Określanie żywotności i proliferacji 

komórek metodami 

spektrofotometrycznymi 

Spektrofotometria 

 

 

Spektrofotometria UV-VIS oparta jest na pomiarze absorbancji 

A

l

 badanego roztworu przy określonej długości fali 

l 

(200 – 780 

nm) zgodnie z prawem Lamberta-Beera: 

 
 

A

l

= e

l

 

x l x c 

 

  e

l 

– współczynnik absorbcji 

 

l – grubość warstwy absorbującej 

 

c – stężenie analitu w roztworze 

 
 

Absorbancję definiujemy jako : 

 
    A

l

= 

log I

0

/I 

 
 

I

0

- natężenie promieniowania padającego na ośrodek 

 

I – natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek  

 

Źródło 
światła   

Monochromator 

filtr 

Rozdzielacz 
 

Płytka 96 
dołkowa 

detektor 

Określanie proliferacji i żywotności - test 

MTT 

 

 

Zasada testu: dehydrogenaza 

bursztynianowa, enzym obecny w 

wewnętrznej błonie mitochondrium 

przekształca rozpuszczalną w wodzie 

żółtą sól tetrazoliową - MTT (bromek-

3[4,5-dwumetylotiazylo-2-yl]-2,5-

dwufenylotetrazolu) do 

nierozpuszczalnych kryształów 

formazanu o barwie purpurowej. 

Kryształy rozpuszcza się stosując 

różnego rodzaju detergenty (np. SDS). 

Intensywność zabarwienia (mierzona 

spektrofotometrycznie) jest wprost 

proporcjonalna do ilości żywych 

komórek. W zależności od czasu 

inkubacji, test MTT może służyć do 

określania cytotoksyczności 

substancji (24h inkubacja) lub jej 

wpływu na proliferacje komórek 

(96h). 

 
Przekształcenie MTT do formazanu 

 
Płytka 96 dołkowa z wykonanym testem MTT 

dehydrogenaza 

redukcja 

Inne sole tetrazoliowe  

• XTT  - większa czułość, 

krótszy czas inkubacji oraz 

produkt rozpuszczalny w 

wodzie.  

• WSTs (Water soluble 

Tetrazolium salts) – 

Wykorzystując transport 

elektronów związany z 

NAD(P)H i 1-metoksy PMS 

dochodzi do redukcji WST 

na zewnątrz komórki 

(większa czułość, produkt 

rozpuszczalny w wodzie).   

XTT 

Stopień uszkodzenia błon komórkowych - 

test LDH   

 

 

Test pozwala ocenić 

cytotoksyczność związku. 

Badanie opiera się na pomiarze 

aktywności dehydrogenazy 

mleczanowej (LDH) uwalnianej do 

środowiska na skutek uszkodzenia 

błony komórkowej przez badaną 

substancje. LDH przekształca 

mleczan do pirogronianu, czemu 

towarzyszy redukcja NAD

+

 do 

NADH. Następnie diaforaza 

redukuje przy udziale NADH sól 

tetrazoliową (żółta) do formazanu 

(purpurowy). Intensywność 

barwy, mierzona 

spektrofotometrycznie jest 

proporcjonalna do ilości 

uwolnionego LDH, a więc jest 

miarą cytotoksyczności badanego 

związku.   

Neutral Red (NR) 

 

 

Wychwyt czerwieni obojętnej 

polega na pobieraniu barwnika 

(Neutral Red/Toluylene Red/Basic 

Red 5) przez żywe komórki i 

gromadzeniu go w lizosomach (słaby 

kation, pH lizosomów < pH 

cytoplazmy, co umożliwia NR 

wiązanie się miejscami anionowymi 

do macierzy lizosomalnej. Zazwyczaj 

3 godzinna inkubacja z roztworem 

NR). Następnie komórki utrwala się, 

lizuje i uwalnia barwnik. Komórki 

martwe lub uszkodzone nie pobierają 

NR. Ilość pochłoniętego barwnika jest 

więc wprost proporcjonalna do ilości 

żywych komórek co umożliwia 

przeprowadzenie pomiaru metodami 

spektrofotometrycznymi i określenie 

cytotoksyczności badanego związku. 

 

 

 

 

 
 

Immunoenzymatyczny test BrdU 

 

 

Polega na wykrywaniu przy 

pomocy przeciwciał 

monoklonalnych znakowanych 

enzymem (test ELISA) analogu 

tyminy - BrdU (5-bromo-2-

deoksyurydyny), która 

wbudowuje się do nowo 

syntezowanych nici DNA. Po 

denaturacji dsDNA, stosuje się 

przeciwciała anty-BrdU 

znakowane np. peroksydazą 

chrzanową, która przekształca 

bezbarwny substrat 

tetrametylbenzydyne (TMB) w 

barwny produkt (żółty, po 

zatrzymaniu reakcji kwasem 

siarkowym - niebieski). 

Intensywność zabarwienia jest 

proporcjonalna do poziomu 

syntezy DNA i liczby dzielących się 

komórek. 

 

 
BrdU 

 
Elementy testu BrdU