tytu³

SPIS TRE

WST

P ......................................................................................................................... 6

1.1

Allogeniczna transplantacja komórek hematopoezy – wprowadzenie ......................... 6

1.2

Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi........................................... 7

1.2.1

Klasyfikacja cGvHD........................................................................................... 10

1.2.2

Leczenie cGvHD ............................................................................................... 13

1.3

Chimeryzm hematopoetyczny .................................................................................... 14

1.3.1

Metody okre

lania i monitorowania chimeryzmu hematopoetycznego ............ 14

1.3.2

Kliniczne znaczenie chimeryzmu ...................................................................... 18

ZAŁO

ENIA I CEL PRACY ........................................................................................ 20

MATERIAŁ I METODY ............................................................................................... 21

3.1

Badani chorzy ............................................................................................................. 21

3.1.1

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi................................................. 23

3.2

Metody bada

............................................................................................................. 24

3.2.1

Izolacja leukocytów krwi obwodowej................................................................. 24

3.2.2

Ocena chimeryzmu ........................................................................................... 26

3.3

Analiza statystyczna ................................................................................................... 29

WYNIKI ....................................................................................................................... 30

4.1

Chimeryzm hematopoetyczny w komórkach j

drzastych krwi obwodowej ................ 30

4.1.1

Charakterystyka chorych w zale

ci od rodzaju chimeryzmu....................... 31

4.2

Pó

ne powikłania poprzeszczepowe.......................................................................... 35

4.2.1

Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi ............................... 35

4.2.1.1

cGvHD a rodzaj materiału przeszczepowego ................................................. 37

4.2.1.2

cGvHD a aGvHD ............................................................................................. 38

4.2.1.3

Charakterystyka stosowanego leczenia cGvHD ............................................. 41

4.2.1.4

Zgony w grupie z cGvHD ................................................................................ 42

4.2.2

Wznowa choroby zasadniczej........................................................................... 44

4.2.3

Zgony pó

ne ..................................................................................................... 45

4.3

Zale

ść

pomi

dzy typem pełnego chimeryzmu a powikłaniami

poprzeszczepowymi ................................................................................................... 47

4.3.1

Typ pełnego chimeryzmu a cGvHD .................................................................. 47

4.3.1.1

sto

ść

wyst

powania cGvHD w zale

ci od typu CC............................. 47

4.3.1.2

cGvHD a aGvHD w zale

ci od typu pełnego chimeryzmu ........................ 48

4.3.1.3

Rodzaj CC a ci

ęŜ

ść

przebiegu cGvHD........................................................ 51

4.3.1.4

Zale

ść

pomi

dzy czasem stwierdzenia pełnego chimeryzmu a

wyst

pieniem objawów cGvHD ....................................................................... 53

4.3.2

Typ CC a wznowa choroby zasadniczej .......................................................... 54

4.3.3

Przyczyna zgonów pó

nych w zale

ci od rodzaju CC ................................ 56

4.4

Chimeryzm w poszczególnych subpopulacjach leukocytów krwi obwodowej............ 58

OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA ..................................................................... 61

5.1

Chimeryzm hematopoetyczny .................................................................................... 61

5.2

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi .......................................................... 67

5.3

Wznowa choroby zasadniczej .................................................................................... 70

WNIOSKI .................................................................................................................... 74

STRESZCZENIE ........................................................................................................ 75

SPIS TABEL

Tabela I Czynniki ryzyka cGvHD .................................................................................................. 9

Tabela II Oryginalna i zmodyfikowana klasyfikacja cGvHD........................................................ 11

Tabela III Najcz

ęś

ciej stosowany model prognostyczny dla chorych z cGvHD.......................... 12

Tabela IV Charakterystyka dawców i biorców ............................................................................ 22

Tabela V Stopniowanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi............................ 23

Tabela VI Charakterystyka przeciwciał u

ytych w badaniu ........................................................ 25

Tabela VII. Charakterystyka pacjentów oraz przeszczepu w zale

ci od czasu

uzyskania CC.............................................................................................................. 34

Tabela VIII Charakterystyka chorych bez i z cGvHD .................................................................. 36

Tabela IX. Charakterystyka cGvHD w grupie chorych z wczesnym i pó

nym chimeryzmem .... 53

Tabela X Charakterystyka wznowionych chorych w grupie z pó

nym CC ................................. 55

Tabela XI Charakterystyka wznowionych chorych w grupie chorych z wczesnym

chimeryzmem.............................................................................................................. 55

SPIS RYCIN

Rysunek 1 Grupy chorych w zale

ci od rodzaju chimeryzmu............................................. 30

Rysunek 2 Zmiana odsetkowego udziału CC w kolejnych dobach kontrolnych ....................... 31

Rysunek 3 Zmienna wieku biorcy w zale

ci od rodzaju osi

gni

tego chimeryzmu............ 32

Rysunek 4 Zmienna wieku dawcy w zale

ci od rodzaju osi

gni

tego chimeryzmu ............. 33

Rysunek 5 Cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD ............................................................................. 35

Rysunek 6 cGvHD w zale

ci od rodzaju materiału przeszczepowego ............................... 37

Rysunek 7 Wyst

powanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w badanej

grupie chorych ......................................................................................................... 38

Rysunek 8 Wyst

powanie aGvHD u chorych z rozległa postaci

cGvHD w porównaniu do

chorych bez cGvHD................................................................................................. 39

Rysunek 9 Wyst

powanie cGvHD w zale

ci od aGvHD..................................................... 40

Rysunek 10 Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi w zale

ci od rozległo

cGvHD ..................................................................................................................... 40

Rysunek 11 Typ cGvHD w zale

ci od rodzaju pocz

tku..................................................... 41

Rysunek 12 Ilo

ść

leków stosowanych w terapii immunosupresyjnej ........................................ 42

Rysunek 13 Przyczyny zgonu w zale

ci od wyst

powania cGvHD .................................... 43

Rysunek 14 Prawdopodobie

stwo prze

ycia w grupie chorych z i bez cGvHD....................... 43

Rysunek 15 Wznowa choroby zasadniczej w zale

ci od diagnozy .................................... 44

Rysunek 16 Przyczyny zgonów pó

nych.................................................................................. 45

Rysunek 17 Krzywa prze

ycia w badanej grupie 51 chorych................................................... 46

Rysunek 18 cGvHD w grupach chorych z wczesnym i pó

nym chimeryzmem ....................... 47

Rysunek 19 Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi w zale

ci od rodzaju

pełnego chimeryzmu ............................................................................................... 48

Rysunek 20 Cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD w zale

ci od aGvHD w grupie chorych

z wczesnym chimeryzmem...................................................................................... 49

Rysunek 21 Cz

sto

ść

wyst

powanie cGvHD w zale

ci od stopnia aGvHD w grupie chorych

z pó

nym CC ........................................................................................................... 50

Rysunek 22 Typ pocz

tku cGvHD w zale

ci od czasu uzyskania CC................................ 51

Rysunek 23 Rodzaj pełnego chimeryzmu a terapia cGvHD..................................................... 52

Rysunek 24 Rodzaj pełnego chimeryzmu a zgony z powodu cGvHD....................................... 52

Rysunek 25 Korelacja mi

dzy czasem uzyskania CC a ró

nic

czasu pomi

dzy czasem do

uzyskania CC a czasem wyst

pienia cGvHD ......................................................... 54

WST

1.1 Allogeniczna transplantacja komórek hematopoezy – wprowadzenie

Transplantacja komórek hematopoetycznych (Hematopoietic Stem Cell

Transplantation HSCT) jest obecnie uznan

metod

leczenia chorób rozrostowych

układu krwiotwórczego, wrodzonych zaburze

metabolicznych i immunologicznych. Jej

wprowadzaniu w latach 60tych towarzyszył du

y sceptycyzm, obecnie na całym

wiecie zabiegowi przeszczepienia szpiku ka

dego roku poddawanych jest tysi

chorych. Znaczny post

p zarówno w post

powaniu przedprzeszczepowym: kwalifikacji

chorych, oznaczaniu antygenów HLA, a tak

e wprowadzenie profilaktyki choroby

przeszczep przeciwko gospodarzowi i post

py w terapii powikła

infekcyjnych w istotny

sposób poprawiły wyniki transplantacji. Nadal ogromnym wyzwaniem pozostaje

zmniejszenie

miertelno

ci zwi

zanej z przewlekł

chorob

przeszczep przeciwko

gospodarzowi, a u chorych przeszczepionych z powodu chorób rozrostowych

- wznow

choroby zasadniczej (19;21;63;65;100;106).

Allogeniczne przeszczepianie szpiku jest skomplikowan

procedur

, w której

komórki hematopoetyczne biorcy zostaj

zast

pione komórkami dawcy. W przypadku

chorób wrodzonych lub aplazji szpiku stanowi to istot

leczenia, natomiast

w chorobach nowotworowych zabieg ten umo

liwia eskalacj

dawek chemioterapii

i napromieniania z pomini

ciem ogranicze

wynikaj

cych z mielotoksyczno

ci.

Dodatkowo, korzystny efekt przeciwnowotworowy wynika z reakcji immunologicznej

powodowanej przez przeszczepiane limfocyty T dawcy (Graft versus Leukemia - GvL;

Graft versus Tumor GvT)(18;19;22;31;96;105;115;130).

Tradycyjnie post

powanie przygotowawcze do przeszczepu (kondycjonowanie)

polegaj

ce na podaniu wysokodawkowanej (mieloablacyjnej) chemioterapii lub

radiochemioterapii (w celu zniszczenia komórek nowotworowych, wytworzenia wolnej

przestrzeni w szpiku oraz zapobie

enia odrzuceniu przeszczepu) było uznawane za

warunek konieczny do uzyskania wszczepienia. Obecnie przeprowadza si

równie

procedury

przeszczepienia

poprzedzone

zredukowanym,

niemieloablacyjnym

kondycjonowaniem. Post

powanie to nie prowadzi do nieodwracalnej aplazji szpiku

działanie

mieloablacyjne

zostało

zast

pione

uniemo

liwiaj

odrzucenie

przeszczepu terapi

immunoablacyjn

. Proces zamiany hematopoezy biorcy na

komórki dawcy (pełny chimeryzm) uzyskiwany jest przez etap mieszanego chimeryzmu

i niekiedy wymaga wspomo

enia infuzj

limfocytów dawcy (Donor Lymphocytes

Infusion - DLI). Efekt przeciwnowotworowy wynika w tej sytuacji głownie z reakcji GvL.

Zalet

post

powania niemieloablacyjnego jest unikni

cie ci

ęŜ

kich powikła

zwi

zanych

z wysokodawkow

chemioterapi

, co umo

liwia kwalifikowanie do przeszczepu

chorych w coraz starszym wieku, a tak

e obci

ąŜ

onych chorobami współistniej

cymi

(20;58;64;116;119;121;122;122;123).

Głównym

ródłem pozyskiwania komórek progenitorowych jest krew szpikowa

oraz komórki progenitorowe pobrane z krwi obwodowej. Komórki progenitorowe krwi

powinowej w przypadku przeszczepu osób dorosłych maj

marginalne znaczenie

(25;61;106).

Zasadnicz

przyczyn

niepowodze

we wczesnym okresie poprzeszczepowym

(do 100 doby po przeszczepie) s

powikłania wynikaj

ce z aplazji szpiku (krwawienia,

powikłania infekcyjne), toksyczno

ci wysokodawkowanej terapii oraz ostra choroba

przeszczep przeciwko gospodarzowi. Do najwa

niejszych powikła

pó

nych (powy

100 doby po przeszczepie) nale

Ŝą

przewlekła choroba przeszczep przeciwko

gospodarzowi, infekcje oportunistyczne, wznowa choroby zasadniczej, oraz wtórne

nowotwory (5;65;101;126).

1.2 Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi

Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (chronic Graft versus

Host Disease - cGvHD) jest najpowa

niejszym i najcz

stszym powikłaniem pó

nym

transplantacji allogenicznej. Wyst

puje u 30 - 70% pacjentów, którzy prze

yli pierwsze

100 dni po transplantacji, a jej cz

sto

ść

w ostatnich latach znacz

co si

zwi

ksza

(9;78;98). Spowodowane jest to wzrostem ilo

ci transplantacji niemieloablacyjnych,

wzrostem cz

sto

ci stosowania infuzji limfocytów dawcy (leczenie wznowy choroby

zasadniczej, uzupełnienie terapii niemieloablacyjnej), zwi

kszeniem ilo

ci HSCT

wykonywanych od dawców alternatywnych (w pełni zgodnych lub niezgodnych

w układzie

HLA

niespokrewnionych,

oraz

rodzinnych

przeszczepów

haploidentycznych) (104). Nie bez znaczenia pozostaje równie

coraz cz

stsze

wykorzystanie jako

ródła materiału przeszczepowego komórek progenitorowych

hematopoezy pobranych z krwi obwodowej (Peripheral Blood Stem Cell

Transplantation - PBSCT), gdzie zwi

kszone ryzyko cGvHD zostało potwierdzone

w wielu badaniach (26;27;36;46;47;53;95;124;129).

cGvHD obok wznowy choroby zasadniczej jest obecnie główn

przyczyna

miertelno

ci pó

nej u chorych poddanych allogenicznemu przeszczepieniu szpiku

(powoduje 25% zgonów pó

nych u chorych poddanych HSCT z powodu ostrej

białaczki i ok. 60% u chorych przeszczepionych z powodu anemii aplastycznej).

Przyczyn

mierci w przebiegu cGvHD mo

e by

niewydolno

ść

zaj

tego narz

du, ale

przede wszystkim powikłania infekcyjne spowodowane zarówno eskalacj

leczenia

immunosupresyjnego jak i wyst

puj

cymi w tej chorobie zaburzeniami rekonstytucji

immunologicznej. Pojawiaj

równie

doniesienia,

e u chorych z cGvHD cz

ęś

ciej

obserwuje si

nowotwory wtórne, b

ce efektem przewlekłego procesu zapalnego,

terapii immunosupresyjnej i zaburze

immunologicznych (43;44). Wreszcie

konsekwencj

zaj

cia narz

dowego cGvHD jest znacz

ce pogorszenie jako

ycia

chorego lub nawet kalectwo (26;27;46;47;53;66;77;78;85;101;103;126;129;151).

Z drugiej strony jednak u chorych, u których obserwuje si

cGvHD rzadziej dochodzi do

wznowy choroby zasadniczej, co jest spowodowane faktem,

e efekt przeszczep

przeciwko białaczce cz

ęś

ciowo wynika z reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi

(78;107;141).

Tradycyjnie chorob

przewlekł

rozpoznaje si

eli jej objawy wyst

puj

powy

ej doby 100, jednak u niektórych chorych objawy charakterystyczne dla cGvHD

pojawiaj

znacznie wcze

niej i to typ morfologiczny zmian – wyst

pienie objawów

charakterystycznych dla choroby przewlekłej powinno by

podstaw

rozpoznania, a nie

arbitralnie wprowadzony podział czasowy (52). Zwykle pierwsze objawy pojawiaj

pomi

dzy 3 – 24 miesi

cem po przeszczepieniu (mediana 4 - 5 miesi

cy), bardzo

rzadko przed doba 80 a tylko u 5% powy

ej 12 miesi

cy (66;151).

Patogeneza cGvHD pozostaje nadal niewyja

niona. Istot

procesu wydaje si

defekt zarówno centralnych jak i obwodowych mechanizmów tolerancji, co prowadzi do

ekspansji alloreaktywnych limfocytów T. Nowopowstaj

ce limfocyty T niszcz

tkanki

docelowe w bezpo

rednim ataku cytolitycznym, poprzez wydzielanie cytokin zapalnych

powoduj

cych włóknienie narz

dów. U chorych z cGvHD obserwuje si

zaburzenia

prowadz

ce do przewagi komórek Th2 co manifestuje si

podwy

szonym poziomem

cytokin jak IL4 czy IL5. Efektem tego jest aktywacja komórek B z produkcj

autoprzeciwciał. Mimo

e cGvHD przypomina nakładanie si

w ró

nym stopniu chorób

tkanki ł

cznej, w których główn

rol

odgrywa obecno

ść

autoprzeciwciał, nie udało si

do tej pory jednoznacznie udowodni

ich udziału w patogenezie tej choroby. Wykazano

natomiast,

e wydzielane cytokiny stymuluj

fibroblasty do produkcji kolagenu i jego

odkładania w tkankach, co jest jednym z patomorfologicznych wykładników choroby

(49;66;77;103;151).

Brak zrozumienia patofizjologii cGvHD jest niew

tpliwie jednym z czynników

uniemo

liwiaj

cych znacz

cy post

p w leczeniu tej choroby. Tym bardziej istotne

wydaj

działania prowadz

ce do zmniejszenia ryzyka wyst

pienia klinicznie istotnej

choroby poprzez celowe unikanie modyfikowalnych czynników wpływaj

cych na rozwój

tego powikłania. Do działa

takich nale

y dobór najbardziej optymalnego dawcy, pod

wzgl

dem płci i wieku, wybór materiału przeszczepowego czy ograniczenie ilo

komórek CD3 w przetaczanym materiale (66;77;103).Tabela I

Tabela I Czynniki ryzyka cGvHD

Biorca

Dawca oraz
charakterystyka przeszczepu

Przebieg
poprzeszczepowy

Powszechnie uznane

Starszy wiek

Dawca kobieta dla m

ęŜ

czyzny

aGvHD

CML

Przeszczep niezgodny w układzie HLA

Anemia aplastyczna

Przeszczep od dawcy
niespokrewnionego

PBSCT

Infuzja limfocytów dawcy

a ilo

ść

komórek T w materiale

przeszczepowym

Przypuszczalne (dyskusyjne)

Biorca CMV (+)

Ró

nice etniczne mi

dzy dawc

i biorc

Glikokortykosteroidy
w profilaktyce
aGvHD

Reaktywacja zaka

enia

CMV

Rzadziej u chorych po przeszczepie

z krwi p

powinowej

a ilo

ść

komórek

CD34 w materiale
przeszczepowym
(PBSCT)

Splenektomia

Brak metotreksatu
w profilaktyce
aGvHD (PBSCT)

Klinicznie cGvHD przebiega jako pleomorficzny zespół i mo

e dotyczy

praktycznie ka

dego układu. Do najcz

ęś

ciej zaj

tych narz

dów nale

Ŝą

: skóra (dwie

postacie: z obecno

zmian lichenoidalnych lub sclerodermii) 65-80%, jama ustna

48-72%, w

troba 40-73%, oczy 18-47%. Rzadziej zmiany dotycz

przewodu

pokarmowego / utraty masy ciała 16-26%, płuc 10-15%, przełyku 6-8% i stawów 2-12%

(66).

1.2.1 Klasyfikacja cGvHD

Obecna klasyfikacja cGvHD obejmuje okre

lenie typu rozwoju choroby w zale

ci od

wcze

niejszego wyst

pienia ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi,

ocen

rozległo

ci pod k

tem wskaza

do terapii immunosupresyjnej oraz ryzyka

niekorzystnego przebiegu choroby.

U wi

kszo

ci pacjentów rozwój choroby przewlekłej poprzedzony jest

wyst

pieniem ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (acute Graft versus

Host Disease aGvHD). Je

eli objawy ostrej choroby płynnie przechodz

w chorob

przewlekł

typ ten nazywamy post

puj

cym (progressive), je

eli pojawienie si

choroby przewlekłej oddzielone jest okresem ust

pienia objawów aGvHD typ ten

nazywamy wyciszonym (quiscent lub interrrupted). Natomiast wyst

pienie cGvHD bez

poprzedzenia chorob

ostr

- de novo. Według IBMTR (International Bone Marrow

Transplant Registry) typ post

puj

cy stanowi 20-30%, wyciszony 30 - 40%, a de novo

35% cGvHD u chorych poddanych transplantacji od HLA zgodnego rodze

stwa (66)

Okre

lenia typu rozwoju choroby ma ogromne znaczenie prognostyczne. W najgorzej

rokuj

cym typie o rozwoju post

puj

cym wg niektórych autorów

miertelno

ść

nawet 50 - 60% i typ ten wyodr

bnia grup

chorych wymagaj

cych szczególnie

intensywnej terapii immunosupresyjnej (85).

Pierwotna klasyfikacja Seattle definiuj

ca rozległo

ść

w oparciu o podział

choroby na posta

ograniczon

lub rozległ

ustalona została w latach 80-tych na

podstawie badania histopatologicznego narz

dów 20 pacjentów (120). Ograniczone

zaj

cie skóry lub/i łagodne zaj

cie w

troby zostało okre

lone jako choroba

ograniczona niewymagaj

ca systemowego leczenia immunosupresyjnego. Natomiast

uogólnione zmiany skórne lub zaj

cie innych narz

dów oraz dysfunkcja w

troby było

traktowane jako posta

rozległa, wymagaj

ca terapii systemowej. Obecnie

obowi

zuj

ca, zmodyfikowana klasyfikacja w bardziej precyzyjny sposób okre

stopie

rozległo

ci, wprowadzaj

c mi

dzy innymi

cisłe kryteria ilo

ciowe rozpoznania

(79) (

Tabela

II.) Minusem tej klasyfikacji pozostaje jej niskie znaczenie prognostyczne .

Tabela II Oryginalna i zmodyfikowana klasyfikacja cGvHD

Oryginalna klasyfikacja Seattle
(Shulman et al.,1980)

Zmodyfikowana klasyfikacja Seattle (Lee et al., 2003)

Posta

ograniczona

1. ograniczone zaj

cie skóry

1. Zmiany na

luzówkach jamy ustnej w przebiegu

cGvHD, dodatnia biopsja skóry lub wargi bez innych
objawów cGvHD

2.dysfunkcja w

troby spowodowana

cGvHD

2. Zwi

kszona aktywno

ść

fosfatazy alkalicznej (FALK

≤

2xnorma, AST, ALT

≤

3xnorma, bilirubina całkowita

≤

27,3

mol/l) z dodatni

biopsj

skóry lub wargi bez

innych objawów cGvHD

3. Niewielkie zmiany skórne: mniej ni

6 zmian

grudkowo - łuskowych, rumie

<20%powierzchni ciała

(BSA), lub rumie

<50% BSA, dodatnia biopsja skóry

bez innych objawów cGvHD

4. Dodatni test Schirmera

≤

5 mm bez innych zmian w

narz

dzie wzroku, dodatnia biopsja skóry lub wargi

bez innych objawów cGvHD

5. Zmiany w narz

dach płciowych potwierdzone

biopsj

bez innych objawów cGvHD

Posta

rozległa

1. uogólnione zaj

cie skóry

1. Zaj

cie 2 lub wi

cej narz

dów w przebiegu cGvHD,

potwierdzone biopsj

jednego z nich

2. Karnofsky<60%, utrata masy ciała

≥

15%,

nawracaj

ce infekcje bez innej przyczyny,

potwierdzona biopsj

cGvHD w jakimkolwiek innym

narz

dzie

3. Potwierdzone biopsj

zaj

cie skóry o powierzchni

kszej ni

w postaci ograniczonej

4. Twardzina

5. Onycholysis(oddzielanie si

ło

yska od paznokcia)

lub onychodystrofia, potwierdzona biopsj

cGvHD w

jakimkolwiek narz

dzie

2. Ograniczone zmiany skórne lub
dysfunkcja w

troby w przebiegu

cGvHD plus:

a. w biopsji przewlekłe post

puj

zapalenie w

troby, martwica

mostowa, marsko

ść

troby

b. zmiany oczne (dodatni test
Schirmera

≤

5 mm) lub

c. potwierdzone biopsj

zmiany

luzówek jamy ustnej lub gruczołów

linowych

d. zaj

cie jakiegokolwiek innego

organu

6. Zapalenie obturacyjne oskrzelików nie
spowodowane inn

przyczyn

7. Dodatnia biopsja w

troby lub (FALK) >2xnorma,

AST, ALT > 3xnorma, bilirubina całkowita > 27,3

mol/l)

z potwierdzeniem cGvHD w innym narz

dzie

8. Potwierdzone biopsj

zmiany górnego lub dolnego

odcinaka przewodu pokarmowego

9. Zapalenie powi

zi lub błon surowiczych bez innej

przyczyny; Przykurcze spowodowane przez cGvHD

W ostatnim okresie czasu coraz wi

ksze znaczenie w ocenie cGvHD maj

ró

ne modele prognostyczne oparte na obecno

ci niekorzystnych klinicznych

czynników ryzyka. Do potwierdzanych przez wszystkich badaczy złych czynników

prognostycznych nale

y zaj

cie skóry, poziom płytek krwi poni

ej 100G/l i typ

post

puj

cy (2;66;85). Niektórzy autorzy zaliczaj

do tych czynników równie

zaj

cie

przewodu pokarmowego i niski wska

nik oceny stanu ogólnego (Karnofsky). Jeden

z cz

ęś

ciej proponowanych modeli prognostycznych stworzony przez grup

z Baltimore

przedstawia

Tabela III

(2).

Tabela III Najcz

ęś

ciej stosowany model prognostyczny dla chorych z cGvHD

Czynnik ryzyka:

A Zaj

cie >50% powierzchni skóry

B poziom płytek krwi <100G/l

C post

puj

cy typ choroby

Mimo wprowadzonych zmian w klasyfikacji i w ocenie zaawansowania cGvHD

nadal podkre

la si

ich ograniczenia. Chorzy z rozpoznan

postaci

rozległa choroby

stanowi

bardzo heterogenn

grup

, co w du

ej mierze utrudnia ocen

skuteczno

leczenia i rokowania. Próby wprowadzenia podziału choroby rozległej na łagodn

umiarkowan

i ci

ęŜ

nie zyskały powszechnego uznania, ze wzgl

du na du

subiektywizm oceny wynikaj

cy z do

wiadcze

rodka i braku jednoznacznych

kryteriów oceny. W ostatnim czasie wysuni

to propozycj

standaryzacji kryteriów

rozpoznania oraz oceny zaawansowania cGvHD, poprzez wprowadzenie systemu

oceny ka

dego zaj

tego narz

du punktacj

od 0-3 (oceny ci

ęŜ

ci oraz zaburzenia

funkcji narz

du)(52).

Grupa ryzyka

Kryteria

Niskie

Bez czynników ryzyka

Umiarkowane

1 czynnik ryzyka

Wysokie

2 czynniki ryzyka

Bardzo wysokie

3 czynniki ryzyka

1.2.2 Leczenie cGvHD

Podstaw

wł

czenia systemowej terapii immunosupresyjnej jest rozpoznanie

rozległej cGvHD. Najskuteczniejszym lekiem jest prednizon stosowany w dawce

pocz

tkowej 1mg/kg masy ciała. Nie ma jednoznacznych opinii oceniaj

cych rol

inhibitorów kalcineuryny (cyklosporyna, tacrolimus) w leczeniu cGvHD. Wi

kszo

ść

badaczy uznaje,

e w przypadku braku przeciwwskaza

, inhibitory kalcineuryny

powinny by

podawane u chorych z nowo rozpoznan

cGvHD, aby zmniejszy

dawk

sterydów niezb

dnych do kontroli objawów choroby. Je

eli cGvHD zostanie

rozpoznana w trakcie podawania cyklosporyny utrzymuje si

podawanie tego leku po

wprowadzeniu prednizonu. U chorych, u których objawy cGvHD pojawiaj

w okresie, kiedy chory nie otrzymuje ju

inhibitorów kalcineuryny mo

e by

podejmowana próba monoterapii cyklosporyn

po rozwa

eniu czynników ryzyka

cGvHD, jej rozległo

ci oraz typu zmian narz

dowych (32;68;76;85;131;152).

kszo

ść

chorych wymaga leczenia immunosupresyjnego przez okres 1 – 3 lat.

Progresja cGvHD wyra

ca si

nasileniem objawów, zaj

ciem nowego narz

du, lub

niemo

rozpocz

cia redukcji dawki prednizonu w ci

gu 2 miesi

cy od

rozpocz

cia leczenia jest wskazaniem do wdro

enia terapii drugiego rzutu. Nie ma

obecnie

schematu,

który

rekomendowa

jako

standard

leczenia

drugorzutowego przy stwierdzeniu sterydooporno

ci. Najbardziej korzystne wydaje si

stosowanie mykofenolatu mofetilu, szczególnie w postaci w

trobowej cGvHD

(23;24;30;94). Mniejsze znaczenie ze wzgl

du na nasilone działania niepo

Ŝą

dane ma

rapamycyna i talidomid (45;103). Zmiany skórne mo

na skutecznie leczy

fotochemioterapi

(doustny 8- metoksy-psoralen z nast

powym promieniowaniem

ultrafioletowym A ang.: psoralen plus ultraviolet irradiation – PUVA) lub pozaustrojow

fotochemioterapi

(extracoporeal photochemotherapy – ECP) która wykazuje równie

skuteczno

ść

w przypadku zaj

cia w

troby (118). Z innych stosowanych sporadycznie

metod nale

y wymieni

napromienianie w

złów chłonnych, stosowanie Rituximabu,

Etanerceptu – rozpuszczalnego receptora TNF-

i pentostatyny (77;103).

Ze wzgl

du na zwi

kszone ryzyko powikła

infekcyjnych zalecane jest równoczesne

stosowanie profilaktyki infekcji oportunistycznych (85;152).

1.3 Chimeryzm hematopoetyczny

Allogeniczna transplantacja szpiku prowadzi do powstania w organizmie biorcy

zjawiska zwanego chimeryzmem hematopoetycznym. Słowo chimeryzm wywodzi si

od greckiego słowa chimera, którym w mitologii greckiej był stwór b

cy poł

czeniem

lwa, kozy i w

ęŜ

a (134). W transplantologii poj

cie to jest stosowane zarówno do

okre

lenia faktu,

e komórki hematopoezy jak i pozostałe komórki somatyczne ró

materiałem genetycznym jak i do okre

lenia zjawiska wyst

powania komórek

o ró

nym genotypie w obr

bie samej hematopoezy. Zale

ci te stały si

podstaw

do wyodr

bnienia

pełnego

chimeryzmu

(Complete

Chimerism – CC),

charakteryzuj

cego si

obecno

w obr

bie hemopoezy jedynie komórek o genotypie

dawcy oraz mieszanego chimeryzmu (Mixed Chimerism – MC), który oznacza

obecno

ść

zarówno komórek o genotypie dawcy jak i biorcy (7;75;134). Jako warunki

uzyskania CC wymienia si

zniszczenie hematopoezy biorcy przez zastosowanie

chemio- lub radioterapii w trakcie post

powania przygotowawczego przed

przeszczepem (mieloablacja) oraz reakcje immunologiczne zachodz

ce po uzyskaniu

wszczepienia mi

dzy komórkami dawcy a przetrwałymi komórkami biorcy, w tym

równie

nowotworowymi (GvL). Zmiany wymienionych warunków np. poprzez

zastosowanie materiału przeszczepowego po deplecji limfocytów T lub zmniejszenie

dawki chemioterapii, jak ma to miejsce w transplantacjach o zredukowanym

kondycjonowaniu, sprzyja przetrwaniu hematopoezy biorcy, a wi

c mieszanego

chimeryzmu (7;17;89;110;111;113;114;133).

1.3.1 Metody okre

lania i monitorowania chimeryzmu hematopoetycznego

Ocena chimeryzmu po allogenicznej transplantacji mo

liwa jest dzi

wyst

powaniu w populacji zjawiska polimorfizmu. Poniewa

wszystkie odmiany

polimorfizmu s

wynikiem ró

nic w sekwencji DNA, mog

one wykrywane

metodami biologii molekularnej. Istnieje równie

liwo

ść

identyfikacji produktów

polimorficznych genów np. dziedzicznych wariantów enzymów lub antygenów.

Poni

ej przedstawiono mo

liwo

ci oceny chimeryzmu na podstawie metod wykrywania

polimorfizmu (55):

1. Identyfikacja przez bezpo

rednie wykrycie sekwencji DNA

a. polimorfizm długo

ci fragmentów restrykcyjnych /RFLP – Restriction Fragment

Length Polimorfizm/ - warianty sekwencji DNA które polegaj

na braku lub

obecno

ci miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne

b. Powtórzenia DNA

- VNTR (mikro i minisatelitarne DNA)

c. sekwencje charakterystyczne dla chromosomu Y

2. Wykorzystanie heteromorfizmu chromosomów

a. badaniem cytogenetycznym – rozró

nienie chromosomów pochodz

cych od dawcy

czy biorcy na podstawie:

- ró

nic w budowie chromosomów np. zmienno

ść

wielko

ci heterochromatyny

centromerowej czy zmienno

ść

wielko

ci i struktury satelitów

- chromosomów płci

- aberracji chromosomowych zarówno u dawcy jak i biorcy

b. FISH /Fluorescence In Situ Hybridization/

- u

ycie sond specyficznych dla chromosomów płci

- aberracje chromosomowe zwi

zane z chorob

podstawow

np. bcr/abl

3. Identyfikacja produktów polimorficznych genów

a. antygeny grupowe krwi oraz izoaglutyniny

b. dziedziczne warianty enzymów czerwonokrwinkowych np. warianty elektroforetyczne

kwa

nej fosfatazy, dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, fosfoglukomutazy czy

glioksalazy I

c. immunoglobuliny

d. antygeny HLA

Pocz

tkowo oceniano chimeryzm hematopoetyczny opieraj

c si

na analizie

specyficznych antygenów erytrocytarnych lub elektroforetycznie, analizuj

c polimorfizm

enzymów erytrocytów i leukocytów. Długa

ywotno

ść

erytrocytów, konieczno

ść

transfuzji masy erytrocytarnej, oraz niska czuło

ść

tych metod nie pozwalała jednak na

precyzyjn

ocen

(17;134). Badanie antygenów HLA mogło mie

zastosowanie jedynie

w przypadku przeszczepu niezgodnego w układzie HLA. Inne metody jak badanie

izotypów immunoglobulinowych i konwencjonalna cytogenetyka cechuj

stosunkowo nisk

czuło

i ograniczonym stopniem polimorfizmu (72;75;134).

ść

istotnym przełomem w ocenie chimeryzmu było wprowadzenie techniki

fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. W metodzie tej za pomoc

odpowiednich sond

molekularnych wykrywa si

charakterystyczne dla choroby aberracje cytogenetyczne

lub chromosom Y. Zalet

tej metody jest do

ść

wysoka czuło

ść

, oraz mo

liwo

ść

oceny

ilo

ciowej Jej głównym ograniczeniem jest mo

liwo

ść

stosowania jedynie u chorych,

u których mi

dzy dawc

a biorc

wyst

puje ró

nica płci lub je

eli u dawcy lub biorcy

wyst

puje znana wcze

niej aberracja cytogenetyczna wzgl

dem której wyst

puje

odpowiednia sonda (60;99).

Obecnie najwi

ksze zastosowanie w monitorowaniu chimeryzmu maj

metody

oparte na analizie minisatelitarnych i mikrosatelitarnych fragmentów DNA poddanych

amplifikacji w procesie PCR (Polymerase Chain Reaction - PCR) (35;75;117;137;153).

Około 20 % genomu człowieka stanowi

sekwencje powtarzaj

ce si

(zmienna liczba

tandemowych powtórze

- Variable Number of Tandem Repeats - VNTR). Wyró

nia

dwa główne rodzaje VNTR: sekwencje minisatelitarne, których powtarzaj

cy si

fragment zawiera zwykle 7-50 nukleotydów oraz sekwencje mikrosatelitarne.

Sekwencje mikrosatelitarne (Short Tandem Repeats - STR) to polimorficzne loci,

zawieraj

ce sekwencje nukleotydowe (zazwyczaj 10-50 powtórze

motywu, na który

składa si

od 1-6 nukleotydów w danym locus). Do najcz

ęś

ciej wyst

puj

cych nale

Ŝą

powtórzenia mono-, di-, tri- i pentanukleotydowe. Wysoki polimorfizm tych sekwencji

sprawił,

e ich analiza została uznana za jedn

z najbardziej u

ytecznych technik

w badaniu zjawiska chimeryzmu komórkowego po HSCT (1;135). Produkt PCR mo

rozdzielony na

elu agarozowym, hybrydyzowany z radioaktywnymi sondami

uwidacznianymi nast

pnie przez autoradiografi

. Obecnie metoda oparta na

wykorzystaniu znaczników fluorescencyjnych zdominowała wcze

niejsze sposoby.

Wyznakowane

fluorescencyjnie

produkty

reakcji

PCR

analizowane

w automatycznym sekwenatorze DNA, przy zastosowaniu systemu opartego na

elektroforezie kapilarnej (139). Metoda fluorescencyjnej PCR jest nie tylko bardziej

czuła, ale pozwala tak

e na półilo

ciowe monitorowanie dynamiki zmian chimeryzmu

mieszanego, co jest kluczowym warunkiem wykorzystania chimeryzmu do oceny

zagro

enia wznow

czy odrzuceniem przeszczepu (117;136). Zalet

tej metody jest

równie

liwo

ść

jednoczesnej analizy kilku loci mikrosatelitarnych dzi

wykorzystaniu starterów wyznakowanych ró

nymi fluorochromami (kompleksowa

reakcja PCR - multiplex PCR). Równoczesna amplifikacja wielu loci umo

liwia

w krótkim czasie zró

nicowanie DNA biorcy i dawcy równie

u tych chorych, u których

powszechnie stosowane w identyfikacji układy VNTR s

identyczne. Zalet

tego

zestawu jest równie

mał

ilo

ść

DNA konieczna do analizy (1-2ng/20

l mieszaniny

reakcyjnej). Limit detekcyjny tego zestawu wynosi 1% - 3% dla komponenty

znajduj

cej si

w próbce w mniejszo

ci. Metoda ta jest wystandaryzowana, oraz

cechuje si

wysok

powtarzalno

, co umo

liwia porównywanie wyników

uzyskiwanych w ró

nych o

rodkach (134). Obecnie metoda ta została uznana jako

najbardziej warto

ciowa dla oceny chimeryzmu hematopoetycznego i powinna by

ywana standardowo (14;35;66;72;77;82;91;103;151).

Ogromny post

p w ocenie chimeryzmu wynika nie tylko z wprowadzania

nowych metod oceny DNA. W ostatnich latach nowe mo

liwo

ci w diagnostyce

u chorych poddanych HSCT wniosła ocena chimeryzmu w poszczególnych

populacjach, zarówno krwi szpikowej jak i obwodowej. Chocia

pierwsze próby takiej

oceny przeprowadzono ju

w latach 70tych, dopiero rozwój metod umo

liwiaj

cych

pozyskanie odpowiedniej ilo

ci materiału do bada

, takich jak cytometria przepływowa

czy izolacja immunomagnetyczna, a tak

e wprowadzenie techniki PCR ułatwiaj

cej

analiz

nawet niewielkich ilo

ci DNA, spowodowały wykorzystanie tych oznacze

szersz

skal

(59;143). Ocena chimeryzmu w populacjach z wykorzystaniem STR

PCR zwi

ksza czuło

ść

metody nawet do 0,1 – 0,0001%. Wykrycie obecno

ci DNA

biorcy w populacji komórek posiadaj

cych na swojej powierzchni antygeny

charakterystyczne dla rozpoznanej przed transplantacj

choroby nowotworowej stało

jedn

z najczulszych metod detekcji choroby resztkowej (Minimal Residual

Disease - MRD). Ocena chimeryzmu w populacji limfocytów T umo

liwia identyfikacj

chorych zagro

onych odrzuceniem przeszczepu lub w przypadku transplantacji

niemieloablacyjnych jest istotn

informacj

w ocenie wskaza

do stosowania DLI

(10;38;71;86;87). Ocena chimeryzmu w poszczególnych populacjach komórek nie jest

jednak badaniem przeprowadzonym rutynowo, ze wzgl

du na czasochłonno

ść

wysokie koszty a tak

e konieczno

ść

odpowiedniego wyposa

enia laboratorium, mo

przeprowadzana jedynie w wybranej grupie chorych.

1.3.2 Kliniczne znaczenie chimeryzmu

Ocena chimeryzmu hematopoetycznego u chorych poddanych allogenicznej

transplantacji jest obecnie rutynowo wykorzystywanym badaniem diagnostycznym.

Umo

liwia ona potwierdzenie przyj

cia si

przeszczepionych komórek w organizmie

biorcy, a monitorowanie w regularnych odst

pach czasowych umo

liwia wczesne

wykrycie odrzucania przeszczepu. Ocena chimeryzmu jest równie

najwa

niejszym

kryterium w ocenie wskaza

do wykonania infuzji limfocytów dawcy u chorych

poddanych transplantacji o zredukowanym kondycjonowaniu (14). Kolejnym wa

nym

aspektem jest wykorzystanie oceny chimeryzmu w prognozowaniu wznowy choroby

zasadniczej (11-13). Monitoruj

c chimeryzm hematopoetyczny wyodr

bniono dwie

zasadnicze grupy chorych. Pierwsza, u której poprzez zanik własnej hematopoezy

dochodzi do wytworzenia CC, oraz drug

– z utrzymuj

cym si

przewlekle MC. Mimo

dotychczasowych bada

i obserwacji du

ych grup chorych po transplantacji szpiku nie

ma jednoznacznej opinii, czy utrzymuj

cy si

długotrwale MC ma wpływ na

powodzenie

terapii,

poprzez

zwi

kszenie

ryzyka

wznowy.

Publikowane

w pi

miennictwie doniesienia ró

skrajnie: od opinii,

e w grupie chorych z MC

ryzyko wznowy choroby jest istotnie wi

ksze, po stwierdzenie,

e MC nie ma

znaczenia w ocenie zagro

enia wznow

(11;12;57;67;69;72;113;142;143).

Jednym z mo

liwych tłumacze

jest fakt,

e wykrywana, przetrwała hematopoeza

biorcy mo

e mie

zarówno cechy hematopoezy prawidłowej jak i resztkowej,

nowotworowej. Ostatnio pojawiły si

pojedyncze doniesienia,

e MC mo

e dotyczy

jedynie okre

lonej populacji komórek hematopoezy. Wykrycie MC jedynie w populacji,

z której wywodzi si

klon nowotworowy mo

e by

czasami jedyn

wskazówk

dotycz

obecno

ci choroby resztkowej, a mechanizm wznowy wydaje si

w tym

przypadku stosunkowo jasny (87).

Brak jest natomiast danych, jak

rol

e odgrywa

obecno

ść

jedynie

wybranych populacji prawidłowej hematopoezy. Przetrwanie komórek biorcy mo

z wytworzeniem stanu tolerancji immunologicznej, co znajduje

potwierdzenie w klinicznych obserwacjach, bowiem ci

ęŜ

ka posta

GvHD rzadko

dotyczy chorych z MC (132). Obserwacje te nie tłumacz

jednak wyst

powania

wznowy u chorych z utrzymuj

cym si

CC. Kluczowe znaczenie mo

e odgrywa

metoda stosowana do oznaczenia chimeryzmu: na podstawie własnych do

wiadcze

wykazano,

e znaczny odsetek chorych, u których metoda tradycyjn

(elektroforezy na

MATERIAŁ I METODY

Badania chimeryzmu przeprowadzono u 54 chorych poddanych allogenicznej

transplantacji szpiku od dawcy rodzinnego, w pełni zgodnego w układzie HLA.

Transplantacj

u wszystkich chorych wykonano w Klinice Hematologii AMG mi

dzy

wrze

niem 1999 a sierpniem 2003. Z oceny wył

czono chorych po allogenicznym

przeszczepie od dawcy spokrewnionego, którzy otrzymali kondycjonowanie

niemieloablacyjne, przeszczepianych wielokrotnie, oraz tych, którzy zmarli z powodu

powikła

wczesnych przed 100 dob

po przeszczepie (u 6 chorych zgon przed

uzyskaniem wszczepienia – chimeryzm nie został oceniony, u 2 chorych chimeryzm

oceniony w 30 dobie - MC).

3.1 Badani chorzy

Wszyscy chorzy otrzymali kondycjonowanie mieloablacyjne. U 46 chorych

ródłem materiału przeszczepowego były komórki progenitorowe krwi obwodowej

(Peripheral Blood Stem Cell - PBSC), u 8 krew szpikowa (Bone Marrow – BM).

Pacjenci z ostr

białaczk

limfoblastyczn

oraz 1 chory z ostr

białaczk

szpikow

AML

(transformacja

zespołu

mielodysplastycznego

MDS)

otrzymali

jako

kondycjonowanie na

wietlenie całego ciała (Total Body Irradiation – TBI) w dawce

12Gy (w 6 frakcjach) oraz cyklofosfamid w ł

cznej dawce 120mg/kg masy ciała

Pozostali chorzy otrzymali kondycjonowanie wg schematu Bu/Cy 120 (busulfan

podawany doustnie w ł

cznej dawce 16mg/kg masy ciała oraz cyklofosfamid

podawany do

ylnie w ł

cznej dawce 120mg/kg masy ciała; u chorych których waga

odbiega o ponad 25% od tzw. idealnej masy ciała, leki dawkowano wg tzw. idealnej

dostosowanej masy ciała)(8;62).

Wszyscy dawcy komórek progenitorowych byli mobilizowani granulocytarnym

czynnikiem wzrostu G-CSF w dawce 10

g/kg masy ciała /dob

. Kolekcj

komórek

progenitorowych za pomoc

separatora Baxter Fenwall CS 3000 plus wykonywano

w 12 godzin po 4 i 5 dawce G-CSF. Krew szpikow

pobierano w warunkach sali

operacyjnej w znieczuleniu ogólnym.

Pacjenci poddani PBSCT otrzymali 6,3x10

CD34+ komórek / kg masy ciała (mediana);

zakres 2,8 - 8,6 komórek / kg masy ciała. Natomiast biorcy krwi szpikowej otrzymali

3,2x10

CD34+ komórek / kg masy ciała (mediana) zakres 1,1 - 5,2 komórek / kg masy

ciała. Charakterystyk

dawców i biorców przedstawia Tabela IV.

Wszyscy chorzy otrzymywali profilaktyk

choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi

zgodnie z protokołem Seattle (109;127) (CsA/Mtx). Cyklosporyn

A (CsA) pocz

tkowo

stosowano w dawce 3mg/kg masy ciała na dob

ylnie, nast

pnie 5 mg/kg masy

ciała doustnie; do doby 100 po przeszczepie dawki cyklosporyny były modyfikowane

tak, aby st

ęŜ

enie leku we krwi pełnej wynosiło co najmniej 150-200

g/l. Je

eli chory

nie miał cGvHD od doby 101 do 180 stopniowo odstawiano lek. Metotreksat (Mtx)

podawano do

ylnie w dniach: 1 (15mg/m

powierzchni ciała), 3, 6 i 11 po przeszczepie

1 (10mg/m

powierzchni ciała).

Wszyscy chorzy spełnili kryteria wszczepienia, okre

lone jako wzrost bezwzgl

dnej

liczby neutrocytów >0,5G/l, przed dob

30 po przeszczepie (mediana 17 dni zakres 10-

29).

Tabela IV Charakterystyka dawców i biorców

Charakterystyka dawców i biorców

Wiek w dniu transplantacji, mediana (zakres)

Pacjenci

37 (18-53)

Dawcy

36 (10-67)

Płe

biorca/dawca

kobieta/m

ęŜ

czyzna

ęŜ

czyzna / m

ęŜ

czyzna

ęŜ

czyzna / kobieta

kobieta / kobieta

Choroba zasadnicza

AML*

ALL*

CML*

MDS*

Inne (CEL, PNH)

AML (Acute Myeloid Leukemia) - ostra białaczka szpikowa, ALL (Acute Lymphoblastic
leukemia) - ostra białaczka limfoblastyczna, CML (Chronic Myeloid Leukemia)
przewlekła

białaczka

szpikowa,

MDS

(Myelodysplastic

Syndrome) – zespól

mielodysplastyczny. CEL (Chronic Eosinophilic Leukemia) - białaczka eozynofilowa,
PNH (Paroxysmal Nocurnal Hemoglobinuria) - nocna napadowa hemoglobinuria

Jako cezur

powikła

pó

nych przyj

to wg ogólnie uznanych kryteriów dob

100.

3.1.1 Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi

Ocen

ostrej oraz przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi

dokonywano zgodnie z kryteriami Seattle

(Tabela II, Tabela V)

(79;102;120) .

Tabela V Stopniowanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi

Stopie

Skóra

troba

Jelito

Rumie

<25% powierzchni

ciała

Bilirubina 2-3 mg/dL

Biegunka, 500-1000
ml/dob

lub nudno

ci *

Rumie

25 – 50 %

powierzchni ciała

Bilirubina 3-6 mg/dL

Biegunka, 1000-1500
ml/dob

+++

Uogólniona erytrodermia

Bilirubina 6-15 mg/dL

Biegunka >1500 ml/dob

++++

Złuszczanie lub p

cherze

Bilirubina >15 mg/dL

Ból +/- niedro

ść

*Rozpoznanie aGvHD na podstawie utrzymuj

cych si

nudno

ci wymaga

potwierdzenia biopsj

oł

dka lub dwunastnicy

Stage

Skóra

troba

Jelito

Zaburzenia funkcji

+ do ++

+ do +++

III

++ do +++

++ do ++++

+++

3.2 Metody bada

3.2.1 Izolacja leukocytów krwi obwodowej

Izolacj

populacji leukocytów krwi obwodowej wykonywano w Pracowni

Cytometru Przepływowego Kliniki Hematologii AMG przy u

yciu cytometru

przepływowego wyposa

onego w przystawk

sortuj

oraz koncentrator komórkowy

(FACS - Calibur; Becton Dickinson). Znakowanie CD66b oraz sortowanie granulocytów

przeprowadzano z krwi pełnej. W celu zwi

kszenia czysto

ci oraz odzysku barwienie

oraz sortowanie monocytów i poszczególnych populacji limfocytów wykonywano na

jednoj

drzastych komórkach krwi obwodowej .

Izolacja

jednoj

drzastych

komórek

krwi

obwodowej - (Peripheral

Blood

Mononuclear Cell - PBMC)

Jednoj

drzaste komórki krwi obwodowej uzyskiwano drog

wirowania pobranej

krwi

ylnej w gradiencie st

ęŜ

, przy u

yciu Histopaq 1077 (Sigma). Krew pobran

EDTA rozcie

czano w płynie CellWash w stosunku 1:1, nast

pnie nawarstwiano na

tak

sam

ilo

ść

Histopaq 1077 i wirowano przez 15 minut (RCF 1000). Po odwirowaniu

uzyskiwano widoczne rozdzielenie faz z wyra

nie zaznaczonym pier

cieniem komórek

jednoj

drzastych, które przenoszono do innej probówki. Po dwukrotnym płukaniu

komórki zawieszano w roztworze CellWash.

Sortowanie w cytometrze przepływowym

W osobnych próbówkach 200

l PBMC inkubowano z 20

l monoklonalnego

przeciwciała anty CD3 sprz

ęŜ

onego z FITC, anty CD19 sprz

ęŜ

onego z PE,

antyCD3/CD16/CD56 FITC/PE, anty CD14 FITC

(Tabela VI).

Wszystkie przeciwciała

pochodziły z firmy Becton Dickinson San Jose, CA, USA,. Dla ka

dej próbki stosowano

kontrol

izotypow

2a. Komórki inkubowano przez 30 minut w ciemni, a nast

pnie

płukano w płynie CellWash.

Tabela VI Charakterystyka przeciwciał u

ytych w badaniu

Przeciwciało

Klon

Pochodzenie

Podklasa

Immunoglobulin

X39/X40

mysie

IgG1

CD3

SK7

mysie

IgG1,

CD14

M5E2

mysie

IgG2a,

CD 19

4G7

mysie

IgG1,

CD3/CD16CD56

SK7/B73.1/MY31

mysie

IgG1,

CD66b

G10F5

mysie

IgG1,

Znakowanie granulocytów: do 100

l krwi pełnej dodawano 2 ml roztworu

lizuj

cego erytrocyty (FACS lysing solution, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), po

10 min inkubacji próbki odwirowywano (5 minut, RCF 1000) i dodawano 2ml roztworu

CellWash. Procedur

płukania powtarzano, odwirowany i ods

czony osad komórek

zawieszano w 200

l CellWash a nast

pnie dodawano 20

l przeciwciała

monoklonalnego CD66b FITC. Komórki inkubowano przez 30 minut a nast

pnie

powtarzano procedur

płukania w CellWash. Do analizy cytometrycznej komórki

zawieszano w CellWash tak, aby uzyska

ęŜ

enie 2x10

/leukocytów. Tak

przygotowane próbki poddawano dalszym procedurom.

Sortowan

populacj

wyznaczano na podstawie dodatniego sygnału

fluorescencji, powy

ej fluorescencji kontroli izotypowej, w odpowiedniej bramce:

limfocytarnej dla komórek CD3, CD16/CD56 oraz CD19, monocytarnej dla komórek

CD14, oraz granulocytarnej dla komórek CD66b.

W celu uzyskania jak najwi

kszej czysto

ci uzyskanej populacji wszystkie

komórki sortowano w trybie „pojedynczej komórki (ang. mode „single cell”), co znaczy

e komórki sortowane były tylko w takiej sytuacji, gdy w strumieniu znajdowały si

pojedynczo rozdzielone komórki

Ŝą

dane. Ka

dorazowo sortowano 50 tysi

cy komórek.

Komórki zostały zatrzymywane na jałowym filtrze komórkowym koncentratora.

Poniewa

limfocyty B stanowi

poni

ej 1% populacji leukocytów a

do doby 180 nie

udało uzyska

odpowiedniej ilo

ci tej populacji do dalszych analiz.

dorazowo czysto

ść

uzyskanej populacji sprawdzano w cytometrze przepływowym.

Analizie DNA poddawano próbki o czysto

ci powy

ej 97%.

3.2.2 Ocena chimeryzmu

Badania wykonywano w Pracowni Genetyki S

dowej Zakładu Medycyny

dowej AMG (Kierownik Prof. R. Pawłowski).

Chimeryzm oceniano w 30, 60, 100 i 180 dobie po przeszczepie, a nast

pnie co

3 miesi

ce. Mediana okresu obserwacji wynosiła 32 miesi

ce (zakres 24 - 70).

Izolacja DNA z krwi.

Ekstrakcj

DNA przeprowadzono z wykorzystaniem gotowego zestawu Blood DNA

Prep Plus (A@A Biotechnology, Gda

sk). Do 100

wie

ej lub mro

onej krwi

dodawano 200

l uniwersalnego buforu lizuj

cego LT i 20

l proteinazy K (st

ęŜ

enie

20mg/ml). Cało

ść

mieszano i inkubowano w ła

ni wodnej w temperaturze 37°C przez

minimum 20 minut. Nast

pnie próbk

intensywnie worteksowano przez 20s

i nanoszono na minikolumn

do oczyszczania genomowego DNA. Po odwirowaniu

(1min przy 10-15 RPM) minikolumn

wraz z probówk

wyjmowano i dodawano 500

roztworu płucz

cego A1. Próbk

ponownie wirowano (1min przy 10-15 RPM)

Nast

pnie minikolumn

przenoszono do nowej probówki 2ml i nanoszono na ni

400

roztworu płucz

cego A1. Próbk

wirowano przez 2 minuty przy 10-15tys RPM.

Osuszon

minikolumn

umieszczano w nowej probówce 1,5ml i dodawano do niej 90

buforu TRIS.HCl o pH 8.5. Próbk

inkubowano przez 5min w temperaturze pokojowej,

po czym wirowano przez 1minut

przy 10-15 tys RPM. Po usuni

ciu minikolumny

oczyszczone DNA poddawano dalszym analizom.

Izolacja DNA z filtra komórkowego

Filtr z wysortowanymi populacjami leukocytów umieszczano w probówce i dodawano

kolejno:

100

l buforu Tris

200

l uniwersalnego roztworu lizuj

cego LT

l Proteinazy K (20mg/ml)

Cało

ść

mieszano i inkubowano w temperaturze 37°C do czasu całkowitego wypłukania

materiału biologicznego z podło

a (zwykle 2-3 godziny). Po inkubacji próbk

intensywnie worteksowano przez 20 s, a nast

pnie wirowano przez 3 minuty, przy 10-

15 tys. RPM, celem oddzielenia roztworu od podło

a. Supernatant nanoszono na

minikolumn

do oczyszczania DNA. Dalsza procedura przebiegała podobnie jak

podczas izolacji DNA z krwi.

ęŜ

enie DNA oznaczano metod

fluorymetryczn

. Otrzymane próbki DNA poddawano

amplifikacji metod

multiplex PCR u

ywaj

c komercyjnie dost

pnego zestawu Profiler

Plus firmy Perkin – Elmer (PE), zawieraj

cego 9 loci typu STR (D3S1358, VWA, FGA,

D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 i D7S820) i marker płci w postaci

locus amelogeniny. Amplifikacj

DNA przeprowadzono zgodnie z warunkami podanymi

przez producenta wykorzystuj

c w tym celu termocykler 2400 firmy Perkin – Elmer,

USA. Do amplifikacji w przypadku ka

dej próby u

ywano optymalnego st

ęŜ

enia DNA tj.

1,25ng/25

mieszaniny

PCR.

Wielko

ść

produktów

PCR

znakowanych

fluorescencyjnie analizowano metod

elektroforezy kapilarnej przy zastosowaniu

automatycznego sekwenatora DNA ABI310 (Perkin – Elmer, USA). Produkty

rozdzielano w kapilarze o długo

ci 47cm wypełnionej denaturuj

cym no

nikiem POP4.

Rozdział prowadzono przez 24min. Przy 15kV (constans), 9mW i ok. 8mA.

Standardem wewn

trznym wielko

ci DNA był marker ILS 400 znakowany CXR

(Promega, USA). Analiz

wielko

ci fragmentów DNA przeprowadzono posługuj

c si

tzw. „drabin

alleli” zawieraj

zsekwencjonowane allele wszystkich loci

wyst

puj

cych w zestawie. Po ustaleniu profilu genetycznego z krwi pobranej przed

przeszczepem dla ka

dej pary dawca - biorca, okre

lano locus lub loci, w których dla

dawcy i biorcy okre

lono ró

ne allele. Najbardziej optymalnym było ustalenie takiego

lotus, w którym zarówno dawca jak i biorca byli ró

nymi od siebie heterozygotami

aden z badanych alleli nie wyst

pował w pozycji „stuttera” (n-4) wzgl

dem kolejnego.

W takim przypadku oceny chimeryzmu, mierzonego odsetkiem DNA biorcy (%MC)

dokonywano stosuj

c nast

puj

formuł

B1+ B2

%MC = ------------------------- x 100%

B1+ B2+ D1+D2

3.3 Analiza statystyczna

We wnioskowaniu statystycznym przyj

to próg istotno

ci równy p= 0.05.

Porównanie rozkładów zmiennych jako

ciowych przeprowadzono z zastosowaniem

testu

. Hipotez

o normalnym rozkładzie warto

ci badanej zmiennej przeprowadzano

z wykorzystaniem testu Shapiro-Wilka. Korelacj

pomi

dzy zmiennymi wykazuj

cymi

cechy rozkładu normalnego badano przy pomocy korelacji Pearsona, w przypadku, gdy

zało

enie normalno

ci rozkładu zmiennych nie było spełnione – posługiwano si

korelacj

Spearmana.

Warto

grupowe

zmiennych

głych

porównywano

pomoc

testów

parametrycznych (analiza wariancji) w przypadku, gdy zmienne miały rozkład normalny

i odpowiednio testów nieparametrycznych (test Manna-Whitneya), gdy zmienne nie

wykazywały cech rozkładu normalnego.

Porównanie czasu prze

ycia chorych w badanych podgrupach przeprowadzono przy

pomocy analizy Kaplana-Meyera.

Oblicze

dokonywano przy pomocy programu STATISTICA (data analysis software

system), wersja 7.1., StatSoft, Inc. (2005).

WYNIKI

4.1 Chimeryzm hematopoetyczny w komórkach j

drzastych krwi

obwodowej

Spo

ród 54 chorych, u których oceniono chimeryzm w leukocytach krwi obwodowej 51

chorych w trakcie obserwacji osi

ło chimeryzm pełny (Complete Chimerism - CC)

(Rysunek 1).

U 25 pacjentów osi

gni

cie pełnego chimeryzmu stwierdzono w czasie

100 dni po transplantacji (wczesny chimeryzm). Tylko u 9 chorych obserwowano pełny

chimeryzm ju

w 30 dobie. U 10 chorych pełny chimeryzm wykazano w dobie 60, a u 6

w dobie 100. Mediana czasu do osi

gni

cia CC w tej grupie wynosiła 60 dni.

U 26 pacjentów obserwowano osi

gni

cie CC w trakcie redukcji lub po odstawieniu

terapii immunosupresyjnej (pó

ny chimeryzm – osi

gni

ty po 100 dobie po

przeszczepie). Mediana czasu uzyskania CC wynosiła 270 dni (zakres 180 - 600).

U wszystkich chorych w tej grupie odsetek własnego DNA w okresie pomi

dzy 100

dob

a osi

gni

ciem CC nie przekraczał 2%.

U trzech chorych wykazano utrzymywanie si

MC przez cały okres obserwacji. Ze

wzgl

du na cel pracy chorych tych wył

czono z dalszych analiz statystycznych

zaw

ęŜ

c badan

grup

do 51 chorych

Rysunek 1 Grupy chorych w zale

ci od rodzaju chimeryzmu

Zmian

odsetkowego udziału CC w badanej grupie w poszczególnych dobach

kontrolnych przedstawia

(Rysunek 2).

Rysunek 2 Zmiana odsetkowego udziału CC w kolejnych dobach kontrolnych

4.1.1 Charakterystyka chorych w zale

ci od rodzaju chimeryzmu

W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem mediana wieku wynosiła 33 lata (zakres

wieku 20-53 lata), natomiast w grupie chorych z pó

nym chimeryzmem mediana wieku

wynosiła 43 lata (zakres wieku 18-53 lata). W badanych grupach chorych,

wyró

nionych na podstawie czasu uzyskania pełnego chimeryzmu wykazano

statystycznie istotn

ró

nic

wieku biorcy (Test U Manna – Whitneya p=0,037)

(Rysunek 3).

Chorzy, u których obserwowano wyst

pienie wczesnego CC byli istotnie

młodsi od chorych w grupie pó

nego chimeryzmu.

Poniewa

w grupie chorych z wczesnym CC znale

li si

wszyscy chorzy, u których

jako post

powanie przygotowawcze stosowano TBI dodatkowe analizy wieku biorcy

przeprowadzono po wykluczeniu tych chorych z badanej grupy. Nie obserwowano

ró

nic wieku biorcy w grupach chorych z wczesnym i pó

nym chimeryzmem, u których

jako kondycjonowanie stosowano chemioterapi

wg schematu BuCY120 (p=0,07).

(mediana wieku 33, zakres 20-53).

Chorzy kwalifikowani do kondycjonowania TBI byli młodsi (wszyscy chorzy w grupie

z wczesnym CC) mediana wieku 34 lata zakres 20-45).

Rysunek 3 Zmienna wieku biorcy w zale

ci od rodzaju osi

gni

tego chimeryzmu

Stwierdzono istotn

statycznie ró

nic

w wyst

powaniu wczesnego i pó

nego

chimeryzmu w grupach wydzielonych w oparciu o cezur

wieku równ

45 lat. W grupie

z chimeryzmem wczesnym wiek 22 z 25 osób (88%) nie przekraczał 45 lat.

Analogiczny odsetek okre

lony dla grupy chorych z chimeryzmem pó

nym wynosił

61,5%. Przy pomocy test chi2 wykazano istotno

ść

statystyczn

zale

porównywanych zmiennych na poziomie p=0,03

Nie wykazano istotnej statystycznie ró

nicy wieku dawcy w podgrupach chorych

z wczesnym i pó

nym chimeryzmem

(Rysunek 4).

Nie wykazano ponadto istotnej

statystycznie zale

ci pomi

dzy wyst

powaniem wczesnego lub pó

nego

chimeryzmu u biorcy a przynale

dawcy do grup wiekowych wyró

nionych

w oparciu o cezur

45 lat.

Nie stwierdzono statystycznie istotnej ró

nicy pomi

dzy płci

biorców, rodzajem

materiału przeszczepowego, a rodzajem pełnego chimeryzmu w kolejnych punktach

oceny.

Rysunek 4 Zmienna wieku dawcy w zale

ci od rodzaju osi

gni

tego chimeryzmu

Wykazano natomiast wpływ rodzaju kondycjonowania na szybko

ść

eliminacji własnej

hematopoezy. Wszyscy 5 chorzy, którzy otrzymali w procesie przygotowawczym

wietlenie całego ciała (TBI) uzyskali wczesny pełny chimeryzm: 3 chorych w dobie

30, dwóch w dobie 60 (p=0,02).

Dla cało

ci rozpozna

nie stwierdzono statystycznie istotnej zale

ci pomi

dzy

rozpoznaniem choroby zasadniczej a typem osi

gni

tego chimeryzmu.

W grupie chorych poddanych transplantacji komórek hematopoetycznych z powodu

CML 17/25 chorych (68%) uzyskało CC po dobie 100. Ró

nica w cz

sto

wyst

powania pó

nego chimeryzmu u chorych z CML była statystycznie znamienna

(p<0,05).

Wszyscy chorzy przeszczepieni z powodu ALL osi

li CC do doby 100. Zale

ść

pomi

dzy ALL a rodzajem chimeryzmu była statystycznie istotna (p<0,05).

Osi

gni

cie wczesnego CC cz

ęś

ciej obserwowano w przypadku, gdy dawc

dla

ęŜ

czyzny była kobieta

Powy

sze ró

nice nie były jednak statystycznie znamienne

(p=0,14).

Szczegółow

charakterystyk

poszczególnych grup w zale

ci od rodzaju

osi

gni

tego chimeryzmu przedstawia Tabela VII

Tabela VII. Charakterystyka pacjentów oraz przeszczepu w zale

ci od czasu

uzyskania CC

Wczesny CC
(25 chorych)

Pó

ny CC

(26 chorych)

≤

45 r.

Wiek biorcy

>45 r.

≤

45 r.

Wiek dawcy

>45 r.

ALL *

AML

CML*

MDS

Rozpoznanie

INNE

TBI

Kondycjonowanie

BuCY 120

BMT

Materiał
przeszczepowy

PBSCT

Kobieta

Płe

biorcy

ęŜ

czyzna 14

TAK

Dawca kobieta dla
m

ęŜ

czyzny

NIE

* - p<0,05

4.2 Pó

ne powikłania poprzeszczepowe

4.2.1 Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi

Przewlekł

chorob

przeszczep przeciwko gospodarzowi rozpoznano u 36

analizowanych chorych (71%) w tym posta

rozległa u 29 (z 57%), a posta

ograniczon

u 7 chorych (14%).

(Rysunek 5)

Rysunek 5 Cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD

Nie stwierdzono statystycznie istotnej zale

ci pomi

dzy wiekiem dawcy i biorcy

rodzajem materiału przeszczepowego oraz płci

biorcy, a cz

sto

wyst

powania

cGvHD.

Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi wyst

piła u wszystkich

5 chorych, u których stosowano w post

powaniu przygotowawczym napromieniowanie

całego ciała (TBI) oraz 31 z 46 chorych, u których w kondycjonowaniu stosowano

BuCY 120.

Wszyscy chorzy, u których dawc

dla m

ęŜ

czyzny była kobieta rozwin

li objawy

cGvHD. Zale

ść

ta była statystycznie istotna (p=0,02).

Nie stwierdzono statystycznie istotnej zale

ci pomi

dzy rozpoznaniem choroby

zasadniczej a cz

sto

wyst

powania cGvHD.

Szczegółow

charakterystyk

poszczególnych grup przedstawia

Tabela VIII

Tabela VIII Charakterystyka chorych bez i z cGvHD

Bez cGvHD
(15 chorych)

cGvHD (36 chorych)

Wiek biorcy mediana (zakres)

37 (19-53)

37 (20-53)

Wiek dawcy mediana (zakres)

38 (18-67)

37 (10-54)

ALL

AML

CML

MDS

Rozpoznanie

INNE

TBI

Kondycjonowanie

BuCY 120

BMT

Materiał
Przeszczepowy

PBSCT

Kobieta

Płe

biorcy

ęŜ

czyzna 8

TAK

Dawca kobieta dla
m

ęŜ

czyzny

NIE

4.2.1.1 cGvHD a rodzaj materiału przeszczepowego

W analizowanej grupie transplantacj

komórek progenitorowych krwi obwodowej

(PBSCT) wykonano u 43 chorych, natomiast u 8

ródłem materiału przeszczepowego

była krew szpikowa (BMT)

Spo

ród 43 chorych po PBSCT cGvHD obserwowano u 31 chorych (72%), z czego

u 25 chorych (58%) posta

rozległ

a u 6 ograniczon

(14%).

Z 8 chorych po BMT, cGvHD rozwin

ło 5 chorych (62%): 4 w postaci rozległej (50%),

1 w postaci ograniczonej (12,5%)

(Rysunek 6).

Ró

nice w cz

sto

ci wyst

powania cGvHD w zale

ci od rodzaju materiału

przeszczepowego nie były istotne statystycznie (p=0,58). Statystycznie istotnej

zale

ci nie wykazano równie

rozpatruj

c wyst

powanie jedynie choroby rozległej

(p=0,66).

Rysunek 6 cGvHD w zale

ci od rodzaju materiału przeszczepowego

4.2.1.2 cGvHD a aGvHD

Wyst

powanie aGvHD

W badanej grupie pacjentów ostr

chorob

przeszczep przeciwko gospodarzowi

rozpoznano w sumie u 21 chorych (41%), w tym u 11 w stopniu 2 (21%), u 8 w stopniu

3 (16%), a u 2 w stopniu 4 (4%)

(Rysunek 7).

Rysunek 7 Wyst

powanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi

w badanej grupie chorych

sto

ść

wyst

powania aGvHD u chorych z cGvHD

Spo

ród 29 chorych z rozpoznan

postaci

rozległ

cGvHD aGvHD poprzedzała

rozwój choroby przewlekłej u 15 (52%) chorych. U 7 chorych była to aGvHD 2 stopnia,

u 6 chorych w stopniu 3 i u 2 chorych w stopniu 4.

W grupie 7 osób z rozpoznan

ograniczon

postaci

cGvHD, aGvHD rozpoznano

u 3 chorych (43%) u wszystkich w stopniu 2.

ród 15 chorych, u których nie obserwowano objawów choroby przewlekłej, aGvHD

wyst

piła u 3 osób (20%), w tym u 1 osoby w stopniu 2 (7%), a 2 w stopniu 3 (13%).

Zale

ść

pomi

dzy wyst

powaniem aGvHD w grupie chorych z rozległ

cGvHD

w porównaniu do grupy chorych bez cGvHD była statystycznie istotna (p=0,04)

(Rysunek 8).

Podobnych ró

nic nie wykazano w grupie chorych z chorob

ograniczon

(p=0,24).

Rysunek 8 Wyst

powanie aGvHD u chorych z rozległa postaci

cGvHD w porównaniu

do chorych bez cGvHD

Nie stwierdzono statystycznie istotnych zale

ci pomi

dzy wyst

powaniem

poszczególnych stopni zaawansowania aGvHD a wyst

powaniem cGvHD (p=0,24)

(Rysunek 9).

Typ rozwoju cGvHD stwierdzany w momencie rozpoznania choroby

U 5 chorych, u których mimo terapii immunosupresyjnej nie uzyskano ust

pienia

objawów ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi rozpoznano typ

post

puj

cy cGvHD. U 13 chorych objawy aGvHD całkowicie ust

piły przed

rozpoznaniem cGvHD (typ wyciszony). Posta

de novo wyst

piła u połowy (18)

chorych

(Rysunek 11).

Rysunek 11 Typ cGvHD w zale

ci od rodzaju pocz

tku

4.2.1.3 Charakterystyka stosowanego leczenia cGvHD

27 chorych, u których rozpoznano rozległ

posta

cGvHD, wymagało terapii

prednizonem i cyklosporyn

A. U dwóch chorych z rozległ

cGvHD o stosunkowo

łagodnym przebiegu (1 chory z zaj

ciem w

troby, 1 chory ze zmianami

luzówkowymi

i zaj

ciem w

troby) prowadzono skuteczn

monoterapi

cyklosporyn

U 4 chorych, u których objawy ograniczonej postaci cGvHD pojawiły si

po odstawieniu

cyklosporyny ponownie powrócono do dawki profilaktycznej CSA. Natomiast

4.2.2 Wznowa choroby zasadniczej

Wznowa choroby zasadniczej wyst

piła w sumie u 8 pacjentów: 3 chorych z CML,

4 chorych z AML, i u jednego chorego z ALL. Cz

sto

ść

wyst

powania nawrotu choroby

w poszczególnych rozpoznaniach nie była istotnie znamienna (p=0,91)

Rysunek 15

Rysunek 15 Wznowa choroby zasadniczej w zale

ci od diagnozy

W grupie chorych z CML wznow

choroby zasadniczej obserwowano u 3 chorych

(u 2 chorych wznowa hematologiczna w fazie przewlekłej choroby, u jednego posta

pozaszpikowa – guz klatki piersiowej, w badaniu histopatologicznym granulocytic

sarcoma)

U dwóch chorych, u których nawrót CML leczono preparatem Glivec (Imatinib)

uzyskano ponownie remisj

cytogenetyczn

. U jednego z tych chorych wykonano drugi

przeszczep od tego samego dawcy, uzyskuj

c remisj

molekularn

(miesi

cy po II

SCT).

Chory ze wznow

pozaszpikow

CML zmarł zanim rozpocz

to terapi

W grupie chorych z AML wznowa choroby zasadniczej wyst

piła u 4 chorych.

U 2 chorych

rozpoznano

wznow

hematologiczn

jednego

chorego

przeszczepionego

powodu

AML

cej

transformacj

zespołu

mielodysplastycznego wyst

piła wznowa pozaszpikowa (guz

ródpiersia w badaniu

histopatologicznym – granulocytic sarcoma), u drugiej chorej z AML obserwowano

wznow

choroby szpikow

oraz zaj

cie CUN.

2 chorych zmarło z powodu powikła

terapii nawrotu lub progresji choroby zasadniczej

mimo leczenia. Natomiast u 1 chorej udało si

uzyska

całkowit

remisj

po leczeniu

reindukcyjnym i infuzji limfocytów dawcy. Chora zmarła około 12 miesi

cy pó

niej

w trakcie terapii trzeciej wznowy choroby. Jeden chory jest w trakcie terapii.

W grupie chorych z ALL wznow

choroby zasadniczej (zarówno szpikow

jak i zaj

cie

CUN) obserwowano u 1 chorego. Chory zmarł z progresji choroby.

4.2.3 Zgony pó

Do chwili obecnej z badanej grupy 51 pacjentów zmarło 11 chorych (22%). U 5 chorych

przyczyn

mierci była wznowa choroby zasadniczej (46%), u 3 powikłania infekcyjne

(27%), u kolejnych 3 cGvHD (27%)

(Rysunek 16).

Rysunek 16 Przyczyny zgonów pó

nych

4.3 Zale

ść

pomi

dzy typem pełnego chimeryzmu a powikłaniami

poprzeszczepowymi

4.3.1 Typ pełnego chimeryzmu a cGvHD

4.3.1.1 Cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD w zale

ci od typu CC

W grupie 25 chorych, którzy osi

li wczesny pełny chimeryzm, 23 (92%) chorych

rozwin

ło cGvHD, tym posta

rozległa dotyczyła 21 (84%) chorych.

W grupie 26 pacjentów, u których osi

gni

cie pełnego chimeryzmu obserwowano

pó

niej ni

w dobie 100, cGvHD rozwin

ło 13 (50%) chorych, w tym posta

rozległ

rozpoznano jedynie u 8 (31%) chorych

(Rysunek 18).

Ró

nica w cz

sto

wyst

powania rozległej postaci choroby cGvHD w grupie z wczesnym i pó

nym

chimeryzmem była statystycznie znamienna (p

0.001).

Rysunek 18 cGvHD w grupach chorych z wczesnym i pó

nym chimeryzmem

Statystycznie istotna zale

ść

pomi

dzy rodzajem chimeryzmu a wyst

powaniem

cGvHD utrzymywała si

równie

po wykluczeniu z grupy wczesnego chimeryzmu

chorych, którzy otrzymali TBI (p<0,005).

4.3.1.2 cGvHD a aGvHD w zale

ci od typu pełnego chimeryzmu

Wyst

powanie aGvHD w grupach chorych wyró

nionych na podstawie czasu

uzyskania CC.

Klinicznie istotn

(przynajmniej II

) ostr

chorob

przeszczep przeciwko gospodarzowi

rozpoznano u 11 (42%) i 10 (38%) pacjentów odpowiednio w grupie

z wczesnym i pó

nym chimeryzmem.

W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem cz

ęś

ciej obserwowano ostr

chorob

przeszczep przeciwko gospodarzowi w stopniu III i IV - u 7 chorych, w porównaniu

do grupy chorych z pó

nym chimeryzmem - u 3 chorych

(Rysunek 19).

Ró

nice

sto

ci rozpoznania aGvHD w zale

ci od rodzaju chimeryzmu u chorych, którzy

prze

yli pierwsze 100 dni po przeszczepie nie były statystycznie istotne (p=0,4).

Rysunek 19 Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi w zale

ci od rodzaju

pełnego chimeryzmu

W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem z 11 chorych, u których obserwowano

aGvHD wszyscy chorzy rozwin

li chorob

przewlekł

, w tym 10 chorych posta

rozległa.

U kolejnych 12 chorych, u których nie rozpoznano choroby ostrej równie

wyst

piły

objawy choroby przewlekłej: u 11 w postaci rozległej, u jednego w ograniczonej.

Tylko u 2 chorych nie rozpoznano

adnej postaci GvHD

(Rysunek 20).

Ze wzgl

du na niewielk

liczebno

ść

poszczególnych grup powy

szych zale

ci nie

poddawano analizie statystycznej.

Rysunek 20 Cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD w zale

ci od aGvHD w grupie chorych

z wczesnym chimeryzmem

W grupie chorych z pó

nym chimeryzmem u 10 pacjentów z rozpoznaniem aGvHD

chorob

przewlekł

rozpoznano u 7 chorych w tym tylko u 2 posta

rozległ

Natomiast u 16 chorych, u których nie obserwowano aGvHD u 3 wyst

piły objawy

choroby rozległej i u 3 choroby ograniczonej.

W tej grupie u 10 chorych w ogóle nie prezentowało objawów GvHD

(Rysunek 21).

Ze wzgl

du na niewielk

liczebno

ść

poszczególnych grup powy

szych zale

ci nie

poddawano analizie statystycznej.

Rysunek 21 Cz

sto

ść

wyst

powanie cGvHD w zale

ci od stopnia aGvHD w grupie

chorych z pó

nym CC

Rodzaj pocz

tku cGvHD w zale

ci od typu CC

W grupie chorych z wczesnym CC najcz

ęś

ciej (12 chorych) obserwowano typ de novo

cGvHD (53%), typ wyciszony wyst

pił u 7 chorych (30%), a typ post

puj

u 4 pacjentów (17%).

W grupie chorych z pó

nym chimeryzmem typ post

puj

cy wyst

pił tylko u jednego

chorego (8%), a typ wyciszony i de novo z tak

sam

sto

– 6 chorych (46%)

Ró

nice w wyst

powaniu okre

lonego typu cGvHD w poszczególnych grupach

z wczesnym i pó

nym chimeryzmem nie były statystycznie istotne (p=0,55).

Rysunek 22 Typ pocz

tku cGvHD w zale

ci od czasu uzyskania CC

4.3.1.3 Rodzaj CC a ci

ęŜ

ść

przebiegu cGvHD

ęŜ

ść

przebiegu cGvHD oceniana była ilo

leków immunosupresyjnych

koniecznych do opanowania choroby. W grupie chorych z wczesnym CC obserwowano

kszy odsetek pacjentów, którzy do kontroli objawów choroby cGvHD wymagali

terapii przynajmniej trzylekowej (12 z 23) w porównaniu do grupy z pó

nym CC gdzie

terapi

trzylekow

prowadzono tylko u 1 z 13

(Rysunek 23).

Powy

sze wyniki były

statystycznie znamienne (P<0.005).

Innym

analizowanym

pracy

miernikiem

ęŜ

przebiegu

cGvHD

w poszczególnych grupach chorych było wyst

pienie zgonu z powodu cGvHD.

W grupie chorych z wczesnym CC trzech pacjentów zmarło z powodu progresji

cGvHD, podczas gdy w grupie z pó

nym CC nie obserwowano zgonów z tej przyczyny

(Rysunek 24).

Ró

nice w cz

sto

ci wyst

powania zgonu z powodu cGvHD

w poszczególnych grupach nie były statystycznie istotne (p=0,68).

Szczegółow

charakterystyk

cGvHD w obu badanych grupach przedstawia

Tabela IX

Tabela IX. Charakterystyka cGvHD w grupie chorych z wczesnym i pó

nym chimeryzmem

Wczesny CC (25 chorych)

Pó

ny CC (26 chorych)

CGvHD

23/25 (92%)

13/26 (48%)

ograniczona

2/25 (8%)

5/26 (18%)

rozległa

21/25 (84%)

8/26 (30%)

Typ rozwoju cGvHD

progressive

4/23 (17%)

1/13 (8%)

quiescent

7/23 (30%)

6/13 (46%)

de novo

12/23 (53%)

6/13 (46%)

Terapia immunosupresyjna

Jeden lek

3/23 (13%)

5/13 (38%)

Dwa leki

8/23 (34%)

7/13 (54%)

Trzy lub wi

cej

11/23 (48%)

1/13 (8%)

Doba rozpoznanie cGvHD,
mediana, zakres

131 (88-178)

250 (98-306)

Zgony z powodu cGvHD

4.3.1.4 Zale

ść

pomi

dzy czasem stwierdzenia pełnego chimeryzmu a

wyst

pieniem objawów cGvHD

U wszystkich chorych w grupie z wczesnym CC osi

gni

cie pełnego chimeryzmu

zawsze poprzedzało pojawienie si

pierwszych objawów cGvHD (

redni czas od

uzyskania CC do wyst

pienia cGvHD wynosił 85 dni).

Z drugiej strony objawy cGvHD u pacjentów, którzy osi

li pó

ny CC zwykle

wyst

powały przed osi

gni

ciem CC (

redni czas od wyst

pienia cGvHD

a pojawieniem si

CC wynosił 100 dni). Jedynie w trzech przypadkach w tej grupie

wyst

pienie pierwszych objawów cGvHD nieznacznie poprzedzało osi

gni

cie CC.

Korelacja pomi

dzy czasem uzyskania CC a ró

nic

czasu pomi

dzy czasem do CC

a czasem wyst

pienia cGvHD była statystycznie znamienna (P<0.001)

(Rysunek 25).

Rysunek 25 Korelacja mi

dzy czasem uzyskania CC a ró

nic

czasu pomi

dzy czasem

do uzyskania CC a czasem wyst

pienia cGvHD

4.3.2 Typ CC a wznowa choroby zasadniczej

Wznowa choroby zasadniczej wyst

piła w sumie u 4 chorych w grupie z wczesnym CC

i 4 chorych w grupie z pó

nym CC.

W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem wznow

choroby zasadniczej

obserwowano u 3 chorych z AML i u jednego chorego z ALL.

W grupie chorych z pó

nym chimeryzmem do wznowy choroby zasadniczej doszło

u 3 pacjentów z CML i u jednego pacjenta z AML

(Rysunek 26).

Nie stwierdzono

statystycznie znamiennych ró

nic w cz

sto

ci wyst

powania wznowy choroby

zasadniczej w poszczególnych grupach (p=0,95).

100

200

300

400

500

600

700

Czas do uzyskania CC (dni)

-500

-400

-300

-200

-100

100

200

300

(

Tabela X Charakterystyka wznowionych chorych w grupie z pó

nym CC

Chory Rozpoznanie Ryzyko choroby

zasadniczej przed
SCT

Najlepsza odpowied

po SCT

cGvHD

Czas
wznowy
(miesi

CML

I faza przewlekła

Remisja
cytogenetyczna

ograniczona 48

CML

I faza przewlekła

Remisja
molekularna

CML

I faza przewlekła

Remisja
cytogenetyczna

AML

I całkowita remisja Całkowita remisja

Tabela XI Charakterystyka wznowionych chorych w grupie chorych z wczesnym

chimeryzmem

Chory Rozpoznanie

Ryzyko choroby
zasadniczej przed
SCT

Najlepsza odpowied

po SCT

cGvHD

Czas
wznowy
(miesi

AML

Transformacja
MDS

Całkowita remisja

Rozległa

AML

I całkowita remisja Całkowita remisja

Rozległa

ALL

II całkowita remisja Całkowita remisja

Rozległa

AML

I całkowita remisja Całkowita remisja

Rysunek 26 Wznowa choroby zasadniczej w grupie chorych z wczesnym i pó

nym

chimeryzmem

4.3.3 Przyczyna zgonów pó

nych w zale

ci od rodzaju CC

W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem 3 chorych (43%) zmarło z powodu

przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, 3 (43%) z powodu wznowy

choroby zasadniczej i jedna chora (14%) z powodu powikła

infekcyjnych. W grupie

chorych z pó

nym chimeryzmem 2 chorych (50%) zmarło z powodu powikła

infekcyjnych, a kolejnych 2 (50%) z powodu wznowy choroby zasadniczej. W tej grupie

nie obserwowano zgonów z powodu cGvHD

(Rysunek 27).

Ró

nice w przyczynie

zgonów w poszczególnych grupach nie były istotne statystycznie (p=0,23).

Prawdopodobie

stwo prze

ycia w poszczególnych grupach przedstawia

(Rysunek 28).

Do około 1100 doby obserwowano ró

nice w prze

yciu chorych w grupach

wyró

nionych na podstawie czasu uzyskania CC o ok. 20% na korzy

ść

grupy chorych

z pó

nym CC. Na ko

cu obserwacji ró

nica pomi

dzy prze

yciem w obu grupach

zmniejszyła si

12% i prawdopodobie

stwo prze

ycia wynosiło odpowiednio 72% dla

chorych z wczesnym CC i 84% dla chorych

z pó

nym CC.

Ró

nice nie były istotnie

statystycznie p=0,13.

Rysunek 27 Przyczyny zgonów pó

nych w zale

ci od czasu uzyskania pełnego

chimeryzmu

Prawdopodobie

stwo prze

ycia Kaplana-Meiera

Kompletne

Uci

P
W

500

1000

1500

2000

2500

3000

Czas

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

0,95

1,00

Rysunek 28 Prawdopodobie

stwo prze

ycia w zale

ci od czasu uzyskania pełnego

chimeryzmu

4.4 Chimeryzm w poszczególnych subpopulacjach leukocytów krwi

obwodowej

U 15 pacjentów chimeryzm został oceniony w poszczególnych populacjach

leukocytów: limfocytach T, komórkach NK, monocytach i granulocytach. Analizie

statystycznej poddano wyniki 12 chorych, którzy osi

li CC w trakcie obserwacji.

Trzech pacjentów wykluczono ze wzgl

du na przetrwały MC.

Z 12 ocenianych chorych, trzech osi

ło CC w WBC przed doba 100 po

przeszczepie, natomiast 9 w dalszej obserwacji. U 8 z nich wykrywano MC

w przynajmniej 1 populacji leukocytów przy CC wykazanym w krwi pełnej. U wi

kszo

chorych obserwowano wczesny CC w populacji monocytów (CD14), granulocytów

(CD66b) oraz komórek NK (CD3

CD16/56

). W dobie 30 po przeszczepie odpowiednio

92%(11 chorych), 85% (10 chorych) oraz 85% (10 chorych) wykazywało CC w tych

populacjach.

Natomiast w populacji limfocytów T pełny chimeryzm do doby 100 osi

ło jedynie

trzech badanych chorych (23%). U tych chorych równie

badania chimeryzmu

w leukocytach krwi obwodowej wykazywały CC. U wszystkich trzech chorych rozwin

ła

posta

rozległa cGvHD (100%). U jednego chorego, u którego osi

gni

cie CC

zarówno w nie selekcjonowanych leukocytach jak i we wszystkich badanych

populacjach wykazano ju

w dobie 30 doszło do rozwoju rozległej cGvHD o typie

post

puj

cym, poprzedzonej aGvHD w stopniu III. Chory ten wymagał trójlekowej

immunosupresji.

U 9 chorych którzy osi

li CC w WBC po dobie 100, MC wykrywano najcz

ęś

ciej

w populacji limfocytów T. Dodatkowo jeden pacjent wykazywał MC w populacji

komórek NK i jeden zarówno w granulocytach jak i komórkach NK

(Rysunek 29).

W tej

grupie cGvHD obserwowano u 6 chorych, a trzech z nich rozwin

ło chorob

rozległ

(33.3%). Dwóch pacjentów wykazywało przetrwały MC w populacji CD3 podczas gdy

we krwi obwodowej nie wykrywano ju

własnego DNA

(Rysunek 29).

U obu pacjentów

nie obserwowano do tej pory objawów cGvHD. Byli to pacjenci z CML, którzy nigdy nie

osi

li molekularnej remisji choroby zasadniczej po transplantacji: nadal utrzymuje

obecno

ść

transkryptu bcr/abl natomiast nie wykryto obecno

ci chromosomu Ph

zarówno w konwencjonalnej cytogenetyce jak i badaniu FISH (okres obserwacji u obu

chorych powy

ej 30 msc.)

OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA

5.1 Chimeryzm hematopoetyczny

Równocze

nie z pierwszymi transplantacjami szpiku wykonanymi w naszym

rodku w roku 1994 rozpocz

to ocen

chimeryzmu hematopoetycznego. Pocz

tkowo

amplifikowane metod

PCR allele VNTR rozdzielano na

elu agarozowym (153).

W 1999

rozpocz

ocen

chimeryzmu

zastosowaniem

jednej

z najnowocze

niejszych ówcze

nie metod, opracowanej pierwotnie dla celów

kryminalistyki - identyfikacji

ladów biologicznych w mieszaninie. Metoda ta polega na

rozdziale znakowanych fluorescencyjnie alleli STR metod

elektroforezy kapilarnej na

automatycznym sekwenatorze DNA. Reakcj

PCR przeprowadza si

za pomoc

komercyjnie dost

pnego zestawu umo

liwiaj

cego równoczesn

amplifikacj

wielu loci

STR

jednoczesnym

wyznakowaniem

fluorescencyjnym

produktów

PCR

(kompleksowa reakcja PCR) (15). U wszystkich chorych przeszczepianych w naszym

rodku powy

sza metoda stosowana jest do rutynowej oceny chimeryzmu zarówno

we krwi obwodowej jak i szpikowej. Dodatkowo u chorych, u których wykonano

przeszczep od dawcy niezgodnego w układzie grup głównych krwi lub fenotypie Rh,

monitoruje si

chimeryzm w układzie czerwonokrwinkowym metodami serologicznymi.

U niektórych chorych badania poszerza si

równie

o analiz

antygenów grupowych

na krwinkach czerwonych metod

cytometrii przepływowej.

Przedstawione w pracy wyniki dotyczyły oceny chimeryzmu komórek j

drzastych

krwi obwodowej. Ze wzgl

du na niepełne dane oceny krwi szpikowej zrezygnowano

z równoczesnej analizy tego materiału. Dodatkowo zalet

oceny krwi obwodowej przy

tak sformułowanym celu pracy jest fakt,

e limfocyty, które s

komórkami efektorowymi

zarówno cGvHD jak i reakcji GvL, stanowi

kszy odsetek we krwi obwodowej ni

szpiku.

Wprowadzenie metody kompleksowej reakcji PCR do rutynowego oznaczania

chimeryzmu w naszym o

rodku potwierdziło dokonane wst

pnie obserwacje,

stosuj

c metod

o wysokim stopniu czuło

ci, eliminacj

DNA biorcy obserwujemy

pó

niej ni

przypuszczano (28). W wi

kszo

ci prac badaj

cych chimeryzm

hematopoetyczny u pacjentów po HSCT uzyskanie CC zarówno w krwi obwodowej jak

i szpiku stwierdzano ju

w 30 dobie po przeszczepie (57;69;83;93;112). Wynika to

zarówno ze stosowania metod oceny chimeryzmu o znacznie mniejszej czuło

ci,

a tak

e ze sposobu definiowania pełnego chimeryzmu przez badaczy. Wiele prac

analizuj

c znaczenie chimeryzmu wprowadza okre

lenie CC w sytuacji gdy DNA

dawcy stanowi 95-98% zakładaj

e ten niewielki odsetek nie ma znaczenia dla

funkcjonowania przeszczepu okre

lanego jedynie kryteriami ilo

ciowej regeneracji

hematopoezy (7;57;69;112). Jednak w

ród pomijanych w tych 2 - 5% DNA biorcy

mog

znajdowa

komórki maj

ce kluczowe znaczenie w wielu reakcjach

immunologicznych jak kontrola choroby zasadniczej, indukcja procesu tolerancji

i ochrona przed rozwini

ciem cGvHD (41;57;111;112;140;147). Z tego powodu bardziej

warto

ciowe jest wprowadzenie

cisłej definicji CC jako całkowitego braku komórek

biorcy. Potwierdzaj

to równie

wyniki naszych bada

, gdy

poziom DNA w grupie

chorych z pó

nym CC nigdy nie przekroczył 2%.

ycie bardziej czułych metod oraz zdefiniowanie chimeryzmu jako obecno

jedynie komórek o genotypie dawcy, umo

liwiło wyodr

bnienie dwóch grup chorych.

W pierwszej grupie CC został osi

gni

ty do 100 doby po przeszczepie (wczesny CC),

czyli do eliminacji własnych komórek hematopoetycznych doszło w okresie gdy

wszyscy pacjenci otrzymywali jeszcze profilaktyk

GvHD w pełnej dawce

immunosupresyjnej. W drugiej grupie CC został osi

gni

ty pó

niej ni

w 100 dobie

– w okresie redukcji dawki leków immunosupresyjnych lub po ich całkowitym

odstawieniu (pó

ny CC).

W tak wyró

nionych podgrupach postanowiono oceni

wpływ parametrów

charakteryzuj

cych biorc

, jak równie

czynników zwi

zanych z przebiegiem

transplantacji na czas uzyskania CC.

Nie stwierdzono statystycznie istotnej zale

ci pomi

dzy płci

biorców,

wiekiem dawcy, rodzajem materiału przeszczepowego, a rodzajem CC w kolejnych

punktach oceny.

Wykazano statystycznie istotn

zale

ść

pomi

dzy czasem uzyskania CC

a wiekiem biorcy. CC wczesny osi

li chorzy młodsi ni

w grupie z pó

nym CC,

a wi

kszo

ść

chorych w grupie z wczesnym chimeryzmem wi

kszo

ść

chorych była

młodsza ni

45 lat. Wynikało to z osi

gni

cia wczesnego CC przez wszystkich chorych,

którzy otrzymali TBI.

Nie wykazano zale

ci pomi

dzy diagnoz

a czasem osi

gni

cia CC.

Natomiast w poszczególnych rozpoznaniach stwierdzono uzyskanie wczesnego

chimeryzmu przez wszystkich chorych z ALL, co było zwi

zane z rodzajem

kondycjonowania. W grupie chorych z rozpoznaniem CML statystycznie cz

ęś

ciej

obserwowano pó

ny pełny chimeryzm.

Wczesny CC został uzyskany przez wszystkich chorych, którzy w post

powaniu

przygotowawczym otrzymali TBI.

Szybsze

osi

gni

cie

pełnego

chimeryzmu

chorych

poddawanych

napromienianiu całego ciała w porównaniu do chorych, którzy w post

powaniu

przygotowawczym otrzymywali jedynie chemioterapi

był obserwowany równie

przez

innych badaczy. Spo

ród innych badanych czynników wykazali oni równie

wpływ

wzrostu wieku na szybsze tempo uzyskiwania CC, czego nie wykazano w badanej

grupie chorych (139).

W grupach wydzielonych na podstawie czasu uzyskania CC porównano

sto

ść

wyst

powania dwóch zale

nych od procesów immunologicznych powikła

cGvHD oraz wznowy choroby zasadniczej. Wykazano

e cz

sto

ść

wyst

powania

rozległej postaci cGvHD w grupie chorych z wczesnym CC była statystycznie istotnie

sza ni

w grupie chorych którzy osi

li CC powy

ej doby 100 po transplantacji

(odpowiednio 84% do 31%). Powy

sza zale

ść

utrzymywała si

równie

w podgrupach wydzielonych na podstawie rodzaju kondycjonowania – po wykluczeniu

z badanej grupy chorych, którzy otrzymali TBI. Oceniono równie

ęŜ

ść

przebiegu

cGvHD w poszczególnych grupach z wczesnym i pó

nym CC traktuj

c jako

podstawowy miernik oceny ci

ęŜ

ci choroby ilo

ść

leków immunosupresyjnych

koniecznych do kontroli objawów. Wi

kszo

ść

pacjentów z grupy z wczesnym CC

wymagała terapii kolejnego /drugiego lub trzeciego/ rzutu i przynajmniej trzech leków

immunosupresyjnych do opanowania choroby. Ró

nice były statystycznie znamienne.

Kolejnym wyznacznikiem oceny ci

ęŜ

ci przebiegu cGvHD w poszczególnych

podgrupach było wyst

pienie zgonu z powodu cGvHD. Wykazano,

e wszyscy chorzy,

których przyczyn

zgonu była przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi

osi

li wczesny CC.

Interesuj

z klinicznego punktu widzenia obserwacj

było wykazanie

zale

ci pomi

dzy czasem uzyskania CC a czasem wyst

pienia pierwszych

objawów cGvHD. W podgrupie chorych z wczesnym CC objawy cGvHD wyst

piły

wcze

niej (mediana czasu rozpoznania cGvHD wynosiła 131 dni po przeszczepie).

Dodatkowo w tej grupie u wszystkich badanych osi

gni

cie CC (mediana 60 doba)

zawsze poprzedzało wyst

pienie pierwszych objawów cGvHD, ze

redni

ró

nic

czasu pomi

dzy dob

, w której rozpoznano cGvHD, a czasem osi

gni

cia pełnego

chimeryzmu 85 dni. U prawie wszystkich chorych w tej grupie obserwowano objawy

choroby rozległej. Natomiast w podgrupie, okre

lonej na podstawie czasu uzyskania

pełnego chimeryzmu jako pó

ny CC, mediana czasu wyst

pienia pierwszych objawów

cGvHD wynosiła 250 dni, podczas gdy mediana czasu uzyskania CC – 270 dni po

przeszczepie. Oprócz trzech chorych u wszystkich badanych objawy cGvHD

poprzedziły uzyskanie CC a

redni czas mi

dzy uzyskaniem CC a rozpoznaniem

cGvHD wynosił 100 dni.

Mechanizm, który mo

e prowadzi

do tak ró

nego przebiegu cGvHD

w zale

ci od czasu osi

gni

cia CC pozostaje nadal niejasny. Mo

na przypuszcza

e mechanizm prowadz

cy do uzyskania CC i pojawienia si

cGvHD ró

ni si

w obu

badanych grupach. W obu grupach cz

sto

ść

wyst

powania klinicznie istotnej ostrej

choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi była podobna. W grupie chorych

z wczesnym CC u wszystkich oprócz 2 wyst

piła posta

rozległa (21/25 chorych) a

u wi

kszo

ci chorych rozpoznano typ cGvHD de novo. Mo

e to sugerowa

uzyskanie CC nie jest bezpo

rednio efektem ostrej GVHD. Jednak

e nie mo

wykluczy

istnienia przebiegaj

cej subklinicznie reakcji przeszczep przeciwko

gospodarzowi prowadz

cej do eliminacji komórek gospodarza (84). W

wietle ostatnich

doniesie

immunologii transplantacyjnej, jak równie

obserwacji prowadzonych

u chorych po przeszczepach narz

dowych wyst

pienie mikrochimeryzmu mo

w pewnym stopniu tłumaczy

ró

ny przebieg uzyskania CC i cGvHD obserwowane

u naszych chorych. Współistnienie komórek gospodarza i dawcy mo

e sprzyja

rozwojowi tolerancji immunologicznej w mechanizmie obwodowym (34;132). U biorców

komórek hematopoetycznych mo

e si

to klinicznie przejawia

brakiem lub

łagodniejszym przebiegiem cGvHD. Wydaje si

e najbardziej krytycznym okresem

poprzeszczepowym, wpływaj

cym na cały jego przebieg, jest okres pierwszych trzech

miesi

cy po przeszczepie. Eliminacja wykrywalnych komórek gospodarza w okresie,

gdy pacjent otrzymuje jeszcze profilaktyk

immunosupresyjn

w pełnej dawce, mo

rednim dowodem wyj

tkowo intensywnej reakcji immunologicznej skierowanej

przeciwko alloantygenom. Konsekwencj

tej reakcji mo

e by

równie

eliminacja

ochronnej, bior

cej udział w procesie wytwarzania tolerancji, populacji komórek, co

z kolei prowadzi do ci

ęŜ

szego przebiegu cGvHD. Potwierdzaj

to kliniczne obserwacje

u naszych chorych z wczesnym CC. Niektórzy autorzy wskazuj

e populacj

leukocytów odpowiedzialn

za udział w procesach tolerancji jest populacja limfocytów

CD3 (70;138;150). Zaobserwowano równie

wpływ utrzymywania si

mieszanego

chimeryzmu w populacji komórek CD3 na wznow

choroby zasadniczej. Zale

ść

tak

wykazano tak

e w przypadku chorób rozrostowych, w których wykrywane komórki

CD3 nie nale

Ŝą

do klonu nowotworowego, a wi

c przyczyn

wznowy nie jest obecno

ść

choroby resztkowej (33;81;138;149;150). Jak wiadomo reakcja GvL przynajmniej

ęś

ciowo jest zale

na od rozpoznawania przez limfocyty T CD8 alloantygenów, np.

„słabych” antygenów zgodno

ci tkankowej, a nie antygenów zwi

zanych bezpo

rednio

z klonem nowotworowym. Z tego powodu nabywanie tolerancji na alloantygeny wi

ąŜ

równocze

nie z osłabieniem reakcji GvL, a tym samym zwi

ksza ryzyko wznowy.

W naszych obserwacjach u pacjentów, u których obserwowano utrzymywanie si

przez dłu

szy okres czasu (przynajmniej do doby 100) objawy cGvHD pojawiły si

pó

niej, a choroba miała l

ejszy przebieg. U wszystkich tych chorych ocena

chimeryzmu

subpopulacjach krwi

obwodowej

wykazała,

komórkami

odpowiedzialnymi za utrzymywanie si

MC były limfocyty CD3. W tej grupie eliminacja

spełniaj

cego ochronn

rol

klonu mo

e by

wyja

niona jako wynik cGvHD, która

rozwin

ła si

w trakcie odstawiania lub ju

po odstawieniu immunosupresji. Nabyta

w okresie mieszanego chimeryzmu CD3 tolerancja, prowadzi do istotnie rzadszego

wyst

powania cGvHD, a w razie jej wyst

pienia do znacznie łagodniejszego przebiegu

choroby. Z drugiej strony eliminacja limfocytów w okresie pierwszych trzech miesi

po transplantacji obserwowana w grupie chorych z wczesnym CC mo

e skutkowa

statystycznie cz

stszym wyst

pieniem rozległej postaci cGvHD wymagaj

cej bardziej

intensywnego leczenia immunosupresyjnego.

Identyfikacja ewentualnego, kolejnego czynnika ryzyka rozwoju rozległej

cGvHD, jakim mo

e by

tempo uzyskania CC, nasuwa pytanie, czy mo

na praktycznie

wykorzysta

informacj

w prowadzeniu pacjentów po transplantacji. Próby

zapobiegania cGvHD poprzez wydłu

enie okresu profilaktyki immunosupresyjnej jak

dotychczas nie wykazały istotnego wpływu na cz

sto

ść

cGvHD. Randomizowana

próba podj

ta przez grup

badaczy ze Seatlle nie wykazała zmniejszenia cz

sto

cGvHD u chorych, u których wydłu

ono okres profilaktycznej immunosupresji

cyklosporyn

A z 6 miesi

cy do 24 miesi

cy. Do wydłu

onej profilaktyki kwalifikowano

chorych, którzy mieli zwi

kszone ryzyko cGvHD z powodu wcze

niejszego

wyst

powania choroby ostrej lub subklinicznych zmian charakterystycznych dla cGvHD

w biopsji skóry (73). Niepowodzeniem zako

czyła si

równie

randomizowana,

podwójnie

lepa próba polegaj

ca na doł

czeniu do profilaktyki cGvHD w dobie 80

talidomidu. W grupie chorych, którzy otrzymywali talidomid cz

sto

ść

cGvHD oraz

miertelno

ść

była wy

sza (37). Ringen i wsp. utrzymywali sterydoterapi

u chorych

z aGvHD a

do 6 miesi

cy po przeszczepie. Zaobserwowano w tej grupie wy

sto

ść

cGVHD (108). Równie

prowadzenie sterydoterapii w dobie 100 po

transplantacji, nawet ze wskaza

innych ni

cGvHD zwi

ksza ryzyko rozległej GvHD

(4;145). W powy

szym badaniu mo

emy zaobserwowa

e u chorych szczególnie

nara

onych na ci

ęŜ

ki przebieg cGvHD objawy choroby pojawiły si

w czasie, gdy

chorzy otrzymywali jeszcze pełna dawk

immunosupresji, a u trzech chorych

z post

puj

chorob

ostr

– kilkulekowe leczenie immunosupresyjne. W tej grupie

chorych wyst

pienie objawów klinicznych cGvHD nie zostało sprowokowane redukcj

lub odstawieniem immunosupresji.

e wi

cej korzy

ci z kontynuacji profilaktyki immunosupresyjnej

odnie

liby chorzy, u których objawy cGvHD pojawiaj

w trakcie redukcji dawki

cyklosporyny A lub po jej odstawieniu. Potwierdzeniem tego mo

e by

zmniejszenie

sto

ci wyst

powania cGvHD u chorych, u których wydłu

ono okresu redukcji dawki

cyklosporyny A do jednego roku (90). Nale

y jednak pami

o zachowaniu

równowagi pomi

dzy kontrol

cGvHD a hamowaniem GvL. Potencjalne korzy

wynikaj

ce ze zmniejszenia cz

sto

ci GvHD, cz

sto wi

ąŜą

ze zwi

kszeniem ryzyka

wznowy choroby zasadniczej oraz odrzucenia przeszczepu. Dlatego chorzy ci

wymagaj

dłu

szego okresu obserwacji w celu pełnej oceny ryzyka nawrotu, oraz

wtórnych nowotworów.

Kolejnym aspektem jest wykorzystanie informacji o potencjalnym czynniku

ryzyka w bardziej intensywnym leczeniu. Chorzy ci powinni by

obj

ci próbami

klinicznymi, a tak

e próbami wykorzystania nowych leków immunosupresyjnych.

Ostatecznie, chocia

jeszcze w sferze przyszło

ci pozostaje celowana

manipulacja tempem uzyskania CC tak, aby zachowuj

c korzy

ci wynikaj

z procesów alloreaktywno

ci, zmniejszy

niekorzystne dla chorego powikłania

immunologiczne.

Kolejnym porównywanym w pracy parametrem była cz

sto

ść

wyst

powania

wznowy choroby zasadniczej w podgrupach chorych z wczesnym i pó

nym

chimeryzmem. W niniejszej pracy nie oceniano warto

ci oceny chimeryzmu jako

liwo

ci przewidywania wznowy z odpowiednio wczesnym rozpocz

ciem terapii.

W przypadku chorób rozrostowych układu krwiotwórczego bardziej warto

ciowym

materiałem w mo

liwo

ci oceny obecno

ci choroby resztkowej jest krew szpikowa (7).

Ponadto ogromne znaczenie, szczególnie w mo

liwo

ci oceny zagro

enia wznow

u chorych z ostr

białaczk

, ma wykonywanie bada

w znacznie krótszych odst

pach

czasowych – w okre

lonych przypadkach nawet tygodniowych. Wi

ąŜ

e si

z wykonywaniem procedury inwazyjnej, jak

stanowi biopsja aspiracyjna szpiku.

Wykonywanie bada

z krwi obwodowej w tym przypadku ma mniejsz

warto

ść

diagnostyczn

. W badanej grupie 51 chorych, u wszystkich osób stwierdzono pełny

chimeryzm, co oznacza,

e dan

metod

nie stwierdzono obecno

ci choroby

resztkowej we krwi obwodowej. Celem powy

szej pracy była ocena wyst

powania

wznowy jako jednego z klinicznych wyrazów aktywno

ci reakcji GvL.

Rozpatruj

c rodzaj chimeryzmu nie stwierdzono statystycznie istotnej ró

nicy

w cz

sto

ci wyst

powania wznowy w grupie z wczesnym i pó

nym chimeryzmem.

Jednak

e rozpatruj

c wyst

powanie wznowy w poszczególnych rozpoznaniach

zwrócono uwag

e w grupie chorych z CML nawrót choroby obserwowano jedynie

w grupie chorych z pó

nym chimeryzmem. Powy

sza obserwacja mo

wiadczy

nasilona

alloreaktywno

ść

klinicznie

wyra

ona

obecno

rozległej

cGvHD

zaowocowała równie

efektywniejsz

GvL. Zale

ci te obserwowano jedynie

u chorych z CML chorobie, w której skuteczno

ść

reakcji GvL jest szczególnie wysoka.

Nie obserwowano podobnych zale

ci w grupie chorych z ALL i AML, co mo

e by

zwi

zane nie tylko z mniejszym nasileniem reakcji GvL w tych rozpoznaniach, ale

równie

stosunkowo niewielk

liczebno

tych podgrup.

5.2 Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi

Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi była obserwowana

u 71% chorych, u wi

kszo

ci (57%) rozpoznano posta

rozległ

, u 14% chorych posta

ograniczon

. W badanej grupie zbadano wpływ powszechnie uznawanych czynników

ryzyka (Tabela I) na wyst

pienie przewlekłej choroby przeszczep przeciwko

gospodarzowi. Nie wykazano zale

ci pomi

dzy wiekiem dawcy i biorcy,

a wyst

powaniem cGvHD. Wi

kszo

ść

autorów obserwuje wzrost cz

sto

wyst

powania cGvHD wraz z wiekiem biorcy, natomiast cz

sto

ść

wyst

powania

u dzieci jest niska, cho

inne czynniki ryzyka, prezentacja kliniczna i wpływ

na prze

ycie pozostaj

podobne jak u chorych dorosłych (3;74;154). Brak tych

zale

ci w analizowanym materiale mo

e wynika

ze stosunkowo niskiej liczebno

badanej grupy.

W badanej grupie chorych cGvHD rozpoznano u wszystkich chorych, u których

jako post

powanie przygotowawcze przed przeszczepem zastosowano na

wietlenie

całego ciała (TBI) z cyklofosfamidem (4 ALL, 1 AML). Wpływ rodzaju post

powania

przygotowawczego na cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD pozostaje nadal kontrowersyjny.

Tylko w pojedynczych badaniach obserwowano zwi

kszenie ryzyka cGvHD u chorych,

u których jako kondycjonowanie stosowano TBI. Wzrost ryzyka cGvHD mógłby

wynika

z wi

kszego ni

w przypadku chemioterapii uszkodzenia grasicy przez

promieniowanie jonizuj

ce. Uszkodzenie grasicy powoduje upo

ledzenie centralnych

mechanizmów wytwarzania tolerancji, co w konsekwencji prowadzi do rozwoju cGvHD

(29;39;42;125).

Nie zaobserwowano statystycznie istotnej zale

ci pomi

dzy, rozpoznaniem

choroby zasadniczej a wyst

powaniem cGvHD. Wyst

pienie cGvHD u wszystkich

chorych z ALL zwi

zane było z zastosowanym rodzajem kondycjonowania:

u wszystkich chorych z ALL post

powaniem przygotowawczym było TBI. Opisywane

w literaturze cz

stsze wyst

powanie cGvHD u chorych z CML równie

nie zostało

potwierdzone w badanej grupie.

Nie stwierdzono statystycznej ró

nicy w proporcji kobiet : m

ęŜ

czyzn w grupach

chorych z i bez cGvHD. Wykazano natomiast,

e u wszystkich m

ęŜ

czyzn, u których

wykonano przeszczep komórek progenitorowych pobranych od siostry doszło do

rozwoju cGvHD. Zale

ść

ta była statystycznie znamienna (p=0,02). Wielu autorów

potwierdza,

e w przypadku przeszczepu, w którym płe

dawcy ró

ni si

od płci biorcy

czynnikiem ryzyka dla cGvHD jest jedynie układ dawca kobieta dla biorcy m

ęŜ

czyzny

(66;77;103;151) .

Kolejn

analizowan

zale

była ocena wpływu rodzaju materiału

przeszczepowego na cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD. W analizowanej grupie chorych

u wi

kszo

ci chorych wykonano przeszczep komórek progenitorowych pobranych

z krwi obwodowej (PBSCT - 43 chorych, co stanowi 84%) natomiast przeszczep

komórek progenitorowych pobranych ze szpiku (BMT) wykonano jedynie u 8 chorych.

Ró

nice wynikały z preferencji stosowania PBSCT w naszym o

rodku. Cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD była wy

sza u chorych poddanych PBSCT w stosunku do BMT

i wynosiła odpowiednio 72% i 62%. Powy

sze wyniki s

potwierdzeniem doniesie

przeszczep komórek progenitorowych krwi obwodowej istotnie zwi

ksza ryzyko

przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Jedn

z prób wyja

nienia

stszego wyst

powania cGvHD u chorych po PBSCT jest stwierdzenie zwi

kszenia

ilo

ci limfocytów TH2 w materiale przeszczepowym uzyskanym z krwi obwodowej

zdrowych dawców stymulowanych granulocytarnym czynnikiem wzrostu. Stosunkowo

wysoki w badanej grupie odsetek chorych po PBSCT mógł mie

wpływ na wi

ksz

opisywana w pi

miennictwie cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD - zwykle u chorych

poddanych transplantacji od zgodnego w układzie HLA dawcy rodzinnego nie

przekracza 50-60% BMT (36). Według wi

kszo

ci autorów nie zaobserwowano

zwi

kszenia cz

sto

ci wyst

powania aGvHD u chorych po PBSCT. Zwi

kszenie

sto

ci cGvHD bez wpływu na chorob

ostr

spowodowało wi

kszy odsetek

w badanej grupie cGvHD o typie „de novo” (50% w porównaniu do danych

literaturowych – 35%). Ze wzgl

dów na liczebno

ść

grup zale

ci te nie były istotne

statystycznie.

Oceniono równie

zale

ść

pomi

dzy wyst

powaniem aGvHD i cGvHD.

U 52% chorych, u których rozpoznano rozległ

cGvHD we wczesnym okresie

poprzeszczepowym obserwowano aGvHD. W grupie chorych, u których nie

rozpoznano cGvHD, aGvHD obserwowano jedynie u 20% chorych. Cz

sto

ść

wyst

powania aGvHD w grupie chorych z rozległ

postaci

cGvHD w porównaniu do

chorych bez cGvHD była statystycznie znamienna (p=0,04). Nie wykazano podobnej

zale

ci u chorych, u których rozpoznano posta

ograniczon

cGvHD. Porównano

równie

zale

ść

pomi

dzy stopniem zaawansowania aGvHD a wyst

powaniem

cGvHD. Nie wykazano równie

zale

ci pomi

dzy poszczególnymi stopniami

zaawansowania, a wyst

powaniem cGvHD, równie

w wydzielonych podgrupach

z chorob

rozległa b

ograniczon

. 80% chorych, u których wyst

piła aGvHD

przynajmniej III stopnia rozwin

ło rozległ

cGvHD (wyniki nie były istotnie

statystycznie). Wyst

pienie aGvHD jest jednym z najwa

niejszych czynników ryzyka

cGvHD. 70-80% chorych, u których rozpoznano chorob

ostr

rozwija cGvHD.

W analizach na du

ych grupach wielu autorów wykazuje równie

zale

ść

pomi

dzy

stopniem zaawansowania aGvHD a cz

sto

wyst

powania cGvHD (77). Sugeruje

cztery mechanizmy, by

e współistniej

ce ze sob

, które mogłyby tłumaczy

zale

ść

wyst

powania choroby ostrej i przewlekłej: 1) Objawy cGvHD mog

pó

niejsz

manifestacj

alloreaktywacji manifestuj

cej si

aGvHD. 2) cGvHD mo

wynika

z uszkodzenia tkanek, w szczególno

ci grasicy przez chorob

ostr

(146).

3) cGvHD jest wynikiem leczenia aGvHD, w szczególno

ci stosowania steroidów.

Mog

o tym

wiadczy

doniesienia,

e u chorych, u których stosowano prednison jako

profilaktyk

GvHD cz

sto

ść

wyst

powania cGvHD była istotnie wy

sza, a tak

e fakt

stszego wyst

powania cGvHD u chorych, którzy otrzymywali steroidy

we wczesnym okresie po transplantacji z przyczyn innych ni

GvHD (48;145).

4) Wreszcie aGvHD mo

e by

epifenomenem, którego wyst

powanie jest zwi

zane

z cGvHD, ale nie ma z ni

zwi

zku etiologicznego (77).

Nie wykazano statystycznie istotnych ró

nic w prze

yciu chorych w zale

od wyst

pienia cGvHD. W grupie 15 chorych bez cGvHD, 2 chorych zmarło z powodu

infekcji. Natomiast w grupie 36 chorych z cGvHD obserwowano 9 zgonów: 4 z powodu

wznowy choroby zasadniczej, 2 z powodu infekcji oraz 3 z powodu cGvHD.

Prawdopodobie

stwo prze

ycia w badanych grupach chorych wynosiło 0,85 dla

chorych bez rozpoznanej cGvHD i 0,73 dla chorych z cGvHD. W badaniach

przeprowadzonych na du

ej ilo

ci chorych wykazano,

e prze

ycie chorych z cGvHD

jest gorsze w porównaniu do chorych bez cGvHD. W szczególno

ci dotyczy to

chorych, u których rozpoznano chorob

rozległ

. Obni

enia krzywej prze

ycia wynika

ze zwi

kszenia

miertelno

ci z powodu powikła

nie zwi

zanych ze wznow

choroby

zasadniczej (infekcja, cGvHD) mimo korzy

ci wynikaj

cej z rzadszego wyst

powania

wznowy choroby zasadniczej (77;78;124;126). W badanym materiale nie analizowano

prze

ycia w zale

ci od rozległo

ci cGvHD, ze wzgl

du na stosunkowo niskie

liczebno

ci poszczególnych podgrup.

5.3 Wznowa choroby zasadniczej

Wznow

choroby zasadniczej obserwowano u 8 chorych (3 chorych z CML,

4 chorych z AML oraz 1 chorego z ALL ).

W przedstawionej grupie chorych z rozpoznaniem przewlekłej białaczki szpikowej

sto

ść

wznowy choroby zasadniczej była ni

sza ni

w pi

miennictwie i wynosiła

około 12% (3 chorych z 25). Rozpatruj

c nawrót CML w zale

ci od

ródła materiału

przeszczepowego mo

emy zauwa

e cz

sto

ść

wznowy u chorych poddanych

przeszczepowi komórek z krwi szpikowej wynosiła ok. 20% (jeden chory

z 5 po BMT), natomiast u chorych którzy otrzymali przeszczep komórek z krwi

obwodowej ok. 10% (2 z 20 po PBSCT). Wyst

powanie ni

szej cz

sto

ci wznowy

u chorych poddanych PBSCT była obserwowana przez innych badaczy i przynajmniej

ęś

ciowo mo

e by

efektem zwi

kszenia cz

sto

ci wyst

powania cGvHD (47).

Sukces terapeutyczny allogenicznej transplantacji komórek hematopoezy wynika nie

tylko z mo

liwo

ci eskalacji dawki chemio/radioterapii do poziomu toksyczno

„nie-szpikowych” organów. Wyniki transplantacji syngenicznych wykazały,

skuteczno

ść

całkowitej eradykacji komórek nowotworowych, mimo stosowania

post

powania mieloablacyjnego u chorych z AML w pierwszej remisji i CML w fazie

przewlekłej nie przekracza 40%. Znacz

popraw

wyników transplantacji

zaobserwowano u chorych poddanych transplantacji od niemonozygotycznego

rodze

stwa, gdzie cz

sto

ść

wznowy wynosiła ju

tylko 10-20% (50;56;128;144).

Dalsze badania potwierdziły znaczenie roli układu immunologicznego dawcy

w eliminacji komórek nowotworowych. Wykazano,

e proces eliminacji komórek

nowotworowych prowadz

cy ostatecznie do pełnej remisji molekularnej zachodzi

stopniowo przez wiele miesi

cy, co oznacza,

e nie jest on wynikiem bezpo

redniego

działania mieloablacyjnego kondycjonowania (88). Przewlekła białaczka szpikowa jest

chorob

, w której jako pierwszej udowodniono wyst

powanie efektu przeszczep

przeciwko białaczce (GvL). Znaczenie tego zjawiska potwierdziły wyniki przeszczepów

o zredukowanym kondycjonowaniu. Wykazano równie

liwo

ść

uzyskania pełnej

remisji stosuj

c infuzj

limfocytów dawcy w leczeniu wznowy choroby zasadniczej

nawet u chorych, u których wznowa wyst

piła po przeszczepie mieloablacyjnym.

Ze szczególnie wysok

efektywno

GvL u chorych z CML wi

ąŜ

e si

zmniejszenie

sto

ci wyst

powania wznowy u tych chorych, którzy rozwin

li cGvHD, poniewa

reakcja przeszczep przeciwko białaczce jest procesem cz

ęś

ciowo zale

nym od reakcji

przeszczep przeciwko gospodarzowi (92;128). W badanej grupie spo

ród 3 chorych

z CML, u których doszło do wznowy choroby zasadniczej, cGvHD w postaci

ograniczonej rozpoznano tylko u jednego chorego, natomiast nie obserwowano

wznowy u tych chorych z CML, którzy rozwin

li chorob

rozległ

Znacznie cz

ęś

ciej, bo u około 25% wznow

choroby zasadniczej obserwowano

w grupie chorych z ostr

białaczka szpikow

(4/17) oraz u chorych z ostr

białaczk

limfoblastyczn

(1/4). W tej grupie do wznowy doszło mimo obecno

ci objawów

rozległej postaci cGvHD (2 chorych) i postaci ograniczonej u 1 chorego, chocia

w momencie rozpoznania wznowy chorzy nie mieli ju

objawów aktywnej cGvHD.

Potwierdza to doniesienia o znacznie mniejszym nasileniu GvL w tych rozpoznaniach

w CML. Obecno

ść

efektu GvT wykazano ju

w wielu chorobach rozrostowych

układu krwiotwórczego, a tak

e niektórych guzach litych (rak nerki, rak piersi). Stopie

jego nasilenia, a co si

z tym wi

ąŜ

e skuteczno

ść

przeszczepu zale

y od rodzaju

choroby zasadniczej. Najwi

ksz

skuteczno

ść

wykazano w CML i CLL, po

redni

w AML i szpiczaku mnogim a najni

w ALL i chłoniakach o wysokim stopniu

zło

liwo

ci (42;54;97;128;141). Do zwi

zanych z chorob

zasadnicz

czynników

maj

cych wpływ na efektywno

ść

reakcji GvL nale

y ekspresja immunogennych

antygenów białaczkowych, a tak

e agresywno

ść

przebiegu choroby rozrostowej.

Reakcja

przeszczep

przeciwko

guzowi

(GvL,

GvT)

wymaga

czasu,

a szybkie narastanie ilo

ci komórek nowotworowych obserwowane w przypadku

wznowy ostrej białaczki znacz

co ogranicza skuteczno

ść

(6;40;141).

Wyst

pienie cGvHD zmniejsza, ale nie wyklucza mo

liwo

ci wznowy choroby

zasadniczej. Wg niektórych autorów wznowa jest przyczyn

10-20% zgonów u chorych

z rozpoznan

cGvHD i zwykle dotyczy chorych z choroba o łagodniejszym przebiegu.

(2;51;144;148).

Oceniaj

wyst

powanie

wznowy

choroby

zasadniczej

u chorych z cGvHD wielu autorów zwraca uwag

na niedoskonało

ść

klasyfikacji,

w której chorzy z rozpoznaniem cGvHD stanowi

skrajnie heterogenna grup

Dodatkowym problemem s

bł

dy wynikaj

ce z nadrozpoznawania cGvHD, co zdarza

ęś

ciej u chorych z chorob

łagodniejsz

.Zarówno fałszywe rozpoznanie jak

i brak dostosowywania standardów leczenia do stopnia ci

ęŜ

ci stwarza mo

liwo

ść

„przeleczenia” (80). Efektem tego jest zmniejszenie skuteczno

ci GvL niepotrzebn

terapi

immnosupresyjn

, co w konsekwencji mo

e prowadzi

do wznowy choroby.

Równie

obserwacje prowadzone w naszym o

rodku wykazały,

e u cz

ęś

ci chorych

ponowne pojawienie si

własnego DNA mo

e pojawia

w trakcie terapii

immunosupresyjnej (16). W obserwowanej grupie chorych wznow

choroby

zasadniczej obserwowano w okresie wyciszenia objawów cGvHD podczas gdy chory

otrzymywał jeszcze podtrzymuj

terapi

immunosupresyjn

. Powy

sze wyniki

potwierdzaj

konieczno

ść

dalszego dopracowania klasyfikacji cGvHD, szczególnie

w ocenie postaci rozległej, co stworzyłoby mo

liwo

ść

dostosowania schematów

leczenia cGvHD do ci

ęŜ

ci przebiegu i mogłoby zmniejszy

miertelno

ść

wynikaj

z nawrotu choroby zasadniczej w tej grupie. Niew

tpliwie opracowanie metod terapii

prowadz

cej do kontroli objawów cGvHD bez zaburzania GvL stanowi jedno

z najwa

niejszych wyzwa

współczesnej transplantologii.

Wreszcie oceniaj

c wyst

powanie wznowy u chorych z cGvHD, nale

y zwróci

uwag

nie tylko na heterogenno

ść

przebiegu cGvHD, ale równie

znaczne ró

nice

w zaawansowaniu choroby podstawowej b

cej wskazaniem do wykonania

transplantacji szpiku. U chorych z chorob

zaawansowan

– w kolejnej remisji, kryzie

blastycznej CML, oraz u chorych przeszczepianych bez remisji nie obserwuje si

tak

korzystnego efektu cGvHD jak u chorych z mniej zaawansowan

chorob

(faz

przewlekła CML lub w pierwszej remisji). Ogromne znaczenie ma równie

rodzaj

choroby rozrostowej – poniewa

udowodniono,

e nasilenie efektu GvT wynika w du

mierze z samego rozpoznania.

Zwraca równie

uwag

a cz

sto

ść

wyst

powania, w badanej grupie wznowy

pozaszpikowej, co mo

na tłumaczy

gorsz

dost

pno

pewnych obszarów

organizmu dla komórek układu immunologicznego.

Do chwili obecnej z badanej grupy 51 pacjentów zmarło 11 chorych (22%).

U 5 (46%)

chorych

przyczyn

mierci

była

wznowa

choroby

zasadniczej,

u 3 (27%)chorych powikłania infekcyjne, u kolejnych 3 (27%) cGvHD. 9 chorych zmarło

w przedziale czasowym pomi

dzy 100 a 600 dob

po transplantacji, a tylko 2 kolejne

osoby do doby 1200. Nast

pnie krzywa osi

ła plateau z prawdopodobie

stwem

prze

ycia ok. 0,73. Nawrót choroby zasadniczej stanowi obecnie jedn

z głównych

przyczyn zgonów pó

nych, u chorych, którzy prze

yli 24 miesi

ce po przeszczepie jest

najcz

stsz

przyczyn

mierci (47 – 56%). Natomiast zgony z powodu cGvHD

obserwuje si

głownie do 24 miesi

cy po przeszczepie (65;126).

Podsumowanie

Wykorzystanie chimeryzmu hematopoetycznego do oceny zagro

enia

wyst

pieniem cGvHD mo

e by

kolejn

cenn

informacj

ułatwiaj

prowadzenie

chorych po HSCT. W powy

szej pracy wykazano zale

ci mi

dzy czasem uzyskania

CC a cGvHD na stosunkowo niewielkiej liczbie (51) chorych. Ze wzgl

du na

nowoczesno

ść

ytej metody oraz stosunkowo długi okres obserwacji po przeszczepie

uzyskane wyniki mog

wskazówk

do dalszych bada

. Ostatecznie rola pełnego

chimeryzmu w zagro

eniu rozwojem cGvHD wymaga dalszej obserwacji oraz

potwierdzenia na du

ej grupie chorych.

WNIOSKI:

1a Oceniaj

c chimeryzm metod

STR multiplex PCR z zastosowaniem

elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze DNA wykazano,

u wi

kszo

ci chorych eliminacj

hematopoezy biorcy obserwuje si

pó

niej ni

w 30 dobie.

1b Zastosowanie w kondycjonowaniu na

wietlenia całego ciała (TBI) w dawce

12Gy powoduje szybsze osi

gni

cie pełnego chimeryzmu w porównaniu do

chorych poddanych jedynie chemioterapii.

1c Oznaczanie chimeryzmu w poszczególnych populacjach leukocytów krwi

obwodowej zwi

ksza czuło

ść

metody umo

liwiaj

c wykrywanie przetrwałych

komórek biorcy nawet u chorych, u których stwierdzono CC w krwi obwodowej.

Przetrwał

populacj

biorcy manifestuj

jako mieszany chimeryzm krwi

obwodowej u wi

kszo

ci chorych jest populacja limfocytów CD3.

2a W grupie chorych, u których obserwowano wczesny pełny chimeryzm

statystycznie znamiennie cz

ęś

ciej wyst

puje rozległa posta

cGvHD, jej

przebieg jest ci

ęŜ

szy: wi

kszy odsetek chorych wymaga przynajmniej

trzylekowej terapii immunosupresyjnej, cz

ęś

ciej obserwuje si

zgony z powodu

cGvHD.

2b Nie stwierdzono statystycznie istotnej ró

nicy w cz

sto

ci wyst

powania

wznowy w obu grupach. W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem nie

obserwowano wznowy u chorych z CML, a u wi

kszo

ci chorych rozpoznano

wznow

pozaszpikow

(75%).

2c Prawdopodobie

stwo prze

ycia jest ni

sze u chorych, którzy osi

li wczesny

CC (0,72) w porównaniu do chorych z pó

nym chimeryzmem (0,84) i wynika

z cz

stszego wyst

powania zgonów niezwi

zanych ze wznow

choroby

zasadniczej.

STRESZCZENIE

Allogeniczna transplantacja komórek układu krwiotwórczego jest dla wielu

schorze

hematologicznych jedyn

metod

prowadz

do wyleczenia. Do

najwa

niejszych przyczyn niepowodze

zalicza si

chorob

przeszczep przeciwko

gospodarzowi i wznow

choroby zasadniczej. W

ród wielu wykonywanych rutynowo

bada

diagnostycznych u chorych poddanych transplantacji szpiku na szczególn

uwag

zasługuje ocena chimeryzmu hematopoetycznego. Wykorzystywana jest ona do

potwierdzenia przyj

cia lub odrzucenia przeszczepu, a tak

e do oceny stopnia

zagro

enia wznow

choroby zasadniczej, co umo

liwia podj

cie wyprzedzaj

cych

działa

terapeutycznych. Po

ród wielu metod wykorzystywanych do oceny chimeryzmu

hematopoetycznego szczególne uznanie zyskała metoda oparta na analizie alleli STR

amplifikowanych w reakcji multiplex PCR, a nast

pnie rozdzielanych za pomoc

elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze DNA.

Prowadz

c ocen

chimeryzmu krwi obwodowej t

metod

wykazano,

e po

ród

ocenionych 51 chorych, którzy osi

li pełny chimeryzm, 25 pacjentów wyeliminowało

komórki własnej hematopoezy do doby 100 wł

cznie (wczesny pełny chimeryzm),

u kolejnych 26 CC został uzyskany w dalszej obserwacji (pó

ny chimeryzm). Mediana

czasu uzyskania CC w pierwszej grupie wynosiła 60 dni, w drugiej 270 dni.

W podgrupach chorych wydzielonych na podstawie czasu uzyskania CC oceniono

sto

ść

wyst

powania cGvHD oraz wznowy choroby zasadniczej.

W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem cGvHD w postaci rozległej

obserwowano u 21/25 chorych, w porównaniu do grupy chorych z pó

nym CC, gdzie

rozległ

cGvHD rozpoznano u 8 pacjentów. Ró

nice w cz

sto

ci wyst

powania

rozległej cGvHD w poszczególnych grupach były statystycznie istotnie (p<0,001).

Wykazano równie

ęŜ

szy przebieg cGvHD w grupie chorych z wczesnym CC: 52%

chorych do kontroli objawów choroby wymagała przynajmniej trzylekowej terapii

(p<0,005), cz

ęś

ciej równie

obserwowano zgony z powodu cGvHD. Zaobserwowano

równie

statystycznie istotn

korelacj

czasow

pomi

dzy czasem osi

gni

cia CC

a wyst

pieniem cGvHD. W grupie chorych z wczesnym CC u wszystkich chorych

osi

gni

cie CC poprzedzało wyst

pienie pierwszych objawów cGvHD,

rednio o 85

dni. Natomiast u 10/13 chorych w grupie z pó

nym chimeryzmem objawy cGvHD

poprzedziły osi

gni

cie CC,

rednio o 100 dni.

SUMMARY

Transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells is the only curative method

of the treatment in several haematological diseases. The main reasons of failure in this

therapeutical approach is graft versus host disease and relapse of underlying disease.

Among many routine tests done in patients after transplantation haematopoietic

chimerism evaluation is particularly interesting. It is performed in order to confirm donor

engraftment or graft rejection as well as to evaluate risk of disease recurrence. In some

cases it allows employment of pre-emptive therapeutical measures to avoid relapse. Of

many methods used for chimerism evaluation one has gained particular importance. It

is analysis of STR allele amplification in multiplex PCR reaction after capillary

electrophoresis and automatic DNA sequencing.

Peripheral blood chimerism was evaluated with that method in patients after

allogeneic stem cell transplantations. Of 51 patients who achieved complete donor

chimerism (CC), 25 eliminated own cells up to 100 days after transplantation (early

CC). The remaining 26 patients achieved complete donor chimerism at a later time

during the course of follow-up (late CC). Median time to reach CC in the first group was

60 days, while in the latter it was 270 days. Chronic graft versus host disease (cGvHD)

and relapse was evaluated in the two groups of patients.

In early CC group extensive cGvHD was seen in 21 of 25 patients, while in late CC

group it was noted only in 8 of 26 patients (p<0,001). Clinical course of cGvHD was

more severe in early CC than in late CC group: 52% of patients in the first one required

three-drug immunosuppression (p<0,005) and deaths resulting from that complication

were more frequent. A statistically important time correlation between time to reach CC

and emergence of cGvHD symptoms was also seen. In early CC group achievement of

CC invariably preceded appearance of cGvHD symtoms by a mean time of 85 days. In

late CC group symptoms of cGvHD preceded achievement ot CC by a mean time of

100 days in 10 of 13 patients.

Incidence of relapse in the two groups was not statistically different.

15 patients had chimerism evaluation performed in a more detailed way in isolated

peripheral blood cell populations. It was proved that it enhances the method’s

sensitivity an allows to detect residual recipient cells in patients who show CC in total

MIENNICTWO

(1) Agrawal S, Khan F, Talwar S, Nityanand S. Short tandem repeat technology has

diverse applications: individual identification, phylogenetic reconstruction and
chimerism based post haematopoietic stem cell transplantation graft monitoring.
Indian J Med Sci 2004; 58:297-304.

(2) Akpek G, Zahurak ML, Piantadosi S, Margolis J, Doherty J, Davidson R et al.

Development of a prognostic model for grading chronic graft-versus-host disease.
Blood 2001; 97:1219-1226.

(3) Alyea EP, Kim HT, Ho V, Cutler C, Gribben J, DeAngelo DJ et al. Comparative

outcome of nonmyeloablative and myeloablative allogeneic hematopoietic cell
transplantation for patients older than 50 years of age. Blood 2005; 105:1810-1814.

(4) Ancin I, Ferra C, Gallardo D, Peris J, Berlanga J, Gonzalez JR et al. Do

corticosteroids add any benefit to standard GVHD prophylaxis in allogeneic BMT?
Bone Marrow Transplant 2001; 28:39-45.

(5) Antin JH. Clinical practice. Long-term care after hematopoietic-cell transplantation in

adults. N Engl J Med 2002; 347:36-42.

(6) Antin JH. Stem cell transplantation-harnessing of graft-versus-malignancy. Curr Opin

Hematol 2003; 10:440-444.

(7) Antin JH, Childs R, Filipovich AH, Giralt S, Mackinnon S, Spitzer T et al.

Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic
lymphohematopoietic transplantation: recommendations from a workshop at the 2001
tandem meetings. Biol Blood Marrow Transplant 2001; 7:473-485.

(8) Apperley JF, Girinsky T, Friedrich W. Conditioning Regiments. The EBMT Handbook.

2004: 99-101.

(9) Atkinson K, Horowitz MM, Gale RP, van Bekkum DW, Gluckman E, Good RA et al.

Risk factors for chronic graft-versus-host disease after HLA-identical sibling bone
marrow transplantation. Blood 1990; 75:2459-2464.

(10) Auffermann-Gretzinger S, Lossos IS, Vayntrub TA, Leong W, Grumet FC, Blume KG

et al. Rapid establishment of dendritic cell chimerism in allogeneic hematopoietic cell
transplant recipients. Blood 2002; 99:1442-1448.

(11) Bader P, Duckers G, Kreyenberg H, Hoelle W, Kerst G, Lang P et al. Monitoring of

donor cell chimerism for the detection of relapse and early immunotherapeutic
intervention in acute lymphoblastic leukemias. Ann Hematol 2002; 81 Suppl 2:S25-
S27.

(12) Bader P, Kreyenberg H, Hoelle W, Dueckers G, Handgretinger R, Lang P et al.

Increasing mixed chimerism is an important prognostic factor for unfavorable outcome
in children with acute lymphoblastic leukemia after allogeneic stem-cell
transplantation: possible role for pre-emptive immunotherapy? J Clin Oncol 2004;
22:1696-1705.

(13) Bader P, Kreyenberg H, Hoelle W, Dueckers G, Kremens B, Dilloo D et al. Increasing

mixed chimerism defines a high-risk group of childhood acute myelogenous leukemia
patients after allogeneic stem cell transplantation where pre-emptive immunotherapy
may be effective. Bone Marrow Transplant 2004; 33:815-821.

(14) Bader P, Niethammer D, Willasch A, Kreyenberg H, Klingebiel T. How and when

should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation? Bone Marrow
Transplant 2005; 35:107-119.

(15) Balon J, Bieniaszewska M, Reichert M, Pawłowski R, Hellmann A. Monitorowanie

chimeryzmu

hemopoetycznego

allogenicznej

transplantacji

komórek

progenitorowych

półilo

ciow

metod

elektroforezy

kapilarnej

przy

yciu

automatycznego sekwenatora DNA . Acta Haematol.Pol. 30[Supplement 2], 429.
1999.

(16) Balon J, Bieniaszewska M, Hałaburda K, Reichert M, Pawłowski RHA. Wpływ terapii

immunosupresyjnej na chimeryzm hemopoetyczny w 180 i 270 dobie po
allotransplantacji komórek progenitorowych hemopoezy. Hematologia 2000 .

(17) Bar BM, Schattenberg A, de Man AJ, Hoogenhout MJ, Boezeman J, De Witte T.

Influence of the conditioning regimen on erythrocyte chimerism, graft-versus-host
disease and relapse after allogeneic transplantation with lymphocyte depleted
marrow. Bone Marrow Transplant 1992; 10:45-52.

(18) Barkholt L, Hentschke P, Zetterquist H, Mattsson J, Uzunel M, Wersall P et al. An

allogeneic anti-cancer effect after hematopoietic stem cell transplantation. Transplant
Proc 2001; 33:1862-1864.

(19) Baron F, Storb R. Allogeneic hematopoietic cell transplantation as treatment for

hematological malignancies: a review. Springer Semin Immunopathol 2004; 26:71-94.

(20) Baron F, Storb R. Current roles for allogeneic hematopoietic cell transplantation

following nonmyeloablative or reduced-intensity conditioning. Clin Adv Hematol Oncol
2005; 3:799-819.

(21) Baron F, Storb R, Little MT. Hematopoietic cell transplantation: five decades of

progress. Arch Med Res 2003; 34:528-544.

(22) Barrett AJ, van Rhee F. Graft-versus-leukaemia. Baillieres Clin Haematol 1997;

10:337-355.

(23) Basara N, Fauser AA. Safety profile of mycophenolate mofetil. Bone Marrow

Transplant 2000; 26:1362-1363.

(24) Basara N, Kiehl MG, Blau W, Romer E, Bischoff M, Schmetzer B et al.

Mycophenolate Mofetil in the treatment of acute and chronic GVHD in hematopoietic
stem cell transplant patients: four years of experience. Transplant Proc 2001;
33:2121-2123.

(25) Benito AI, Diaz MA, Gonzalez-Vicent M, Sevilla J, Madero L. Hematopoietic stem cell

transplantation using umbilical cord blood progenitors: review of current clinical
results. Bone Marrow Transplant 2004; 33:675-690.

(26) Bensinger WI, Clift R, Martin P, Appelbaum FR, Demirer T, Gooley T et al. Allogeneic

peripheral blood stem cell transplantation in patients with advanced hematologic
malignancies: a retrospective comparison with marrow transplantation. Blood 1996;
88:2794-2800.

(27) Bensinger WI, Storb R. Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation. Rev Clin

Exp Hematol 2001; 5:67-86.

(28) Bieniaszewska M, Balon J, Hałaburda K, Reichert M, Pawłowski R, Hellmann A.

Comparison of CR based methods for monitoring of chimerism after allogeneic stem
cell transplantation (alloSCT). Gel vs capillary electrophoresis of short tandem
repeats (STR) markers. Bone Marrow Transplant 2000. 25[Supplement 1], 277.

(29) Blaise D, Maraninchi D, Michallet M, Reiffers J, Jouet JP, Milpied N et al. Long-term

follow-up of a randomized trial comparing the combination of cyclophosphamide with
total body irradiation or busulfan as conditioning regimen for patients receiving HLA-
identical marrow grafts for acute myeloblastic leukemia in first complete remission.
Blood 2001; 97:3669-3671.

(30) Busca A, Saroglia EM, Lanino E, Manfredini L, Uderzo C, Nicolini B et al.

Mycophenolate mofetil (MMF) as therapy for refractory chronic GVHD (cGVHD) in
children receiving bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2000;
25:1067-1071.

(31) Butcher BW, Collins RH, Jr. The graft-versus-lymphoma effect: clinical review and

future opportunities. Bone Marrow Transplant 2005; 36:1-17.

(32) Carnevale-Schianca F, Martin P, Sullivan K, Flowers M, Gooley T, Anasetti C et al.

Changing from cyclosporine to tacrolimus as salvage therapy for chronic graft-versus-
host disease. Biol Blood Marrow Transplant 2000; 6:613-620.

(33) Chabannon C, Lafage M, Mozziconacci MJ, Faucher C, Maraninchi D, Blaise D. Early

establishment of chimerism in the B and T lymphoid lineages after transplantation of
allogeneic mobilized blood cells in leukemic patients. Transplantation 1997; 63:1646-
1652.

(34) Chakrabarti S, Handa SK, Bryon RJ, Griffiths MJ, Milligan DW. Will mixed chimerism

cure autoimmune diseases after a nonmyeloablative stem cell transplant?
Transplantation 2001; 72:340-342.

(35) Chalandon Y, Vischer S, Helg C, Chapuis B, Roosnek E. Quantitative analysis of

chimerism after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of
microsatellite markers and capillary electrophoresis with fluorescence detection: the
Geneva experience. Leukemia 2003; 17:228-231.

(36) Champlin RE, Schmitz N, Horowitz MM, Chapuis B, Chopra R, Cornelissen JJ et al.

Blood stem cells compared with bone marrow as a source of hematopoietic cells for
allogeneic transplantation. IBMTR Histocompatibility and Stem Cell Sources Working
Committee and the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT).
Blood 2000; 95:3702-3709.

(37) Chao NJ, Parker PM, Niland JC, Wong RM, Dagis A, Long GD et al. Paradoxical

effect of thalidomide prophylaxis on chronic graft-vs.-host disease. Biol Blood Marrow
Transplant 1996; 2:86-92.

(38) Childs R, Clave E, Contentin N, Jayasekera D, Hensel N, Leitman S et al.

Engraftment kinetics after nonmyeloablative allogeneic peripheral blood stem cell
transplantation: full donor T-cell chimerism precedes alloimmune responses. Blood
1999; 94:3234-3241.

(39) Clift RA, Buckner CD, Thomas ED, Bensinger WI, Bowden R, Bryant E et al. Marrow

transplantation for chronic myeloid leukemia: a randomized study comparing
cyclophosphamide and total body irradiation with busulfan and cyclophosphamide.
Blood 1994; 84:2036-2043.

(40) Collins RH, Jr., Goldstein S, Giralt S, Levine J, Porter D, Drobyski W et al. Donor

leukocyte infusions in acute lymphocytic leukemia. Bone Marrow Transplant 2000;
26:511-516.

(41) Colson YL, Li H, Boggs SS, Patrene KD, Johnson PC, Ildstad ST. Durable mixed

allogeneic chimerism and tolerance by a nonlethal radiation-based cytoreductive
approach. J Immunol 1996; 157:2820-2829.

(42) Corvo R, Paoli G, Barra S, Bacigalupo A, Van Lint MT, Franzone P et al. Total body

irradiation correlates with chronic graft versus host disease and affects prognosis of
patients with acute lymphoblastic leukemia receiving an HLA identical allogeneic
bone marrow transplant. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1999; 43:497-503.

(43) Curtis RE, Metayer C, Rizzo JD, Socie G, Sobocinski KA, Flowers ME et al. Impact of

chronic GVHD therapy on the development of squamous-cell cancers after
hematopoietic stem-cell transplantation: an international case-control study. Blood
2005; 105:3802-3811.

(44) Curtis RE, Rowlings PA, Deeg HJ, Shriner DA, Socie G, Travis LB et al. Solid cancers

after bone marrow transplantation. N Engl J Med 1997; 336:897-904.

(45) Cutler C, Antin JH. Sirolimus for GVHD prophylaxis in allogeneic stem cell

transplantation. Bone Marrow Transplant 2004; 34:471-476.

(46) Cutler C, Antin JH. An overview of hematopoietic stem cell transplantation. Clin Chest

Med 2005; 26:517-527.

(47) Cutler C, Giri S, Jeyapalan S, Paniagua D, Viswanathan A, Antin JH. Acute and

chronic graft-versus-host disease after allogeneic peripheral-blood stem-cell and
bone marrow transplantation: a meta-analysis. J Clin Oncol 2001; 19:3685-3691.

(48) Deeg HJ, Lin D, Leisenring W, Boeckh M, Anasetti C, Appelbaum FR et al.

Cyclosporine or cyclosporine plus methylprednisolone for prophylaxis of graft-versus-
host disease: a prospective, randomized trial. Blood 1997; 89:3880-3887.

(49) Deeg HJ, Storb R. Graft-versus-host disease: pathophysiological and clinical aspects.

Annu Rev Med 1984; 35:11-24.

(50) Enright H, Daniels K, Arthur DC, Dusenbery KE, Kersey JH, Kim T et al. Related

donor marrow transplant for chronic myeloid leukemia: patient characteristics
predictive of outcome. Bone Marrow Transplant 1996; 17:537-542.

(51) Enright H, Davies SM, Defor T, Shu X, Weisdorf D, Miller W et al. Relapse after non-

T-cell-depleted allogeneic bone marrow transplantation for chronic myelogenous
leukemia: early transplantation, use of an unrelated donor, and chronic graft-versus-
host disease are protective. Blood 1996; 88:714-720.

(52) Filipovich AH, Weisdorf D, Pavletic S, Socie G, Wingard JR, Lee SJ et al. National

Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in
Chronic Graft-versus-Host Disease: I. Diagnosis and Staging Working Group Report.
Biol Blood Marrow Transplant 2005; 11:945-956.

(53) Flowers ME, Parker PM, Johnston LJ, Matos AV, Storer B, Bensinger WI et al.

Comparison of chronic graft-versus-host disease after transplantation of peripheral
blood stem cells versus bone marrow in allogeneic recipients: long-term follow-up of a
randomized trial. Blood 2002; 100:415-419.

(54) Frassoni F, Scarpati D, Bacigalupo A, Vitale V, Corvo R, Miceli S et al. The effect of

total body irradiation dose and chronic graft-versus-host disease on leukaemic
relapse after allogeneic bone marrow transplantation. Br J Haematol 1989; 73:211-
216.

(55) Friedman J, McGillivray B. Polimorfizm genetyczny. Genetyka. 2005: 81-89.

(56) Gale RP, Horowitz MM, Ash RC, Champlin RE, Goldman JM, Rimm AA et al.

Identical-twin bone marrow transplants for leukemia. Ann Intern Med 1994; 120:646-
652.

(57) Gardiner N, Lawler M, O'Riordan J, DeArce M, Humphries P, McCann SR. Persistent

donor chimaerism is consistent with disease-free survival following BMT for chronic
myeloid leukaemia. Bone Marrow Transplant 1997; 20:235-241.

(58) Georges GE, Storb R. Review of "minitransplantation": nonmyeloablative allogeneic

hematopoietic stem cell transplantation. Int J Hematol 2003; 77:3-14.

(59) Ginsburg D, Antin JH, Smith BR, Orkin SH, Rappeport JM. Origin of cell populations

after bone marrow transplantation. Analysis using DNA sequence polymorphisms. J
Clin Invest 1985; 75:596-603.

(60) Gleissner B, Blau IW, Sindram A, Reinhardt R, Knauf W, Thiel E. Analysis of

chimerism during the early period after allogeneic peripheral stem cell transplantation.
Clin Lab Haematol 2001; 23:401-406.

(61) Gluckman E, Rocha V, Boyer-Chammard A, Locatelli F, Arcese W, Pasquini R et al.

Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord
Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group. N
Engl J Med 1997; 337:373-381.

(62) Granados E, de la CR, Madero L, Diaz MA, Martin-Regueira P, Steegmann JL et al.

Hematopoietic cell transplantation in acute lymphoblastic leukemia: better long term
event-free survival with conditioning regimens containing total body irradiation.
Haematologica 2000; 85:1060-1067.

(63) Gratwohl A, Baldomero H, Passweg J, Frassoni F, Niederwieser D, Schmitz N et al.

Hematopoietic stem cell transplantation for hematological malignancies in Europe.
Leukemia 2003; 17:941-959.

(64) Gratwohl A, Baldomero H, Passweg J, Urbano-Ispizua A. Increasing use of reduced

intensity conditioning transplants: report of the 2001 EBMT activity survey. Bone
Marrow Transplant 2002; 30:813-831.

(65) Gratwohl A, Brand R, Frassoni F, Rocha V, Niederwieser D, Reusser P et al. Cause

of death after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) in early
leukaemias: an EBMT analysis of lethal infectious complications and changes over
calendar time. Bone Marrow Transplant 2005; 36:757-769.

(66) Higman M, Vogelsang G. Chronic graft versus host disease. Br J Haematol 2004;

125:435-454.

(67) Hill RS, Petersen FB, Storb R, Appelbaum FR, Doney K, Dahlberg S et al. Mixed

hematologic chimerism after allogeneic marrow transplantation for severe aplastic
anemia is associated with a higher risk of graft rejection and a lessened incidence of
acute graft-versus-host disease. Blood 1986; 67:811-816.

(68) Hogan WJ, Storb R. Use of cyclosporine in hematopoietic cell transplantation.

Transplant Proc 2004; 36:367S-371S.

(69) Huss R, Deeg HJ, Gooley T, Bryant E, Leisenring W, Clift R et al. Effect of mixed

chimerism on graft-versus-host disease, disease recurrence and survival after HLA-
identical marrow transplantation for aplastic anemia or chronic myelogenous
leukemia. Bone Marrow Transplant 1996; 18:767-776.

(70) Imamura M, Tsutsumi Y, Miura Y, Toubai T, Tanaka J. Immune reconstitution and

tolerance after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Hematology 2003;
8:19-26.

(71) Jaksch M, Uzunel M, Remberger M, Sundberg B, Mattsson J. Molecular monitoring of

T-cell chimerism early after allogeneic stem cell transplantation may predict the
occurrence of acute GVHD grades II-IV. Clin Transplant 2005; 19:346-349.

(72) Jolkowska JWM. Chimeryzm komórkowy po transplantacji szpiku kostnego. Acta

Haematol Pol 2004; 35:321-328.

(73) Kansu E, Gooley T, Flowers ME, Anasetti C, Deeg HJ, Nash RA et al. Administration

of cyclosporine for 24 months compared with 6 months for prevention of chronic graft-
versus-host disease: a prospective randomized clinical trial. Blood 2001; 98:3868-
3870.

(74) Keever-Taylor CA, Bredeson C, Loberiza FR, Casper JT, Lawton C, Rizzo D et al.

Analysis of risk factors for the development of GVHD after T cell-depleted allogeneic
BMT: effect of HLA disparity, ABO incompatibility, and method of T-cell depletion. Biol
Blood Marrow Transplant 2001; 7:620-630.

(75) Khan F, Agarwal A, Agrawal S. Significance of chimerism in hematopoietic stem cell

transplantation: new variations on an old theme. Bone Marrow Transplant 2004; 34:1-
12.

(76) Koc S, Leisenring W, Flowers ME, Anasetti C, Deeg HJ, Nash RA et al. Therapy for

chronic graft-versus-host disease: a randomized trial comparing cyclosporine plus
prednisone versus prednisone alone. Blood 2002; 100:48-51.

(77) Lee SJ. New approaches for preventing and treating chronic graft versus host

disease. Blood 2005; 105:4200-4206.

(78) Lee SJ, Klein JP, Barrett AJ, Ringden O, Antin JH, Cahn JY et al. Severity of chronic

graft-versus-host disease: association with treatment-related mortality and relapse.
Blood 2002; 100:406-414.

(79) Lee SJ, Vogelsang G, Flowers ME. Chronic graft-versus-host disease. Biol Blood

Marrow Transplant 2003; 9:215-233.

(80) Lee SJ, Vogelsang G, Gilman A, Weisdorf DJ, Pavletic S, Antin JH et al. A survey of

diagnosis, management, and grading of chronic GVHD. Biol Blood Marrow Transplant
2002; 8:32-39.

(81) Lion T, Daxberger H, Dubovsky J, Filipcik P, Fritsch G, Printz D et al. Analysis of

chimerism within specific leukocyte subsets for detection of residual or recurrent
leukemia in pediatric patients after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia
2001; 15:307-310.

(82) Maas F, Schaap N, Kolen S, Zoetbrood A, Buno I, Dolstra H et al. Quantification of

donor and recipient hemopoietic cells by real-time PCR of single nucleotide
polymorphisms. Leukemia 2003; 17:630-633.

(83) Mangioni S, Balduzzi A, Rivolta A, Rovelli A, Nesi F, Rossi V et al. Long-term

persistence of hemopoietic chimerism following sex-mismatched bone marrow
transplantation. Bone Marrow Transplant 1997; 20:969-973.

(84) Mapara MY, Kim YM, Wang SP, Bronson R, Sachs DH, Sykes M. Donor lymphocyte

infusions mediate superior graft-versus-leukemia effects in mixed compared to fully
allogeneic chimeras: a critical role for host antigen-presenting cells. Blood 2002;
100:1903-1909.

(85) Martin P, Carpenter PA, Sanders J, Flowers M. Clinical management of chronic Graft

versus host disease. Acta Haematol Pol 2003; 34:290-301.

(86) Matthes-Martin S, Lion T, Haas OA, Frommlet F, Daxberger H, Konig M et al.

Lineage-specific chimaerism after stem cell transplantation in children following
reduced intensity conditioning: potential predictive value of NK cell chimaerism for late
graft rejection. Leukemia 2003; 17:1934-1942.

(87) Mattsson J, Uzunel M, Tammik L, Aschan J, Ringden O. Leukemia lineage-specific

chimerism analysis is a sensitive predictor of relapse in patients with acute myeloid
leukemia and myelodysplastic syndrome after allogeneic stem cell transplantation.
Leukemia 2001; 15:1976-1985.

(88) McSweeney PA, Niederwieser D, Shizuru JA, Sandmaier BM, Molina AJ, Maloney

DG et al. Hematopoietic cell transplantation in older patients with hematologic
malignancies: replacing high-dose cytotoxic therapy with graft-versus-tumor effects.
Blood 2001; 97:3390-3400.

(89) McSweeney PA, Storb R. Mixed chimerism: preclinical studies and clinical

applications. Biol Blood Marrow Transplant 1999; 5:192-203.

(90) Mengarelli A, Iori AP, Romano A, Cerretti R, Cerilli L, De Propris MS et al. One-year

cyclosporine prophylaxis reduces the risk of developing extensive chronic graft-
versus-host disease after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation.
Haematologica 2003; 88:315-323.

(91) Miflin G, Stainer CJ, Carter GI, Byrne JL, Haynes AP, Russell NH. Comparative serial

quantitative measurements of chimaerism following unmanipulated allogeneic
transplantation of peripheral blood stem cells and bone marrow. Br J Haematol 1999;
107:429-440.

(92) Mohty M, Kuentz M, Michallet M, Bourhis JH, Milpied N, Sutton L et al. Chronic graft-

versus-host disease after allogeneic blood stem cell transplantation: long-term results
of a randomized study. Blood 2002; 100:3128-3134.

(93) Molloy K, Goulden N, Lawler M, Cornish J, Oakhill A, Pamphilon D et al. Patterns of

hematopoietic chimerism following bone marrow transplantation for childhood acute
lymphoblastic leukemia from volunteer unrelated donors. Blood 1996; 87:3027-3031.

(94) Mookerjee B, Altomonte V, Vogelsang G. Salvage therapy for refractory chronic graft-

versus-host disease with mycophenolate mofetil and tacrolimus. Bone Marrow
Transplant 1999; 24:517-520.

(95) Morton J, Hutchins C, Durrant S. Granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF)-

primed allogeneic bone marrow: significantly less graft-versus-host disease and
comparable engraftment to G-CSF-mobilized peripheral blood stem cells. Blood 2001;
98:3186-3191.

(96) Nash RA, Storb R. Graft-versus-host effect after allogeneic hematopoietic stem cell

transplantation: GVHD and GVL. Curr Opin Immunol 1996; 8:674-680.

(97) Nordlander A, Mattsson J, Ringden O, Leblanc K, Gustafsson B, Ljungman P et al.

Graft-versus-host disease is associated with a lower relapse incidence after
hematopoietic stem cell transplantation in patients with acute lymphoblastic leukemia.
Biol Blood Marrow Transplant 2004; 10:195-203.

(98) Ochs LA, Miller WJ, Filipovich AH, Haake RJ, McGlave PB, Blazar BR et al.

Predictive factors for chronic graft-versus-host disease after histocompatible sibling
donor bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1994; 13:455-460.

(99) Palka G, Stuppia L, Di Bartolomeo P, Morizio E, Peila R, Franchi PG et al. FISH

detection of mixed chimerism in 33 patients submitted to bone marrow
transplantation. Bone Marrow Transplant 1996; 17:231-236.

(100) Pegg, D.E. Bone Marrow transplantation: Lloyd - Luke Medical Books. 2005: 77-101.

(101) Przepiorka D, Anderlini P, Saliba R, Cleary K, Mehra R, Khouri I et al. Chronic graft-

versus-host disease after allogeneic blood stem cell transplantation. Blood 2001;
98:1695-1700.

(102) Przepiorka D, Weisdorf D, Martin P, Klingemann HG, Beatty P, Hows J et al. 1994

Consensus Conference on Acute GVHD Grading. Bone Marrow Transplant 1995;
15:825-828.

(103) Ratanatharathorn V, Ayash L, Lazarus HM, Fu J, Uberti JP. Chronic graft-versus-host

disease: clinical manifestation and therapy. Bone Marrow Transplant 2001; 28:121-
129.

(104) Remberger M, Beelen DW, Fauser A, Basara N, Basu O, Ringden O. Increased risk

of extensive chronic graft-versus-host disease after allogeneic peripheral blood stem
cell transplantation using unrelated donors. Blood 2005; 105:548-551.

(105) Riley RS, Idowu M, Chesney A, Zhao S, McCarty J, Lamb LS et al. Hematologic

aspects of myeloablative therapy and bone marrow transplantation. J Clin Lab Anal
2005; 19:47-79.

(106) Ringden O. Allogeneic bone marrow transplantation for hematological malignancies--

controversies and recent advances. Acta Oncol 1997; 36:549-564.

(107) Ringden O, Labopin M, Gorin NC, Schmitz N, Schaefer UW, Prentice HG et al. Is

there a graft-versus-leukaemia effect in the absence of graft-versus-host disease in
patients undergoing bone marrow transplantation for acute leukaemia? Br J Haematol
2000; 111:1130-1137.

(108) Ringden O, Paulin T, Lonnqvist B, Nilsson B. An analysis of factors predisposing to

chronic graft-versus-host disease. Exp Hematol 1985; 13:1062-1067.

(109) Ringden O, Remberger M, Runde V, Bornhauser M, Blau IW, Basara N et al.

Peripheral blood stem cell transplantation from unrelated donors: a comparison with
marrow transplantation. Blood 1999; 94:455-464.

(110) Schaap N, Schattenberg A, Bar B, Preijers F, van de Wiel van Kemenade, De Witte

T. Induction of graft-versus-leukemia to prevent relapse after partially lymphocyte-
depleted allogeneic bone marrow transplantation by pre-emptive donor leukocyte
infusions. Leukemia 2001; 15:1339-1346.

(111) Schaap N, Schattenberg A, Mensink E, Preijers F, Hillegers M, Knops R et al. Long-

term follow-up of persisting mixed chimerism after partially T cell-depleted allogeneic
stem cell transplantation. Leukemia 2002; 16:13-21.

(112) Schattenberg A, De Witte T, Salden M, Vet J, Van Dijk B, Smeets D et al. Mixed

hematopoietic chimerism after allogeneic transplantation with lymphocyte-depleted
bone marrow is not associated with a higher incidence of relapse. Blood 1989;
73:1367-1372.

(113) Schattenberg A, De Witte T, Salden M, Vet J, Van Dijk B, Smeets D et al. Mixed

hematopoietic chimerism after allogeneic transplantation with lymphocyte-depleted
bone marrow is not associated with a higher incidence of relapse. Blood 1989;
73:1367-1372.

(114) Schattenberg A, Schaap N, van de Wiel-van Kemenade, Bar B, Preijers F, van der

MR et al. In relapsed patients after lymphocyte depleted bone marrow transplantation
the percentage of donor T lymphocytes correlates well with the outcome of donor
leukocyte infusion. Leuk Lymphoma 1999; 32:317-325.

(115) Schattenberg AV, Dolstra H. Cellular adoptive immunotherapy after allogeneic stem

cell transplantation. Curr Opin Oncol 2005; 17:617-621.

(116) Schleuning M. Adoptive allogeneic immunotherapy--history and future perspectives.

Transfus Sci 2000; 23:133-150.

(117) Schraml E, Daxberger H, Watzinger F, Lion T. Quantitative analysis of chimerism

after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite
markers and capillary electrophoresis with fluorescence detection: the Vienna
experience. Leukemia 2003; 17:224-227.

(118) Seaton ED, Szydlo RM, Kanfer E, Apperley JF, Russell-Jones R. Influence of

extracorporeal photopheresis on clinical and laboratory parameters in chronic graft-
versus-host disease and analysis of predictors of response. Blood 2003; 102:1217-
1223.

(119) Shapira MY, Resnick IB, Bitan M, Ackerstein A, Samuel S, Elad S et al. Low

transplant-related mortality with allogeneic stem cell transplantation in elderly
patients. Bone Marrow Transplant 2004; 34:155-159.

(120) Shulman HM, Sullivan KM, Weiden PL, McDonald GB, Striker GE, Sale GE et al.

Chronic graft-versus-host syndrome in man. A long-term clinicopathologic study of 20
Seattle patients. Am J Med 1980; 69:204-217.

(121) Slavin S. Non-myeloablative stem cell transplantation for induction of host-versus-

graft tolerance for adoptive immunotherapy of malignant and nonmalignant diseases
and towards transplantation of organ allografts. Transplant Proc 2002; 34:3371-3373.

(122) Slavin S. Graft-versus-host disease, the graft-versus-leukemia effect, and mixed

chimerism following nonmyeloablative stem cell transplantation. Int J Hematol 2003;
78:195-207.

(123) Slavin

Reduced-intensity

conditioning

nonmyeloablative

stem

cell

transplantation: introduction, rationale, and historic background. Semin Oncol 2004;
31:1-3.

(124) Snowden JA, Nivison-Smith I, Atkinson K, Fay K, Concannon A, Dodds A et al.

Allogeneic PBPC transplantation: an effect on incidence and distribution of chronic
graft-versus-host disease without long-term survival benefit? Bone Marrow Transplant
2000; 25:119-120.

(125) Socie G, Clift RA, Blaise D, Devergie A, Ringden O, Martin PJ et al. Busulfan plus

cyclophosphamide compared with total-body irradiation plus cyclophosphamide
before marrow transplantation for myeloid leukemia: long-term follow-up of 4
randomized studies. Blood 2001; 98:3569-3574.

(126) Socie G, Stone JV, Wingard JR, Weisdorf D, Henslee-Downey PJ, Bredeson C et al.

Long-term survival and late deaths after allogeneic bone marrow transplantation. Late
Effects Working Committee of the International Bone Marrow Transplant Registry. N
Engl J Med 1999; 341:14-21.

(127) Sorror ML, Leisenring W, Deeg HJ, Martin PJ, Storb R. Twenty-year follow-up of a

controlled trial comparing a combination of methotrexate plus cyclosporine with
cyclosporine alone for prophylaxis of graft-versus-host disease in patients
administered HLA-identical marrow grafts for leukemia. Biol Blood Marrow Transplant
2005; 11:814-815.

(128) Storb RF, Champlin R, Riddell SR, Murata M, Bryant S, Warren EH. Non-

myeloablative transplants for malignant disease. Hematology (Am Soc Hematol Educ
Program ) 2001;375-391.

(129) Storek J, Gooley T, Siadak M, Bensinger WI, Maloney DG, Chauncey TR et al.

Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation may be associated with a high
risk of chronic graft-versus-host disease. Blood 1997; 90:4705-4709.

(130) Sullivan KM, Fefer A, Witherspoon R, Storb R, Buckner CD, Weiden P et al. Graft-

versus-leukemia in man: relationship of acute and chronic graft-versus-host disease
to relapse of acute leukemia following allogeneic bone marrow transplantation. Prog
Clin Biol Res 1987; 244:391-399.

(131) Sullivan KM, Witherspoon RP, Storb R, Deeg HJ, Dahlberg S, Sanders JE et al.

Alternating-day cyclosporine and prednisone for treatment of high-risk chronic graft-v-
host disease. Blood 1988; 72:555-561.

(132) Sykes M, Sachs DH. Mixed chimerism. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2001;

356:707-726.

(133) Sykes M, Spitzer TR. Non-myeloblative induction of mixed hematopoietic chimerism:

application to transplantation tolerance and hematologic malignancies in experimental
and clinical studies. Cancer Treat Res 2002; 110:79-99.

(134) Thiede C. Diagnostic chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation:

new methods and markers. Am J Pharmacogenomics 2004; 4:177-187.

(135) Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G. Evaluation of STR informativity for chimerism

testing--comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor
recipient pairs. Leukemia 2004; 18:248-254.

(136) Thiede C, Bornhauser M, Oelschlagel U, Brendel C, Leo R, Daxberger H et al.

Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after
allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification
of short tandem repeat-markers. Leukemia 2001; 15:293-302.

(137) Thiede C, Florek M, Bornhauser M, Ritter M, Mohr B, Brendel C et al. Rapid

quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat
markers and fluorescence detection. Bone Marrow Transplant 1999; 23:1055-1060.

(138) Toh HC, Spitzer TR, Preffer F, Alexander SI, McAfee S, Dombkowski D et al.

Fluctuating  lymphocyte  chimerism,  tolerance  and  anti-tumor  response  in  a  patient
with  refractory  lymphoma  receiving  nonmyeloablative  conditioning  and  a
haploidentical  related  allogeneic  bone  marrow  transplant.  Cytokines  Cell  Mol  Ther
2002; 7:43-47.

(139) Tsutsumi Y, Tanaka J, Kato N, Zhang L, Mori A, Kobayasi R et al. Analysis of mixed

chimerism in patients after allogeneic stem cell transplantation using a capillary
electrophoresis system. Acta Haematol 2002; 107:195-202.

(140) Umemura A, Morita H, Li XC, Tahan S, Monaco AP, Maki T. Dissociation of

hemopoietic chimerism and allograft tolerance after allogeneic bone marrow
transplantation. J Immunol 2001; 167:3043-3048.

(141) Uzunel M, Mattsson J, Jaksch M, Remberger M, Ringden O. The significance of graft-

versus-host disease and pretransplantation minimal residual disease status to
outcome after allogeneic stem cell transplantation in patients with acute lymphoblastic
leukemia. Blood 2001; 98:1982-1984.

(142) van Leeuwen JE, van Tol MJ, Joosten AM, Wijnen JT, Khan PM, Vossen JM. Mixed

T-lymphoid chimerism after allogeneic bone marrow transplantation for hematologic
malignancies of children is not correlated with relapse. Blood 1993; 82:1921-1928.

(143) van Leeuwen JE, van Tol MJ, Joosten AM, Wijnen JT, Verweij PJ, Khan PM et al.

Persistence of host-type hematopoiesis after allogeneic bone marrow transplantation
for leukemia is significantly related to the recipient's age and/or the conditioning
regimen, but it is not associated with an increased risk of relapse. Blood 1994;
83:3059-3067.

(144) van Rhee F, Szydlo RM, Hermans J, Devergie A, Frassoni F, Arcese W et al. Long-

term results after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myelogenous
leukemia in chronic phase: a report from the Chronic Leukemia Working Party of the
European Group for Blood and Marrow Transplantation. Bone Marrow Transplant
1997; 20:553-560.

(145) Wagner JL, Flowers ME, Longton G, Storb R, Schubert M, Sullivan KM. The

development of chronic graft-versus-host disease: an analysis of screening studies
and the impact of corticosteroid use at 100 days after transplantation. Bone Marrow
Transplant 1998; 22:139-146.

(146) Weinberg K, Blazar BR, Wagner JE, Agura E, Hill BJ, Smogorzewska M et al. Factors

affecting thymic function after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
Blood 2001; 97:1458-1466.

(147) Wekerle T. Transplantation tolerance induced by mixed chimerism. J Heart Lung

Transplant 2001; 20:816-823.

(148) Wingard JR, Piantadosi S, Vogelsang GB, Farmer ER, Jabs DA, Levin LS et al.

Predictors of death from chronic graft-versus-host disease after bone marrow
transplantation. Blood 1989; 74:1428-1435.

(149) Winiarski J, Gustafsson A, Wester D, Dalianis T. Follow-up of chimerism, including T-

and B-lymphocytes and granulocytes in children more than one year after allogeneic
bone marrow transplantation. Pediatr Transplant 2000; 4:132-139.

(150) Wren SM, Hronakes ML, Ildstad ST. CD4+ T cells, but not CD8+ T cells, mediate the

breaking of tolerance in mixed allogeneic chimeras (B10 + B10.BR-->B10).
Transplantation 1993; 55:1382-1389.

(151) Zaucha J, Gozdzik J, Wylegała E, Wojnar J, Balon J, Gil L et al. Rozpoznanie i

klasyfikacja przewlekłej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi - raport z
Warsztatów Transplantologicznych Falenty 2003 cz

ęść

I. Acta Haematol Pol 2004;

35:417-429.

(152) Zaucha J, Gozdzik J, Wylegała E, Wojnar J, Balon J, Gil L et al. Rozpoznanie i

klasyfikacja przewlekłej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi - raport z
Warsztatów Transplantologicznych Falenty 2003 cz

ęść

II. Acta Haematol Pol 2004;

35:431-443.

(153) Zaucha JM, Pawlowski R, Welz A, Prejzner W, Hauser R, Hellman A. [Evaluation of

bone marrow grafts and hemopoietic chimerism using PCR hypervariable sequencing
with variable number tandem repeat sequences]. Pol Tyg Lek 1995; 50:73-74.

(154) Zecca M, Prete A, Rondelli R, Lanino E, Balduzzi A, Messina C et al. Chronic graft-

versus-host disease in children: incidence, risk factors, and impact on outcome. Blood
2002; 100:1192-1200.