PCR - Z MAŁEJ ILOŚCI DUŻA ILOŚĆ W KRÓTKIM CZASIE.
PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na
przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących
określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to
metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet
bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomość sekwencji
otaczającej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cząsteczka
matrycy.
Typowa reakcja PCR polega na powtarzających się cyklach :
1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90°C. Syntetyczne
oligonukleotydy długości mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3`
końców kawałka DNA , którego powieleniem jesteśmy zainteresowani , dodane są w
dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.
2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C. DNA pozostaje zdenaturowany
ponieważ komplementarne łańcuchy są w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z
ilością starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z
komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służą jako startery do
syntezy DNA , którą prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza
izolowana z bakterii Thermus aqaticus.
3. Synteza odbywa się w temperaturze 72°C.
PCR
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
1 z 5
2010-04-04 13:25
Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95°C aby rozdysocjować
nowo powstałe dupleksy DNA. Później temperatura jest obniżana i zachodzi następna
runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej
długości. Stopniowo zaczynają przeważać fragmenty ograniczone straterami a
końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii
sekwencji pomiędzy primerami rośnie wykładniczo jak 2
n
gdzie n jest liczbą cykli.
Amplifikacja fragmentu D)A metodą PCR.
)umer
cyklu
Liczba dwuniciowych ,
zamplifikowanych cząsteczek D)A
1
0
2
0
PCR
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
2 z 5
2010-04-04 13:25
3
2
4
4
5
8
6
16
7
32
8
64
9
128
10
256
11
512
12
1024
13
2048
14
4096
15
8192
16
16 384
17
32 768
18
65 536
19
131 072
PCR
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
3 z 5
2010-04-04 13:25
20
262 144
21
524 288
22
1 048 576
23
2 097 152
24
4 194 304
25
8 388 608
26
16 777 216
27
33 544 432
28
67 108 864
29
134 217 728
30
268 435 456
31
536 870 912
32
1 073 741 824
Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy
sekwencjonowaniu.
ZASTOSOWA)IE :
PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA
izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :
- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych
- diagnostyce chorób dziedzicznych
- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie
- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce
PCR
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
4 z 5
2010-04-04 13:25
- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów
- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.
RODZAJE PCR :
RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu
dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej
sekwencji.
Na pewno zwiążą się one z DNA w jakimś miejscu a ponieważ jednorazowo do
każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie
sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległości od siebie w genomie ,
która pozwoli na wydajną amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad.
Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj
PCR znalazł zastosowanie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami
a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.
RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do
namnażania jest
mRNA
a nie jak zazwyczaj DNA.
ZAZĘBIO)A PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w
większym uprzednio namnożonym fragmencie.
PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez
naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.
PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy
w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to
szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach.
Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko
mierząc ilość
mRNA
.
SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY
WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO
(c) 1997, 1998 Biologia Molek ularna w Internecie
Webmaster
PCR
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
5 z 5
2010-04-04 13:25