachodzi  najłatwiej  w  punkcie  izoelektrycz-

nym.  Jeśli  proces  ten  będzie  przebiegał  w  niskiej  temperaturze  (0-5

0 

C),  to  uzyskane  w  osadzie 

białko, po rozpuszczeniu zachowa cechy charakterystyczne dla białka natywnego. 

Na ryc. 6 pokazana jest zaleŜność rozpuszczalności białka od pH w warunkach zróŜnicowa-

nego stęŜenia NaCl. Rozpuszczalność białka wyraźnie maleje w pH zbliŜonym do pI. Największy 

spadek rozpuszczalności obserwuje się w warunkach niskiego stęŜenia soli (1 mM NaCl).  

 

7 

 

Ryc. 6. Wpływ pH i niewielkich stęŜeń NaCl na rozpuszczalność β-laktoglobuliny w 25

0 

C 

(Lehninger 1979) 

Wpływ stęŜenia soli na rozpuszczalność białek 

 Rozpuszczalność  jest  funkcją  zarówno  stęŜenia  soli  obojętnej,  jak  teŜ  ilości  ładunków  wszyst-

kich rodzajów jonów znajdujących się w roztworze. Wartości te określają siłę jonową roztworu: µ 

= 1/2Σc

i

z

i

2

 (c – stęŜenie jonów; z – ładunek jonów) 

 

Ryc. 7. Zasalanie (wsalanie) i wytrącanie białek (wysalanie) w warunkach rosnącej siły jonowej 

roztworu (Koolman, Röhm 2005) 

 

8 

Rozpuszczalność  białka  w  wodzie  destylowanej  jest  bardzo  mała,  natomiast  rośnie  wraz  ze 

wzrostem siły jonowej, gdyŜ rośnie liczba jonów nieorganicznych na powierzchni białka zapobie-

gających  ich  agregacji.  Zjawisko  to  nazywa  się  wsalaniem  lub  zasalaniem  (Ryc.  7).  Przy  odpo-

wiednio duŜej sile jonowej, sól odciąga  cząsteczki wody od powierzchni białek i doprowadza do 

ich  agregacji  (wysalanie  białka)  (Ryc.  7).  Białko(a)  wysolone  rozpuszcza  się  ponownie  po  usu-

nięciu soli lub po rozcieńczeniu roztworu. 

Zdolność  wysalająca  soli  zaleŜy  zarówno  od  charakteru  kationu,  jak  i  anionu.  Ze  względu  na 

siłę wysalającą moŜna uszeregować kationy i aniony w następujący sposób: 

Aniony: cytrynian

3-

 > winian

2-

> siarczan

2-

 > octan

-

 > chlorek

-

 > azotan

-

 > rodanek

-

 

Kationy: Th

3+

 > Al

2+

 > Se

2+

 > Sr

2+

 > Ca

2+

 > Mg

2+

 > NH

4

+

 > Na

+

 > Li

+

 

Szeregi te noszą nazwę szeregów liotropowych lub szeregów Hofmeistera.  

Rozpuszczalność  białek  jest  takŜe  funkcją  stałej  dielektrycznej  środowiska,  gdyŜ  w  warun-

kach  nie  zmieniającego  się  pH  i  siły  jonowej  maleje  po  dodaniu  rozpuszczalników  o  niskiej 

stałej  dielektrycznej  takich  jak:  etanol,  aceton,  glikol  etylenowy.  Białka  w  takich  warunkach 

agregują,  gdyŜ  dodany  rozpuszczalnik  zmniejsza  stopień  uwodnienia  grup  jonowych  przez 

zmniejszenie  ilości dipoli wodnych na powierzchni cząsteczki białka. ObniŜenie stałej dielek-

trycznej  roztworu  przez  dodanie  rozpuszczalnika  powoduje  wzrost  siły  przyciągania  pomiędzy 

przeciwnie naładowanymi grupami.   

Rozpuszczalność większości białek zwiększa się w ograniczonym zakresie (0 – 40

0 

C) wraz ze 

wzrostem temperatury. W temperaturze powyŜej 40-50

0 

C większość białek zaczyna tracić trwa-

łość i ulega denaturacji. Białka mogą takŜe denaturować w szczególnie drastycznych warunkach tj. 

skrajne pH, wysoka temperatura, promieniowanie jonizujące. Denaturacja pociąga trwałą utratę 

funkcji biologicznych i wiąŜe się ze zmianami w strukturze drugo-, trzecio- i czwartorzędo-

wej białka.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9 

WYKONANIE  

Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową 

Zasada metody: 

Metoda  polega  na  oznaczaniu  natęŜenia  barwy  powstałej  w  wyniku  wytworzenia  związków 

kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z maksimum absorbancji 

przy 

λ

 = 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązań 

peptydowych.  ZaleŜność  ta  jest  wykorzystywana  do  ilościowego  oznaczania  białek.  Czułość  me-

tody - 0,1 mg/ml. 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nazwa reakcji pochodzi od biuretu - związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząste-
czek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe  

 

 

 

Metoda  biuretowa  nie  nadaje  się  do  oznaczania  białek  w  obecności  soli  amonowych,  gdyŜ  jon 

amonu daje równieŜ barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza takŜe siarczan 

(VI) magnezu, poniewaŜ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny  wodorotlenek magnezu 

maskuje właściwy odczyn. 

 

 

10 

Odczynniki: 

- standardowy roztwór albuminy - 10 mg/ml w 0,9% NaCl 

-  odczynnik  biuretowy:  1,5  g  5hydratu  CuSO

4

  i 6,0  g  winianu  sodu  i  potasu  rozpuścić  w  500  ml 

wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale mieszając dodać 300 

ml

 

10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczynnik jest stabilny.  

 

Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stęŜenia białek w surowicy krwi  

Do  suchych  probówek  odmierz  pipetą  kolejno  podane  w  tabeli  objętości  standardowego  roz-

tworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. KaŜdą próbę wykonaj w dwóch powtórzeniach. 

 

 Nr próby

 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

 

StęŜenie albuminy  (mg/próbę)

 

1 

2 

3 

4 

5 

0 

 Roztwór standardowy (ml) 

 Woda destylowana (ml) 

 Odczynnik biuretowy (ml) 

 

                      A

1

 

  A

540nm

         A

2

 

                      A

śr

 

 K   =  

 mg albuminy w próbie

 

                         A

540 nm

 

0,1 

0,4 

2,0 

 

 

 

 

 

 

0,2 

0,3 

2,0 

 

 

 

 

 

 

0,3 

0,2 

2,0 

 

 

 

 

 

 

0,4 

0,1 

2,0 

 

 

 

 

 

 

0,5 

0 

2,0 

0 

0,5 

2,0 

 

Równocześnie oznacz zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi (do oznaczeń 

pobierz  0,5  i  0,1  ml;  w  tym  drugim  przypadku  próbę  uzupełnij  wodą  do  0,5  ml).  Po  upływie  30 

min zmierz absorbancję  prób przy  długości fali 

λ

 = 540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonaj 

względem próby zerowej nie zawierającej białka (próba 6). Zapisz wyniki w tabeli. Oblicz współ-

czynnik  kierunkowy  K.  Narysuj  krzywą  wzorcową  (zaleŜność  wartości  absorbancji  od  stęŜenia 

białka w próbie). Przy obliczaniu ilości białka w próbie stosuj obliczony współczynnik K. Z ozna-

czonej w próbie zawartości białka oblicz stęŜenie białka w surowicy. 

 

 

 

 

11 

Wytrącanie i denaturacja białek 

Wytrącanie białek 

 

Wytrącanie białek w punkcie izoelektrycznym 

Do  1  ml  0,1%  roztworu  kazeiny,  rozpuszczonej  w  50  mM  roztworze  octanu  sodu,  dodawać 

bardzo  powoli  pipetą  Pasteura,  cały  czas  delikatnie  wytrząsając,  około  1,5  ml  0,5  M  roztworu 

kwasu  octowego.  Obserwować  pojawianie  się  zmętnienia  pochodzącego  od  wytrącającego  się 

białka, które powinno rosnąć z upływem czasu. Po 5 min dodać porcjami jeszcze około 1,5 ml 

0,5 M roztworu kwasu octowego i obserwować czy wytrącona w pI kazeina rozpuszcza się po ob-

niŜeniu pH roztworu (wartość pI kazeiny wynosi 4,7) 

 

Frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu 

Do  wysalania  białek  stosujemy  najczęściej  związki  o  wysokim  powinowactwie  do  wody  tj. 

siarczan (VI) amonu lub siarczan (VI) sodu.  

Ćwiczenie  wykonujemy  w  probówkach  wirówkowych.  Do  2  ml

 

surowicy  (10-krotnie  roz-

cieńczonej  0,9%  roztworem  NaCl)  dodać  2  ml  nasyconego  roztworu  (NH

4

)

2 

SO

4

.  Po  zmieszaniu 

roztworów uzyskuje się półnasycenie (50% nasycenie) siarczanu (VI) amonu. Agregujące globuli-

ny odwirować w wirówce stołowej, a następnie zlać klarowny supernatant do suchej probówki 

wirówkowej.  Do  osadu  globulin  dodać  niewielką  ilość  wody  destylowanej  do  całkowitego  roz-

puszczenia  białek.  Do  przelanego  supernatantu  dodawać,  cały  czas  wytrząsając,  kryształki 

(NH

4

)

2

SO

4

,  tak  by  uzyskać  roztwór  nasycony  (kryształki  siarczanu  amonu  przestają  się  rozpusz-

czać). Wzrost siły jonowej roztworu powoduje wytrącanie się frakcji albumin.  

 

Wytrącanie białek surowicy krwi etanolem 

Do 0,5 ml surowicy 10x rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl i oziębionej w lodzie dodać 1 ml 

96% etanolu. Powstaje zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu 0,9% NaCl lub 

wodą.  

 

Denaturacja białek 

Termin ten dotyczy wszystkich zmian w strukturze cząsteczki białka, w wyniku których białko 

traci  swoje  biologiczne  właściwości.  Denaturacja  następuje  wówczas,  gdy  pod  wpływem  czynni-

ków fizycznych lub chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV-, III- lub II-rzędowa. 

 

12 

Denaturacja cieplna białek 

2 ml

 

1% roztworu albuminy lub 1% roztworu białka jaja kurzego ogrzać do zagotowania. Two-

rzy się biały osad wytrąconego białka.  

 

Denaturacja białek etanolem 

Rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton, eter) i detergenty działają na strukturę przestrzen-

ną  cząsteczki  białka,  osłabiając  wiązanie  hydrofobowe,  reagują  bezpośrednio  z  naładowanymi 

grupami na powierzchni cząsteczki i dezorganizują płaszcz wodny cząsteczki. Działanie denatu-

rujące etanolu objawia się dopiero przy większych jego stęŜeniach, po dłuŜszym czasie dzia-

łania i w wyŜszej temperaturze (20

0

- 30

0 

C). 

Do probówki dodać 1 ml 1% albuminy i 1 ml 96% etanolu. Po godzinie rozcieńczyć zawartość 

probówki wodą. Osad nie rozpuszcza się. Porównaj z ćwiczeniem, w którym białka były wytrą-

cane etanolem.  

 

Strącanie białek za pomocą kationów 

Białka w pH wyŜszym od pI posiadają ładunek ujemny i mogą reagować z kationami. Kationy 

metali alkalicznych dają sole dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast kationy me-

tali cięŜkich (Fe

2+

, Cu

2+

, Hg

2+

, Pb

2+

, Ag

+

) tworzą sole nierozpuszczalne. 

Do  0,5  ml  1%  roztworu  albuminy  dodać  parę  kropel  1%  roztworu  FeCl

3

.  Wytrąca  się  osad 

białczanu Ŝelaza (III). Wykonać analogiczną próbę z HgCl

2

, Pb(CH

3

COO)

2

 oraz AgNO

3

. 

 

Strącanie białek kwasem sulfosalicylowym i trójchlorooctowym 

                                  

     

COOH

OH

HO

3

S

                            

C

Cl

Cl

Cl

COOH

    

                                  

                                        

Kwas sulfosalicylowy                                       Kwas trójchlorooctowy 

Do  0,5  ml  1%  roztworu  albuminy  dodać  0,5  ml  10%  roztworu  kwasu  trójchlorooctowego.      

Końcowe stęŜenie kwasu niezbędne do odbiałczania nie powinno być niŜsze niŜ 5%. 

Do 0,5 ml

 

1% roztworu albuminy dodać kilka kropel 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego. 

 

 

 

13 

Zagadnienia do przygotowania: 

- budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego) 

- struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę) 

-wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek 

- białka proste i złoŜone; przykłady potranslacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych  

aminokwasów 

-podział białek ze względu na funkcję (przykłady) 

- kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową) 

-właściwości białek w roztworze (zaleŜność rozpuszczalności białek od pH, siły jonowej, stałej 

dielektrycznej rozpuszczalnika, temperatury) 

-zasada wytrącania białek w pI, wytrącania przez wysalanie lub obniŜenie stałej dielektrycznej 

roztworu 

- denaturacją białek (termiczna, wyŜsze stęŜenie etanolu, kationy metali cięŜkich, niektóre kwasy 

organiczne) 

Piśmiennictwo: 

Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005 

Biochemia – AL. Lehninger PWR i L, Warszawa, 1979  

Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005 

Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005