ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
W ŻELACH
W ŻELACH
W ŻELACH
W ŻELACH AGAROZOWYCH
AGAROZOWYCH
AGAROZOWYCH
AGAROZOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
Katedra Genetyki Molekularnej
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
W ŻELACH
W ŻELACH
W ŻELACH
W ŻELACH AGAROZOWYCH
AGAROZOWYCH
AGAROZOWYCH
AGAROZOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
Katedra Genetyki Molekularnej
Metoda rozdzielania molekuł w polu elektrycznym na podstawie ich wielko
ś
ci,
kształtu i ładunku.
Elektroforeza kwasów
nukleinowych
jedna z głównych metod identyfikacji,
rozdzielania i oczyszczania kwasów
nukleinowych
stosowana zarówno w celach
analitycznych, jak i preparatywnych
Elektroforeza analityczna
Zastosowanie:
a) Ustalenie wielkości fragmentu DNA lub RNA na podstawie porównania tempa
migracji badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych
b) Ustalenie ilości preparatu na podstawie porównania intensywności
fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego
fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego
c) Identyfikację ewentualnej degradacji preparatu. Degradacja widoczna jest na
żelu w postaci smugi, która jest wynikiem rozpadu DNA lub RNA na mniejsze
fragmenty
d) Identyfikację zanieczyszczeń obecnych w preparacie.
Elektroforeza preparatywna
Umożliwia izolację z żelu tej części
preparatu, którą zamierzamy użyć
do dalszych etapów badań –
do dalszych etapów badań –
stosujemy wówczas elucję z żelu.
Migracja w żelach
elektroforetycznych
W polu elektrycznym przy lekko
zasadowym pH ujemnie naładowane
cząsteczki DNA lub RNA migrują w kierunku
cząsteczki DNA lub RNA migrują w kierunku
elektrody (+) anody i przeciskając się przez
pory żelu rozdzielają się pod względem
wielkości.
duże cząsteczki wędrują wolniej niż małe
Rodzaje żeli
elektroforetycznych
żele poliakrylamidowe – stosuje się do rozdziałów mniejszych fragmentów
DNA (5-2000 pz).
Elektroforeza przeprowadzona we własciwych warunkach umożliwia
rozdział cząsteczek kwasów nukleinowych z dokłądnością do jednego
rozdział cząsteczek kwasów nukleinowych z dokłądnością do jednego
nukleotydu
żele agarozowe – można w nich rozdzielać znacznie większe cząsteczki
kwasów nukleinowych (50 – 30000 pz)
Nie umożliwiają uzyskania tak wysokiej rozdzielczości jak żele
poliakrylamidowe
Elektroforeza w żelach
poliakrylamidowych
ś
el poliakrylamidowy powstaje w wyniku
polimeryzacji N,N metylenobisakrylamidu z
monomerami akrylamidu w obecno
ś
ci wolnych
rodników dostarczanych przez nadsiarczan
amonu (APS) i stabilizowanych przez TEMED
(N, N, N , N - tetrametylenodiamina).
Rozdzielczość żeli zależy od
stężenia poliakrylamidu
St
ęŜ
enie poliakrylamidu [%]
Zakres długo
ś
ci rozdzielanego
liniowego DNA (kpz)
3,5
1000-2000
5,5
80-500
8,0
60-400
12,0
40-200
15,0
25-150
20,0
6-100
Elektroforeza w żelach
poliakrylamidowych
Elektroforeza w żelach
agarozowych
Agaroza – frakcja agaru oczyszczona z
krasnorostów, polisacharyd zbudowany z
około 800 liniowo połączonych reszt
heksozy
Wielość porów żelu agarozowego zależy od
stężenia agarozy i określa zakres wielkości
stężenia agarozy i określa zakres wielkości
rozdzielanego DNA lub RNA
Wadą elektroforezy agarozowej jest słaba
rozdzielczość frakcji DNA różniącego się
poniżej 5% wielkości.
Stężenie agarozy i zakres
rozdzielanych fragmentów DNA
St
ęŜ
enie agarozy [%]
Zakres długo
ś
ci rozdzielanego
liniowego DNA (kpz)
0,3
5-60
0,6
1-20
0,6
1-20
0,7
0,8-10
0,9
0,5-7
1,2
0,4-6
1,5
0,2-3
2,0
0,1-2
Elektroforeza w żelach
agarozowych
Bufory elektroforetyczne
Bufory elektroforetyczne
Lp.
Nazwa buforu
Stężenie robocze
Stężenie roztworu wyjściowego (składniki na 1
litr)
1
Tris - octan (TAE)
1x: 0.04M Tris - octan,
0.001M EDTA
50x: 242g Tris base,
57.1 ml lodowatego kwasu octowego,
100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
2
Tris - fosforan (TPE)
1x: 0.09M Tris - fosforan,
0.002M EDTA
10x: 108g Tris - base,
15.5 ml 85% kwasu fosforowego
3
Tris - boran (TBE)
0.5x: 0.045M Tris - boran,
0.001M EDTA
5x: 54gTris - base,
27.5g kwasu bornego,
20 ml 0.5M EDTA pH 8.0
4
Alkaliczny
1x: 50mM NaOH,
1mM EDTA
10x: 5ml 10N NaOH,
2ml 0.5M EDTA pH 8.0
Markery wielkości
Wzorce o znanej wielko
ś
ci mas
cz
ą
steczkowych słu
Ŝą
ce do okre
ś
lenia
wielko
ś
ci analizowanych fragmentów DNA
b
ą
d
ź
RNA
odpowiednio przygotowane fragmenty DNA
odpowiednio przygotowane fragmenty DNA
powstaj
ą
ce w wyniku hydrolizy DNA faga
lambda lub plazmidów enzymami
restrykcyjnymi EcoRI i HindIII
syntetyczne DNA o okre
ś
lonych wielko
ś
ciach
fragmentów
Barwienie żeli
Metody wizualizacji kwasów
nukleinowych:
barwienie bromkiem etydyny
barwienie srebrem
SYBR Green
radioaktywnymi izotopami (siarki lub
fosforu)
Bromek etydyny
Bromek etydyny interkaluje pomiędzy
sąsiednie pary zasad dwuniciowego DNA.
Stwierdzono także większe powinowactwo
bromku do dwuniciowego DNA (dsDNA)
niż do jednoniciowego (ssDNA), przez co
barwienie struktur jednoniciowych w
barwienie struktur jednoniciowych w
niektórych sytuacjach może okazać się
niewystarczające.
Kompleks bromek etydyny /DNA może być
łatwo uwidoczniony fluorescencyjnie w
świetle UV.
Stężenie bromku etydyny 5µg/ml
Bromek etydyny jest silnym
mutagenem!
Wykonanie ćwiczeń
Elektroforeza w
Ŝ
elu agarozowym
1)
Przygotowa
ć
2%
Ŝ
el agarozowy w buforze TAE . Nawa
Ŝ
k
ę
agarozy rozpu
ś
ci
ć
w TAEx1, podgrza
ć
do temperatury 100
°
C, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów. Ostudzi
ć
przygotowany roztwór.
2)
Wla
ć
roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z
umocowanym grzebieniem formuj
ą
cym studzienki do nanoszenia próbek.
3)
Po zastygni
ę
ciu agarozy zala
ć
Ŝ
el buforem elektroforetycznym TAEx1, powierzchnia buforu
powinna znajdowa
ć
si
ę
około 1 cm ponad górn
ą
powierzchni
ą
Ŝ
elu. Powoli wyj
ąć
grzebie
ń
, tak
aby nie uszkodzi
ć
studzienek
Ŝ
elu.
4)
Wymiesza
ć
w probówce eppendorfa 10 µl wcze
ś
niej przygotowanego roztworu DNA i 2µl buforu
obci
ąŜ
aj
ą
cego, dokładnie wymiesza
ć
, cało
ść
nanie
ść
na
Ŝ
el.
5)
Podł
ą
czy
ć
elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.
6)
Elektroforez
ę
prowadzi
ć
przez 1 godz. przy napi
ę
ciu 80 V.
7)
Po zako
ń
czeniu elektroforezy
Ŝ
el wybarwi
ć
w bromku etydyny (5µg/ml) około 5 min
8)
ś
el obejrze
ć
w
ś
wietle UV
λ
= 320 nm.
Elektroforeza w
Ŝ
elu poliakrylamidowym
1)
Przygotowa
ć
8% roztwór akrylamidu (st
ęŜ
enie wyj
ś
ciowe 30%) w buforze TBEx1
2)
Umyte i odtłuszczone płyty szklane zło
Ŝ
y
ć
(wkładaj
ą
c pomi
ę
dzy nie uszczelk
ę
), cało
ść
przymocowa
ć
klipsami do podstawki do wylewania
Ŝ
elu.
3)
Wla
ć
roztwór akrylamidu do momentu wypełnienia całej powierzchni pomi
ę
dzy płytami.
4)
Wło
Ŝ
y
ć
grzebie
ń
. Polimeryzacja
Ŝ
elu trwa 30 min, po spolimeryzowaniu wyj
ąć
uszczelk
ę
, umie
ś
ci
ć
płyty w aparacie do elektroforezy.
5)
Napełni
ć
aparat buforem TBEx1. Wyj
ąć
grzebie
ń
, przepłuka
ć
studzienki buforem
elektroforetycznym.
6)
Przygotowane wcze
ś
niej próbki DNA zmiesza
ć
z buforem obci
ąŜ
aj
ą
cym (15 µl DNA + 3 µl buforu
obci
ąŜ
aj
ą
cego) i nanie
ść
do studzienek.
7)
Do jednej studzienki nanie
ść
3 µl markera (100 bp).
8)
Podł
ą
czy
ć
elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.
9)
Elektroforez
ę
prowadzi
ć
przez 1,5 godz. przy napi
ę
ciu 80 V/120 mA
10) Po zako
ń
czeniu elektroforezy
Ŝ
el wybarwi
ć
w bromku etydyny (5µg/ml) przez około 5 min
11)
ś
el obejrze
ć
w
ś
wietle UV
λ
= 320 nm
.