Biologia molekularna 
dla studentów II roku biologii 
Aleksandra Boguszewska 
Zakład biologii molekularnej p 7A 
godz. konsultacji piątek 12.00-14.00 

bogusz@hektor.umcs.lublin.pl

 

 
Tematy wykładów z biologii molekularnej 
- wprowadzenie do biologii molekularnej: definicja, historia: budowa i funkcja DNA, RNA: od 
genu do białka: dogmat biologii molekularnej, kod genetyczny, budowa białek 
- wybrane metody oczyszczania i analizy białek 
- organizacaj genomu: genom bakteryjny, genom eukariotyczny – jądrowy, chloroplastowy i 
mitochondrialny, eukariotyczne wirusy DNA i wirusy RNA: 
- Ekspresja genów: transkrypcja, dojrzewanie RNA, transport przez błonę jądrową, translacja, 
fałdowanie i degradacja białek, regulacja ekspresji genów: 
- cykl komórkowy i jego regulacja 
- apoptoza 
- biologia molekularna w medycynie: choroby mitochondrialne i nowotworowe, przeciwciała jako 
narzędzie w biologii molekularnej i wspólczesnej medycynie. 
 
Tematy ćwiczeń z Biologii Molekularnej 
dla II roku Biologii 
 
- zapoznanie z pracownią biologii molekularnej, przepisy BHP, obliczenia biochemiczne  
- charakteystyka chemiczna kwasów nukleinowych 
- izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cervisiae 
- amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B drożdży Saccharomyces cervisiae 
- 5-6 transfer genów do komórek ssaczych – transfekcja, obserwacje w mikroskopie konfokalnym 
(wykł 10 marca obecność obowiązkowa, 17-18 marca ćw ½ gr, 24-25 marca – ćw. druga ½ gr.) 
- izolacja RNA z komórek drożdży 
- elektroforetyczna analiza RNA 
- transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych 
- cykl życiowy drożdży Saccharomyces cervisiae – koniugacja 
- cykl życiowy drożdży Saccharomyces cervisiae – sporulacja 
- 11 a. badanie wplywu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych 
- cykl życiowy drożdży S. cervisiae – otrzymanie pokolenia haploidalnego drożdży po sporulacji 
- wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych 
- identyfikacja inhibitora trombiny metodą eletroforezy w warunkach niedenaturujacych 
 
Podręczniki: 
- Biologia molekularna, krótkie wykłady, wyd 3 – P. Turner i in., PWN, 2011 
- Podstawy biologii molekularnej – L.A. Wilson, WUW, 2009; 
- Genomy, wyd 2 – T.A. Brown, PWN, 2009 
 
- Nature; Cell; Trends in Biochemical Sciences (TiBDS); Postępy Biochemii. 
 

Historia biologii molekularnej 
 
384 – 322 p.n.e. - Arystoteles ogłasza teorię pangenezy (cechy dziedziczne są zawarte i 
przenoszone w gemulach z poszczególnych komórek ciała) 
 
1866 r. - G. Mendel (ojciec wspólczesnej genetyki) publikuje swoją pracę na temat dziedziczenia 
cech u grochu 
 
1869 r – F. Miescher izoluje bogatą w fosfor substancję zwaną „nukleiną” z jąder krwinek białych 
 
1875 r. - E.Strasburger opisuje twory, zwane później chromosomami 
 
1929 r. - P.A. Levene charakteryzuje i nazywa kwas rybonukleinowy i kwas 
deoksyrubonukleinowy  
 
1938 r – pojawia się wiele badań nad bialkami i DNA z wykorzystaniem krystalografii 
rentgenowskiej, W. Weaver proponuje termin biologia molekularna; 
 
1950 r. - E. Chargaff pokazuje że ilości zasad T i A oraz C i G w DNA są równe; 
 
1952 r – A. Hershey i M. Chase wykorzystują badania nad bakteriofagiem T2, by potwierdzić że 
DNA jest nośnikiem informacji genetycznej 
 
1952 r – Maurice Wilkins i Rosalind Franklin, wykorzystując krystalografię rentge nowską, 
wyjaśniają, że w DNA znajdują się struktury powtarzające się 
 
1953 r – Francis Crick i James Watson prezentują DNA jako helisę złożoną z dwóch nici 
powiązanych wiązaniami wodorowymi 
 
DNA jest materiałem genetycznym; każdy chromosom jest pojednynczą cząsteczką DNA; geny 
są fragmentami sekwencji DNA. 
 
Biologia molekularna 
 
Nauka podstawowa zajmująca się badaniem struktury i funkcji makromolekul, przede wszystkim 
białek i kwasów nukleinowych. Zazębia się ona z takimi dziedzinami wiedzy jak genetyka, 
biochemi, biofizyka czy cytologia. 
Wiliam Astbury w „Nature” (1961) opisał, że biologia molekularna: „(…) jest szczególnie 
zainteresowana formami biologicznych cząsteczek, ich trójwymiarową strukturą, genezą i ich 
funkcjonowaniem”. 
 
DNA jest polimerem zbudowanym z powtarzających się jednostek zwanych nukleotydami (dNTP:) 
dATP, dGTP, dCTP, dTTP 
 
Długość komórkowych cząst. DNA może sięgać kilkaset milionów nukleotydów, długość 
dwuniciowej cząst. DNA wyraża się liczbą par zasad (pz) – kilo par zasad (kpz) lub milion pz 

(mpz). W laboratoriach często wykorzystuje się krótkie łańcuchy jednoniciowego DNA, zazwyczaj 
krótsze niż 50 nt, określane mianem oligonukleotydów 
 
dNTP 
deoxyribonucleotide triphosphate - deoksyrybonukleotydotrifosforan 
do deoksyrobozy dołączona zasada azotowa (base) – A, T, G, C - w pierwszym węglu, w piątym 
trifosforan, w trzecim OH. 
 
Formy przedstawienia podwójnej helisy DNA 
A – w środku os, na zewnatrz szkielet fosfocukrowy, do środka zasady połączone wiązaniami 
wodorowymi 
 
B – widoczne jest ulożenie warstwowe zasad w podwójnej helisie DNA, na zewnątrz szkielet 
fosfocukrowy 
 
C – forma wstęgowa – szkielet fosfocurkowy w postaci podwojnej wstęgi, pomiędzy nimi łączą się 
wiązaniami wodorowymi komplementarne zasady A i T, C i G, tworzą się duży rowek  i mały 
rowek. 
 
Formy dwuniciowej helisy DNA 
 
 

 

 

A- DNA 

 

B-DNA 

 

 

Z-DNA 

Kierunek skrętu 

Prawoskrętna  

Prawoskrętna  

 

Lewoskrętna 

Duży rowek   

Głęboki i wąski 

Średnio glęboki, szeroki 

Płytki, w zasadzie  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

nieobecny 

Mały rowek   

Płytki i szeroki 

Średnio glęboki, wąski 

Bardzo głęboki, wąski 

Liczba par zasad na 
pełny obrot helisy 

11 

 

 

10,5   

 

 

12 

 
Dwuniciowa cząsteczka DNA może podlegać odwracalnemu rozpleceniu do pojedycznych nici  
Natywny DNA (podwójna helisa) – podgrzanie, OH-, formamid → Zdenaturowany DNA 
(Statystyczny kłębek)  
Temperatura topnienia (Tm) DNA – to taka temp., przy której 50% podwójnej helisy DNA jest 
rozpleciona do pojedynczych nici  
 
DNA w sztuce – bio art. 
Malowanie chromosomu, podwójnej helisy, srebry łańcuszek na cześć zmarłej na białaczkę 
Rosalind Franklin. 
 
Budowa RNA 
 
Cząsteczka RNA jest liniowym polimerem zbudowanym z nukleotydów połączonych ze sobą 
wiązaniami fosfodiestrowymi 
 
DNA – cząsteczka dwuniciowa, występujące zasady 
C – cytozyna 

G – guanina 
A – adenina 
T – tymina 
Deoksyryboza – wodór w pozycji 2'  
 
RNA – cząsteczka jednoniciowa, występujące zasady 
C – cytozyna 
G- guanina 
A- adenina 
U - uracyl 
Ryboza – OH w pozycji 2' 
 
Struktury drugorzędowe RNA 
 
Drugorzędowa struktura RNA charakteryzuje się obecnością podwójnej helisy typu A oraz 
jednoniciowych pętli, które można podzielić na: 
struktury spinki do włosów (ang. hairpins) 
wybrzuszenia (ang. bulges) 
pętle wewnętrzna (ang. internal loop) 
połączenia (ang. junctions) 
 
Rodzaje par zasad zidentyfikowane w dwuniciowych helisach RNA  
 
Kanoniczne pary zasad typu Watson-Crick: AU; GC 
 
Niekanoniczne pary zasad (ponad 20 różnych typów), najczęściej spotykane to: 
GU (ang. wobble GU); GA (ang. sheared, po polsku tzw. nożycowa) 
 
Oddziałujące trójki zasad w RNA 
Trójki zasad mają zwykle praę oddziałującą w sposób klasyczny, zgodnie z zasadami par typu 
Watson-Crick a trzecia zasada oddziałuje wieloma różnymi, niekonwencjonalnymi sposobami,  
 
Niekanoniczne pary oraz trójki zasad są ważnymi elementami procesow zwijania się RNA i 
oddzialywań RNA-białko i RNA-ligand. 
 
Motywy struktury trzeciorzędowej RNA 
 
„cząsteczka tRNA wygląda tak, jakby Natura chciala zmusić cząsteczki RNA do wykonywania 
zadań przeznaczonych dla bialek” - F. Crick (1966) 
 
Zidentyfikowano liczne, bardzo zachowawcze i złożone motywy strukturalne RNA, 
m.in. pseudowęzły, zwroty K 
 
Rodzaje i funkcje RNA w komórce 
Cały RNA: 
-kodujący (4%) 

RNA kodujący – pre-mRNA (hnRNA, heterogenny nuklearny RNA) – kom eukariotyczne -
>mRNA 
- niekodujący (96%) 
pre-rRNA → rRNA 
pre-tRNA → tRNA 
w komórkach eukariotycznych występują także  
snRNA, - small nuclear RNA, potrzeby do dojrzewania mRNA 
snoRNA – mały jąderkowy RNA, potrzebny do dojrzewania rRNA  
scRNA – mały cytoplazmatyczny RNA, np. siRNA, mikroRNA 
w komórkach bakteryjnych występuje także: 
tmRNA – RNA trochę jak tRNA, a trochę jak mRNA 
 
Większość RNA występuje w kompleksach RNA-białko zwanych cząstkami 
rybonukleoproteinowymi (RNP) 
 
Komórka bakteryjna zawiera 0,05 – 0,1 pg RNA co stanowi ok. 6% jej masy 
 
Komórka ssaków jako większa zawiera 20-30 pg RNA. 
 
Funkcje RNA w komórce 
 
- RNA może służyć jako „rusztowanie” na którym osadzają się białka, np. cząstka sygnałowa 
SRP; 
 
- oddziaływania RNA-białko mogą wpływać na aktywność katalityvzną białek, np. telomeraza. 
- krótkie cząsteczki RNA mogą bezpośrednio kontrolować ekspresję genów, np. 
ryboprzełączniki, RNA związane z interferencją RNA (RNAi); 
 
- RNA może być materiałem dziedzicznym, np. wirusy RNA 
 
- RNA może być katalizatorem reakcji chemicznych, tzw, rybozymy. 
 
Katalityczne RNA – rybozymy 
 
Samowycinające się introny – introny grupy I i II 
 
Rybonukleaza P – enzym który wytwarza końce 5' bakteryjnych tRNA składa się z podjednostek 
RNA i podjednostek białkowych, przy czym aktywnośc katalityczną ma RNA  
 
RNA rybosomowy – aktywność transferazy pepdtydylowej potrzebna do wytworzenia wiązania 
peptydowego w czasie syntezy białka jest związana z dużym 
 rRNA 
 
Spliceosom – kompleks rybonukleoproteinowy biorący udział w splicingu pre-mRNA 
 
Genomy wirusowe – podczas replikacji genomów RNA niektórych wirusów następuje 

autokatalityczne przecięcie łańcuchow nowo zsyntetyzowanych genomów. Przykładem są wiroidy 
roślinne (rybozymu typu: hammerhead, hairpin), wirusoidy i zwierzęcy wirus zapalenia wątroby 
delta (HDV) 
 
1958 – Sformułowanie centralnego dogmatu biologii molekularnej przez Francisa Cricka 
 
Central Dogma of Molecular Biology by Francis Crick 
The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue -by-residue transfer of 
sequential information.  
Informacja genetyczna, która zawarta jest w DNA w większości przypadków przenoszona jest z 
DNA na DNA w procesie replikacji, następnie z DNA na RNA w procesie transkrypcji i z RNA na 
białko w procesie translacji (biosyntezy białka) 
 
General 

Special  

Unknown 

DNA-DNA 

RNA-DNA 

Protein-DNA 

DNA-RNA 

RNA-RNA 

Protein-RNA 

RNA-Protein DNA-Protein Protein-Protein 
 
Podstawowy przepływ informacji w komórce 
 
DNA → (transkrypcja) → RNA → (translacja) → Białko 
DNA i RNA stanowią genotyp - „język nukleotydów” 
Białko stanowi o fenotypie - „język aminokwasów” 
Rybosom pełni funkcję „tłumacza” genotypu na fenotyp 
 
Informacja genetyczna zawarta jest w DNA w poszczególnych genach. 
Gen – fragment funkcjonalny cząsteczki DNA kodujący białko bądź funkcjonalną cząsteczkę 
RNA. 
Geny nawinięte na chromosom. 
 
Kod genetyczny 
Mamy podwójną helisę DNA która ma ulec transkrypcji, musi ona ulec rozpleceniu, na jednej z 
nici syntetyzuje się RNA, jeżeli ma potem powstać z tego bialko to mRNA, trzy kolejne 
nukleotydy w mRNA stanowią kodon – są one tłumaczone na jeden aminokwas, synteza lańcucha 
aminokwasowego – powstaje białko, fałduje się. 
 
Kod genetyczny jest trójkowy 
 
61 kodonów koduje 20 podstawowych aminokwasów (ogólnie w komórce występuje 100 
aminokwasów powstających na drodze modyfikacji podstawowych0 – kod jest zdegenerowany – 
kilka kodonów – kilka kodonow może kodowac ten sam aminokwas 
 
Tylko metionina jest kodowana przez jeden kodon – AUG – kodon start. 
 
Inne aminokwasy 2-6 kodonów. 
 

Sekwencja stop – 3 kodony. 
 
Kodon jest także jednoznaczny – dany kodon koduje tylko jeden aminokwas. 
 
Długo mówiono, że jest uniwersalny, ale teraz nie do końca – prawie te same trójki kodują te 
same aminokwasy, ale występują drobne różnicy – trochę inaczej u niższych zwierząt. 
 
21 i 22 aminokwas w białkach 
 
UGA Stop – selenocysteina (prokariota i eukariota, z wyjątkim drożdży i roślin) 
 
UAG Stop – pirolizyna (archeony i bakterie) 
 
Białka  
Polimery składające się z 'cegiełek' aminokwasów, połączonych wiązaniami peptydowymi.  
Początek białka ma (N-koniec) wolną grupę aminową, koniec białka (C-koniec) wolną grupę 
karboksylową, z boku łańcuchy boczne. 
 
Opis cząteczki 

 

Wygląd cząteczki 

 

 

Liczba aminokwasów 

 
Peptydy 

 

krótki łańcuch  aminokwasowy 

do 100 

 
Poziomy organizacji cząteczki białka 
 
Struktura pierwszorzędowa – sekwencja, czyli kolejność ułożenia aminokwasów 
 
Drugorzędowa – alfa helisa, beta kartka 
 
Struktura trzeciorzędowa – wzajemne przestrzenne ułożenie fragmentów struktury drugorzędowej 
 
Struktura czwartorzędowa – wzajemne przestrzenne ułożenie łańcuchów  polipeptydowych. 
 
Tylko białka zawierające więcej niż jedną podjednostkę mają strukturę czwartorzędową!!! 
 
(a) Collagen 
włókienko splecione z kilku łańcuchów polipeptydowych 
 
Denaturacja – renaturacja białka 
W wyniku denaturacji zniszczeniu ulega struktura 2, 3, 4-rzędowa, zostaje pierwszo. 
 
Native form → (denaturation) → białko zdenaturowane → (refolding) → native form 
 
Sposoby prezentacji struktury atomowej białka 
- str. szkieletowa – sam szkielet białka, bez wiązań bocznych 
- str. wstążkowa – za pomocą wstążek i strzałek ukazane są alfa helisy i beta kartki – strzałki 
pokazują nam kierunek białka 

- str. chemiczna – pokazane wiązania 
- str. powierchniowa – kuleczkowa struktura 
 
n-koniec niebieski, c- czerwony 
 
Wybrane metody oczyszczania i analizy białek 
 
„Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that 
order” - Sydney Brenner 
 
Analiza białek pozwala odpowiedzieć na wiele ważnych biologicznie pytać dotyczących badanego 
białka: 
- jaka jest całkowita ilość badanego białka w komórce, a jaki jest poziom syntezy w 
poszczegolnych typach komórek; 
- jaka jest subkomórkowa lokalizacja badanego białka (np. jądrowa, błonowa, mitochondrialna 
itd.); 
- czy białko ulega translokacji w odpowiedzi na pewne warunki; 
- czy białko ulega modyfikacjom postranslacyjnym i jak wplywają one na funkcje białka; 
- czy poziom danego białka w komórce jest rgulowany przez szok cieplny, hormony, czynniki 
wzrostowe; 
- jaka jest funkcja badanego białka w komórce; 
- z jakimi innymi bialkami oddziałuje badane białko; 
- czy poziom białka w komórce zmienia się u chorych osobników. 
 
Wybór analizowanego białka 
 
Wybór źródła badanego białka 
- naturalne 
- nadekspresja 
Ułatwia oczyszczanie 
Umożliwia otrzymanie dużych ilości białka 
 
- Analizy biochemiczne (badanie aktywności enzymatycznej, stabilności, interakcji białko -białko, 
białko-DNA) 
- Analizy strukturalne (krystalizacja, NMR) 
- Otrzymanie przeciwciał 
 
Hodowle komórkowe 
- komórki drożdżowe 
hodowle drożdżowe są tańsze, łatwiejsze do przeprowadzenia. Można otrzymywać kolonie 
drożdżowe na plytkach agarowych lub w pożywkach plynych na odpowiednich wytrzasarkach w 
odpowiedniej temperaturze 
- komórki ssacze tzw. linie komórkowe 
Szalki w podłożu płynnym w odpowiednich inkubatorach zapewniających temperaturę i dwutlenek 
węgla;bądź duże naczynia hodowlane 
Wyższe wymogi sterylności, aby nam się nie zakaziło. 

Metody dezintegracji komórek/lizy komórek 
- mechaniczne 
* homogenizacja 
* młyn kulkowy 
- nie-mechaniczne 
* fizyczne (sonikacja, mrożenie/odmrażanie) 
* chemiczne (detergenty, rozpuszczalniki) 
* enzymatyczne (lizozym, litykaza) 
 
Dezintegracja komórek 
- moździerz ceramiczny 
- homogenizator szklano-teflonowy (rurka, do niej roztwor komórkowy, tłok chodzi w górę i w 
dół, rozbja komorki, pomagają w tym czynniki chemiczne zawarte w roztworze)  
- homogenizator ultradźwiękowy – zawiesina komórek, wkładamy pręt ultradźwiękowy, niszczy się 
integrację komórek 
 
Frakcjonowanie komórek poprzez wirowanie różnicowe 
Homogenat wirujemy (1500g – 10 min.) 
- osad I (całe komórki, pozostałości komórek, jądra) 
- supernatant I wirujemy (30000 g – 20 min) 
* osad II (mitochondria, lizosomy, peroksysomy) 
* supernatant II wirujemy (100000g – 2 godz) 
# osad III (mikrosomy) 
# supernatant III (białka cytoplazmatyczne) 
 
Przed wirowaniem – cząsteczki zawieszone w roztworze → wirowanie za pomocą szybko 
obracającego się rotora kątowego – po wirowaniu na górze supernatant, osad osiada na dole. 
 
Wirowanie w gradiencie gęstości 
Do probówki wirówkowej nalewany roztwór sacharozy – bliżej dna gęsciejszą sacharozę  – 20%, 
bliżej wierzchu 5% sacharozy, rzadzsza, gradient gęstości – na górze nanosimy próbkę – wirujemy 
w rotorze w którym probówki są ustawione poziomo, w wyniku działania siły odśrodkowej 
rozdziela się mieszanina w gradiencie sacharozy  – z inicjalnego nanosu powstają oddzielone 
frakcje 
małe cząsteczki na wierzchu, średnie cząsteczki w środku, duże cząsteczki na dnie 
 
Wysalanie białek  
Mamy płaszcz wodny przykrywający białko 
Wraz ze zwiększeniem koncentracji soli do pewnego momentu rozpuszczalnosc białek rośnie 
(nasycanie roztworu solą) – tworzy się płaszcz hydratacyjny i rozpuszcza się lepiej 
Tak się dzieje tylko do pewnego momentu, po dodaniu kolejnej porcji soli rozpuszczalnosc 
gwałtownie spada i białko wytrąca (wysala się) z roztworu. 
 
Dializa białek – przechodzenie przez błony półprzepuszczalne cząsteczek rozpuszczalnika i 
innych małych cząsteczek, którymi zanieczyszczany jest roztwór białka. 
 

Początek dializy 
Stężony roztwór (białka + zanieczyszczenia) umieszczamy w półprzepuszczalnym woreczku 
dializacyjnym i umieszczamy w zlewce z rozpuszczalnikiem, zostawiamy na kilka godzin. 
 
Po ustaleniu równowagi 
Z woreczka dializacyjnego przeszła połowa zanieczyszczeń, po wymiani rozpuszczalnika proces 
powtarza się 
Oczyszczanie białek metodą chromatografii cieczowej 
Mieszanina białek (np. frakcja cytoplazmatyczna)  – nanosimy ja na odpowiedni złoże 
chromatograficzne, które znajduje się w odpowiedniej kolumnie, na dole kolumy otwór, na górze 
próbka → u gorze podłączamy rozpuszczalnik, na dole probówkę, nasz roztwór wędruje przez 
złoże, rozdziela się, po kolei do próbówek zbieramy różne frakcje zawierające rozdzielone białka. 
 
Wykres chromatograficzny 
na osi x poszczególne probówki do których zbieramy białka, na y absorbancja 
nic – potem ścieka białko jeden – nic – potem ścieka białko dwa –  pik wskazuje na białko – pik 
wskazuje nam na rodzaj białka. 
To z automatycznych, zmaszynowanych chromatografów. 
Różne rodzaje chromatografii cieczowej 
 
Rozdział białek ze względu na: 
- rozmiar – filtracja żelowa (sito molekularne) 
- ładunek – chromatografia jonowymienna 
- hydrofobowość – chromatografia oddziaływań hydrofobowych 
- powinowactwo – chromatografia powinowactwa 
 
Filtracja żelowa  
W kolumnie mamy kolumnę wypełnioną złożem chromatograficznym  – kuleczkami agarozowymi, 
które mają określoną wielkość porów  
Na takie złoże chromatograficzne nakladamy mieszaninę dużych i małych białek 
Podłączamy rozpuszczalnik, u dole kranik, białka przechodza przez kolumnę i się rozdzielają  
Najpierw białka duże, małe potem, najmniejsze najpóźniej. 
Białka duże nie są zatrzymywane przez pory bo się w nich nie mieszczą, przenikajś więc między 
kuleczkami złoża i idzie im szybciej, 
białka małe przenikają przez pory w złożu (wchodza do kuleczki i muszą potem znaleźć z niej 
wyjście) – więc schodzi im dłużej. 
 
Chromatografia powinowactwa 
W chromatografii powinowactwa wykorzystujemy powinowactwo białka do złoża 
chromatograficznego 
Mamy złoże chromatograficzne, oraz mieszanine białek o różnej strukturze. 
Tylko jedno białko ma powinowactwo do złoża (łączy się ze złożem) 
Nanosimy mieszaninę białek – jedne białka łączą się ze złożem, reszta nie – przepłukujemy 
rozpuszczalnikiem (płukanie) – z kolumny wypadają wszystkie białka, które nie łączyły się ze 
złożem, jeden rodzaj białek został.  
 

Wykres chromatograficzny 
- najpierw absorbancja zero po tym jak nałożyliśmy tylko mieszaninę, 
płuczemy – absorbancja rośnie – płuczemy aż znowu nie spadnie (aż nie wypłuczemy całego 
białka i będzie leciał sam rozpuszczalnik) 
- stosujemy wtedy drugi rozpuszczalnik który sprawia że wydzielone białko odczepia się od złoże 
i wyletuje też – pik numer dwa ostrzejszy znowu płuczemy aż nie spadnie (krócej) 
 
Możemy potem wysolić wypłukane białko z rozpsuzczalnika, którego użylismy do wymycia białka 
ze złoża. 
 
Ilościowe oznaczenie białka wbadanych frakcjach komórkowych 
 
Metody spektrofotometryczne – Metoda Whitakera i Granuma 
 
C białka (mg/ml) = (A235 – A280)/2,51 
 
Metody kolorymetryczne – Metoda Bradford 
Zabarwienie kompleksu proporcjonalne do stężenia białka 
Białko + kumasi → kompleks barwy niebieskiej mierzy się spekrofotometrycznie przy 595 nm.  
Trzeba zrobić krzywą wzorcową → tworzymy kompleksy białko-barwnik o znanym stężeniu → 
wiemy wtedy że dane stężenie białka odpowiada danej absorbancji, następnie odczytujemy z niej 
stężenia w próbie badanej 
(równanie prostej można też obliczyć) 
 
Elektroforeza żelowa białek 
 
- Metoda ta umożliwia monitorowanie składu mieszaniny białek, sprawdzanie czystości białek, 
oznaczanie masy cząsteczkowej, analizy struktury podjednostkowej, określenie punktu 
izoelektrycznego białka 
- W analizie białek stosowane są żele poliakrylamidowe (dobra rozdzielczość, duża wytrzymałość 
mechaniczna) 
- Elektroforeza w żelu poliakryamidowym umożliwia rozdział cząsteczek białkowych różniących 
się wielkością i ładunkiem elektrycznym; 
- Rozdział może być jednokierunkowy (1D) – lub dwukierunkowy (2D) 
 
Analiza białka elektroforezy jednokierunkowej w warunkach denaturujących (SDS/PAGE)  
 
Elektroforeza pionowa 
próbki dodajemy za pomocą pipety automatycznej do studzienek 
- wierzch - (katoda), dno + (anoda), białka idą z – do + 
 
Do roztworu białka dodawany jest 
DTT 
SDS 
barwnik 
 

SDS – skladnik detergentów i środków myjących; ma on ujemny ładunek, przykrywa białka i 
maskuje ich ładunek, dzięki czemu wszystkie są ujemne i wędruja do anody. 
DTT – substancja o zapachu zgniłych jaj, zawiera grupy -SH, niszczy mostki siarczkowe 
pomiędzy podjednostkami białka dzięki czemu każda podjednostka wędruje w żelu oddzielnie  
Barwnik – najczęściej niebieski 
 
Żel ma różne wielkości porów, z zależności od tego jakie bialka chce się zatrzymać.  
- mniejsze białka zatrzymują się niżej 
- większe wyżej 
- największe najwyżej 
Rozdzielamy białka pod względem ich masy. 
 
Ile jednostek ma białko, tyle prążków widzimy po wybarwieniu. 
 
Barwienie białek w żelu poliakrylamidowym. 
 
Barwienie barwnikiem Coomassie Blue 
zwykle powyżej 25 ng/prążek 
barwienie fioletowe – prązki to poszczególne polipeptydy 
Porównujemy z prązkami wzorcowymi, o znanej masie, porównujemy i okreslamy jaką masę ma 
nasze białko. 
 
Barwienie srebrem (teoretycznie bardziej czuła, ale to zależy od białka)  
ok 0,5ng/prążek 
Prążki są wtedy żółtobrązowe 
 
Barwienie cynkiem 
Nie wybarwiamy prążków białkowych, tylko wybarwia nam się tło – żel robi się mleczny i tylko te 
miejsca gdzie są prążki są przezroczyste 
czulość od 4000 – 0,25 ng/prążek 
 
Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym 
dwa protokoły – szybki i podstawowy 
metoda bardzo czuła i uniwersalna, ale drogie barwniki, konieczna aparatura dodatkowa.  
 
Barwienie glikoprotein 
Blue Stain (Coomassie) – barwimy wszystko 
Glycoprotein stain – barwimy tylko glikoproteiny 
 
Barwienie fosfobiałek 
Blue Stain (coomassie)- barwimy wszystko 
Phosphoprotein stain – barwimy tylko białko posiadające grupę fosforanową (fosfobiałka); metoda 
czulsza niż coomassie i specyficzniejsza 
Coomassie nie barwi wszystkiego. 
 
Analiza białek metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF) 

 
punkt izoelektryczny (pI) – pH w którym cząsteczka ma zerowy ładunek sumaryczny, oznaczany 
przy pomocy programu komputerowego dla białek o znanej sekwencji, lub empirycznie.  
 
Jeżeli żel podłączymy z jednej strony do katody (-) i anody (+) to wytworzy nam się gradient pH 
odpowiednio od pH 10,0 do pH 3,0 – białka w mieszaninie wędruja tak dlugo, aż osiągną pH 
które odpowiada ich punktowi izoelektrycznemu – mają wtedy zerowy ładunek sumaryczny i 
przestają się poruszać w polu elektrycznym 
Rozdzielają i ustawiają się więc zgodnie z rosnącym pI od anody do katody, a nie względem masy.  
 
Ogniskowanie izoelektryczne 
Zestawienie rozdzielczości SDS/PAGE – mamy jeden prążek, wykonujemy dla niego elektroforezę 
IEF – otrzymujemy osiem prążków w rozpiętości pH od 5,0 do 3,5 – są to białka rybosomalne o 
prawie takiej samej masie cząsteczkowym lecz innym pI. 
 
Analiza białek metodą elektroforezy dwukierunkowej (2D) 
Pierwszy kierunek – IEF 
długie cienkie paseczki ustawiające się w gradiencie pH  
Drugi kierunek – SDS/PAGE – rozdzielone już białka pod względem punktu izoelektrycznego 
kieruje się do elektroforezy SDS/PAGE gdzie ustawiaja się dodatkowo względem masy.  
 
Następnie barwimy barwnikiem Coomassie Blue lub srebrem 
- zamiast prążków widzimy kropeczki 
jeden wymiar żelu to gradient pH a drugi wymiar żelu to gradient masy. 
 
Sekwencjonowanie białek – ustalenie kolejności aminokwasów w łańcuchu peptydowym 
W 1953r F. Sanger jako pierwszy zsekwencjonował białko (łańcuchy insuliny) 
Sekwencję białka możemy poznać 
- poprzez sekwencjonowanie łańcucha peptydowego; 
- poprzez sekwencjonowanie DNA odpowiedniego genu (lub cDNA), a nstępnie ustalenie 
sekwencji białka na podstawie kodu genetycznego. 
 
Metody sekwencjonowanie/identyfikacji białek: 
- chemiczne (degradacja Edmana) 
- spektrometria mas 
 
Etapy analizy sekwencji białka 
Roztwór białka/mieszaniny białek 
- 2D; SDS/PAGE; IEF → trawienie proteolityczne w żelu → rozdział chromatograficzny 
peptydów lub spektrometria mas (MALDI TOF MS) lub spektrometria mas (LC-MS/MS) → 
degradacja Edmana lub spektrometria mas (MALDI TOF MS) 
- trawienie proteolityczne – spektrometria mas (LC-MS/MS) 
 
W celu ustalenia sekwencji dlugiego polipeptydu należy go rozciąć na krótsze peptydy składające 
się z 20-50 reszt, które po rozdzieleniu poddaje się sekwencjonowaniu. Specyficzne pocięcie 
polipeptydu można osiągnąć metodami chemicznymi  np. bromocyjanu (BrCN), który rozrywa 

wiązanie peptydowe utworzone przez grupę karboksylową metioniny 
 
Cyanogen bromide cleavage 
lub enzymatycznymi 
 
 
np. przy udziale trypsyny która rozcina łańcuch polipeptydowy po karboksylowej stronie reszt 
aminokwasów zasadowych (Lys, Arg), lub chymotrypsyny, rozdzinającej łncuch polipeptydowy po 
karboksylowej stronie reszta aminokwasów aromatycznych (Phe, Tyr, Trp). 
 
Peptydy otrzymane w wyniku specyficznej hydrolizy rozdziela się chromatograficznie i oznacza 
sekwencję każdego z oczyszczonych peptydow techniką degradacji Edmana. 
 
Degradacja Edmana 
Znakowanie peptydu którego sekwencję chcemy ustalić związkiem fenyloizotiocyjanianem 
W środowisku zasadowym przyłącza się do pierwszego aminokwasu z N -końca polipeptydu – 
mamy fenylotiokarbamylową pochodną peptydu – w środowisku kwaśnym fenylotiocyjanian + 
aminokwas z N-końca odłączają się – powstaje fenylotiohydantaionowa (PTH) pochodna N-
końcowego aminokwasu, i polipeptyd (N-1)- cykl powtarzamy 
 
Kolejność ułożenia peptydów w polipeptydzie możemy wyjaśnić na podstawie tak zwanych 
nakładających się peptydów 
peptydy trypsynowe   

peptyd chymotrypsynowy 

Ala-Gly-Trp-Gly-Lys 

 

Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp 

Asn-Val-Lys 
 
peptydy trypsynowe nakładają się na peptyd chymotrypsynowy: 
 
peptydy trypsynowe 
Asn-Val-Lys Ala-Gly-Trp-Gly-Lys  
peptyd chymotrypsynowy 
Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp-Gly-Lys 
 
Spektrometria mas – techniki polegające na jonizacji badanej substancji, a następnie analizie 
utworzonych produktów ze względu na ich masę i ładunek. 
 
Analizowana substancja → jonizacja badane substancji w jonizatorze → rozdział jonów o różnym 
stosunku masy do ładunku (m/z) w analizatorze m/z → rejestracja danych w syste mie rejestracji 
danych (detektorze) 
 
Wynik: widmo masowe. 
 
Metoda „odcisku palca” mapy peptydowej 
(PMF, ang. peptide mass fingertprinting) 
 
Eksperyment: mamy białko → trawienie do mapy peptydowej → spektrometria mas daje nam listę 

mas – porównujemy z teoretyczną lista mas poszczególnych mas dla różnych białek w programie 
komputerowym 
 
Program komputerowy: baza danych sekwencji danych → trawienie teoretyczne do wirutalnej 
mapy peptydowej → symulacja spektrometrii mas → otrzymujemy hipotetyczne listy mas dla 
poszczególnych białek. 
 
Różnice w metodach sekwencjonowania 
Degradacja Edmana 
chemiczne usuwanie aminokwasów z N-końca peptydu (1 aa/ na cykl) i określenie sekwencji 
białka od N-końca (analiza chromatograficzna PTH pochodnych aminokwasów) 
>~50 pmol polipeptydu 
 
Spektrometria mas 
umożliwia niezwykle dokładne pomiary mas polipeptydów co z kolei pozwala na identyfikację 
peptydów poprzez wyszukiwanie w bazie danych, białek zawierających peptydy o takiej samej 
masie 
>~50 fmol [femtomol] polipeptydu (lC MS/MS) 
 
To, czego nie można dowieść metodami biochemicznymi, można teraz po prostu zobaczyć, 
czyli... 
przyżyciowa analiza procesów biologicznych metodą mikroskopii konfokalnej 
 
Obraz w mikroskopie konfokalnym uzyskiwany jest poprzez skanowanie preparatu wiązką lase ra, 
która wzbudza fluorescencję barwnika 
 
Zalety: 
- otrzymywanie obrazów o większej rozdzielczości i lepszym kontraście  
- uzyskanie trójwymiarowego obrazu 
- jednoczesna rejestracja kilku barwników 
 
Białko GFP (Green Fluorescent Protein) z meduzy Aequorea victoria (nagroda Nobla 2008), 
białko z meduzy 
 
po wzbudzeniu go światłem o długości 395 nm emituje światło zielone o długości 509 nm 
 
jest to bialko beczułkowe, beczułki tworzą beta-harmonijki, w środku mamy fluorofor czyli to co 
fluoryzuje 
 
następnie z teog białka Roger Tsien otrzymal pochodne świecące różnymi barwami 
- możemy otrzymać świecąc bakterie, króliki. 
 
Musimy otrzymać konstrukt genetyczny zawierający sekwencję badanego białka (np. Beta-
aktyny) i sekwencję fluorescencyjnego białka 
mieszamy to z liposomowym czynnikiem transfekcji (przenoszenia obcych genów do komórki), 
inkubujemy przez trzydzieści minut 

plazmidy tworzą kompleks z kationowymi liposomami – tworzą się lipopleksy 
dodajemy to do komórek ssaczych, inkubujemy. 
 
Dodajemy utworzonego DNA do komórki ssaczej – ono przenika do jądra, ulega transkrypcji do 
mRNA, mRNA wędruje do cytoplazmy – ulega translacji – powstaje nam białko badane związane z 
białkiem fluorescencyjnym – powstaje świecący szkielet aktynowy 
 
FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer lub Foerster Resonance Energy Transfer) 
- metoda badania interakcji między białkami 
 
- Zasada tej metody opiera się na istnieniu transferu energii między dwiema fluorescencyjnymi 
cząsteczkami. 
 
- Jeśli dwa białka są fluoroforami to wzbudzenie fluorescencji pierwszego z nich (donor) prowadzi 
do pobudzenia drugiego (akceptor) 
 
Warunki aby doszło do transferu 
- nakładające się widmo emisji donora i wzbudzenia akceptora 
- odległości między nimi rzędu 1-10 nm 
 
Przypadek 1 
Białka A i B są badane. Do A doczepiono białko fluorescencyjne emitujące barwę zieloną, a do 
białka B emitujące barwę żółtą 
- widma nakłądają się, ale odległości między nimi nie są rzędu 1-10 nm 
po wzbudzeniu donora światłem 405/440 nm widzimy emisje tylko donora światłem 475 nm. 
 
Jeżeli odległość jest rzędu 1-10 nm 
po wbudzeniu donora światłem jego emisja wzbudza akceptor i akceptor świeci na zółto 
 
Struktura komórek bakteryjnych i eukariotycznych 
 
Komórka bakteryjna  
materiał genetyczny – nukleoid – rozmieszczony w cytoplazmie, brak jądra, w cytoplazmie 
rybosomy, na zewnątrz blona komórkowa i ściana komórkowa. 
 
Komóka eukariotyczna – ma jądro 
 
Nukleodi (DNA chromosomowy z superzwiązanymi domenami) – E.coli ~4700 kpz 
superzwinięte domeny DNA nawinięte na histonopodobne białka 
 
Oprócz chromosomu bakteryjnego mamy plazmidy – geny dodatkowe np. odporności na 
antybiotyki 
 
Główna powtzarzająca się jednostka strukturalna chromatyny to nukleosom 
Rdzeń tworzy osiem cząsteczek histonów (4 pary: H2A, H2B, H3, H4), nań nawinięty DNA, 
pomiędzy rdzeniami linkerowy (łącznikowy) DNA do niego jeszcze doczepiony histon H9. 

 
U człowieka nić DNA ma ok. 2 m długości i zwinięta jest w 23 parach chromosomów  
Całkowita długość 46 chromosomów metafazowych wynosi tylko 200 mikrometrów. 
 
Organizacja genomu eukariotycznego 
Nić DNA kondensuje – powstaje włókno nukleosomowe kondensuje – powstaje włókno 30nm 
które kondensuje – powstaje chromatyna interfazowa, przy podziale kondensuje – skondensowany 
fragment chromosomu tworzący chromosom metafazowy. 
 
Ile genów znajduje się w ludzkim genomie? 
Pierwsze szacunki mówiły o 6 000 000 – 1964 r 
potem mówiono o 100 000 – lata dziewięćdziesiąte 
teraz mówi się że ilość genów między 20-30 000 
 
Mamy ilość genów między kurą (ok 16 000 gen) a winogronami (30 000 gen) 
 
Genom człowieka w liczbach 
- cały genom człowieka ma ok 3,2 mld par zasad (bp) 
- tylko około 1,5% DNA człowieka to geny kodujące białka, reszta to introny (fragmenty genów 
niekodujące białek), geny kodujące RNA, sekwencje regulatorowe i DNA, którego funkcji nie 
znamy 
- Chromosom 1 ma aż 246 milionów par nukleotydów, chromosom 21 ma 47 milionów par zasad 
 
DNA mitochondrialne (mtDNA) 
- mtDNA koduje białka biorące udział w wytwarzaniu ATP; 
- występuje zwykle w postaci kolistej dwuniciowej cząsteczki; 
- długość mtDNA 
 

 

mtDNA człowieka 15kb (kilobase) 

 

 

mtDNA drożdży 78 kb 

 

 

mtDNA niekt.roślin > 3000 kb 

- liczba kopii mtDNA na mitochondrium wynosi od kilku u większości organizmów do 30 u 
pierwotniaków z rodzaju Euglena 
 
Genom mitochondrialny człowieka 
mtDNA człowieka koduje informację o syntezie 13 białek związanych z fosforylacją oksydacyjną, 
22 rodzajach tRNA, 2 rodzajach rRNA 
 
Genom mitochondrialny jest kulisty, zwarty, jedyną sekwencją niekodującą jest tzw lupa D, 
wykazuje on dużą zmiennośc więc służy do porównywania pokrewieństwa i datowania 
filogenetycznego. 
 
DNA chloroplastów (cpDNA) 
- cpDNA koduje białka biorące udział w fotosyntezie oraz ekspresji informacji genetycznej 
(replikacja, transkrypcja, translacja) 
- występuje w postaci kolistej 
 

Przeciętna ilość genów na cpDNA wynosi ok. 124 w tym 
4 geny kodujące rRNA 
30 genów kodujących tRNA 
90 genów kodujących białka 
 
Wirusy DNA ssaków 
 
Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) – dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA 
Wirus SV40 – dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA – struktura jego genomu przypomina 
minichromosom pod mikroskopem elektronowym. 
Adenowirus – dwuniciowa, liniowa cząsteczka DNA 
 
Eukariotyczne wirusy RNA 
Typ wirusa 

Genom  

Sposób replikacji 

Rodzina wirusw 

Przedstawiciele 

EukariotycznessRNA (nić +) RNA → RNA  

Picornaviridae 

Rynowirus 

wirusy RNA   

 

 

 

 

 

 

 

Wirus polio 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Wirus pryszczycy 

 

 

ssRNA (nić -)  

 

 

Coronaviridae  

Wirus SARS 

 

 

 

 

 

 

 

Rhabdoviridae 

Wirus wścieklizny 

 

 

 

 

 

 

 

Paramyxoviridae 

Wirus odry 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Wirus świnki 

 

 

 

 

 

 

 

Filoviridae 

 

Ebola 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Marburg 

 
Retrowirusy  
genom stanowi RNA, otoczke stanowi białkowy kapsyd okryty bloną, na tym jeszcze kolce  
 
Retrowirus zawiera enzym zwany odwrotną transkryptazą 
po wniknięciu wirusowe RNA w wyniku odwrotnej transkryptazy zostaje przepisane na wirusowe 
DNA i wtedy przenika do jądra i ulega integracji z genomem gospodarza. 
 
Wiroidy – koliste cząsteczki RNA długościok. 240-400 nt, niezawierające genów, nie zamknięte 
w kapsydach, rozprzestrzeniają się z komórki do komórki jako nagi RNA, np. wiroid łuszczycy 
kory drzew cytrusowych, hamujący ich wzrost; 
 
Wirusoidy – koliste cząsteczki RNA długości ok.  320-400 nt, niezawierające genów, 
przemieszczające się z komórki do komórki w kapsydach wirusów pomocniczych → genomy 
wiroidów i wirusoidów mają autokatalityczną aktywność rozcinania się. 
 
Autokatalityczne cięcie RNA wiroidów i wirusoidów 
Genomy są połączone w sposób głowa-ogon, tworzą one pofałdowaną strukturę która może się 
sama wyciąć bez dodatkowego enzymu -? cięcie autokatalityczne → poszczególne genomy 
liniowe → cyrkularyzacja  
 
Jak badać subkomórkową lokalizację i funkcje białek ssaczych? 
 

Kamil Deryło 
Zakład Biologii Molekularnej 
Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 
Lublin 
 
Plan prezentacji 
1. Ogólny schemat eksperymentu 
2. Izolacja DNA, projektowanie starterów, PCR, klonowanie, ssacze wektory ekspresyjne 
3. Transformacja bakterii 
4. Izolacja i oczyszczanie plazmidu 
5. Podstawy hodowli komórek zwierzęcych. 
6. Transfekcja 
7. Mikroskopia konfokalna. 
 
Dlaczego badanie lokalizacji białek może być interesujące? 
 
1. Subkomórkowa lokalizacja → funkcja (błona komórkowa, jądro komórkowe) 
2. Zmiana lokalizacji w czasie → fizjologia komórki (transport białek, podział komórki, apoptoza)  
3. Zmiana lokalizacji zmieniona czynnikiem zewnątrznym → wpływ antybiotyków  
 
Interakcje między białkami są kluczowe dla każdego procesu zachodzącego w komórce. 
 
Jak możemy badać te interakcje in vivo? 
 
Jak zobaczyć białka w mikroskopie? 
- białko hybrydowe/białko fuzyjne 
do DNA kodującego białko dołączamy plazmid kodujący białko fluorescencyjne (restryktaza, 
potem ligaza) – powstaje cząsteczka hybrydowa – DNA kodujące badane + DNA kodujące 
fluorescencyjne → wprowadzamy do bakterii, namnażamy, rozbijamy bakterie, ekstrahujamy gen, 
wprowadzamy do komórki zwierzęcej, gen ulega ekspresji, widzimy pod mikroskopem świecące 
białko. 
 
Projekt pracy magisterskiej: 
„Charakterystyka ludzkiego białka X (subkomórkowa lokalizacja, funkcja, dynamika, interakcje z 
inymi bialkami)” 
 
Zaplanowanie eksperymentu 
1. Jaki jest cel eksprymentu? 
2. Z jakimi biomolekułami będziemy pracować? 
3. Charakterystyka źródła materiału biologicznego 
4. Jakie techniki będą używane? 
5. Charakterystyka komórek z którymi będziemy pracować. 
 
Przygotowanie DNA kodującego białko X 
 
1. Garbage in – garbage out – przygotowanie próbki DNA 

2. Izolacja DNA genowego/ plazmidowego (wydajność, czystość, jakość) 
3. Liza alkaliczna/kolumienki (zestaw Plasmid Mini) 
 
Genomowe DNA 
a) Liza komórki – zniszczenie ściany komórkowej, błony komórkowej → ekstrakt komórek 
b) centryfugacja w celu usunięcia resztek komórki → wirowanie ekstraktu kom → na górze mamy 
DNA, RNA, białka – resztki w osadzie 
możemy też mieszać z fenolem i robi się to samo. 
 
Wybór odpowiedniego wektora 
- Wektor bakteryjny – plazmid 
Plazmidy to pozachromosomowe cząsteczki DNA w komórce bakteryjnej nadające jej dodatkowe 
funkcje 
sekwencja ORI 
sekwencja kodująca jakiś gen (np. odporności) 
sekwencja polilinkera (sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne → tnące DNA w 
ściśle określonym miejscu) 
 
Wybór odpowiedniego wektora 
- Bakteryjny wektor ekspresyjny 
 
Wektor zawiera sekwencję promotorową rozpoznawaną przez polimerazę DNA  
 
Izolacja plazmidów  
Mamy w ekstrakcie liniowe DNA i superskręcone plazmidy → alkalizacja pH do 12.5 z 12.0 → 
wiązanai wodorowe się niszczą → pH 7.0 → z DNA robi się skręcona masa bo wiązania 
wodorowe nie odtworzyły się idealnie, plazmidom nic nie jest → wirowanie → na górze 
superskręcone plazmidy, na dole DNA 
 
Elektroforeza plazdmidu. 
 
Amplifikacja DNA kodującego białko X → reakcja PCR 
 
- woda 
- genomowe/plazmidowe DNA 
- dNTP 
-MgCl2 
- polimeraza Taq 
- bufor dla polimerazy Taq 
 
Denaturacja 
A PCR recation starts with a denaturing step. Samples are heated to 94-96 C for one to several 
minutes. 
Przyłączenie primerów forward and reverse 
polimeraza 
 

Cięcie produktu reakcji PCR i wektora enzymami restrykcyjnymi 
 
- DNA 
- bufor dla enzymów 
-BamHI 
 
Hodowle komórkowe 
 
Hodowla komórek – umożliwia utrzymywanie poza organizmem, czyli in vitro, żywych komórek 
fragmentów tkanek lub narządów. W powszechnym rozumieniu jest do hodowla zdyspergowanych 
komórek, rosnących w systemie jednowarstwowym (monolayer) lub w zawiesinie. Termin ten 
obejmuje hodowle wycinków tkankowych, hodowle narządowe, hodowle komórkowe pierwotne i 
hodowle linii oraz szczepów komórkowych, jak również 
 
kokultury organotypowe i hodowle przestrzenne. Pod pojęciem „hodowle komórek” należy 
 
rozumieć hodowle zdyspergowanych komórek w hodowlach pierwotnych i w hodowlach 
 
komórek linii komórkowych, rosnące w systemie jednowarstwowym (hodowle adherentne)  
 
lub w zawiesinie (hodowle zawiesinowe). Hodowla pierwotna jest zakładana z materiału 
 
pobranego bezpośrednio z organizmu. Wyprowadza się ją z eksplantów tkanki/narządu lub z 
 
zawiesiny powstałej po ich enzymatycznym rozproszeniu. Linia komórkowa jest populacją  
 
komórek powstającą z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. Pasażowaniem nazywa się 
 
przeniesienie komórek ze starego naczynia hodowlanego do nowych naczyń, zawierających 
 
świeżą pożywkę. Pasażowaniu poddaje się komórki przed osiągnięciem konfluencji czyli  
 
stanu, kiedy komórki w hodowli pokrywają ścisłą warstwą całą powierzchnię dna naczynia 
 
hodowlanego. Podczas pasażowania komórki rozcieńcza się w odpowiednim stosunku i 
 
przenosi do nowych naczyń, namnażając w ten sposób populację komórek i zapewniając 
 
jednocześnie ciągłość jednolitego materiału do badań.  
 
Warunki hodowli 
- Hodowle komórkowe prowadzi się w odpowiednich naczyniach hodowlanych 
 
Transfekcja 
Trans + infection = transfection 
 

Lipofekcja 
 
Zapewnienie komórkom optymalnych warunków do wzrostu i rozwoju. 
 
Współczesne mikroskopy konfokalne do przyżyciowego obrazowania komórek. 
Statyw ma odpowiednią temperaturę, dostarczanie CO2. 
 
Laboratorium obrazowania zywych komórek 
- mikroskop konfokalny 
 
Podstawy fluorescencji  
Promienie świetlne padają na substancję zdolną do fluorescencji → substancja przechodzi do 
stanu wzbudzonego → przechodząc do podstawowego emituje światło o mniejszej energii 
(większa długość fali) 
 
Główne drogi światła w mikroskopii konfokalnej 
 
Źródło światła (laser) → szczelina (do detektora dociera światło tylko z jednej płaszczyzny – 
zapewnia ostrość obrazu) → światło pada na listro dichroiczne (przepuszcza światło o jednej 
długości fali – emitowane przez próbkę – inne, jak światło lasera, odbija) → przez obiektyw na 
preparat → preparat emituje światło, przechodzi ono oprzez lustro dichroiczne i do obiektywu 
 
Odkrycie GFP z Aeqorea Victoria – wyizolowal ekforynę emitującą swiatło niebieskie pod 
wpływem jonów wapnia oraz zielone białko fluorescencyjne – emitujące swiatło zielone po 
pochłonięciu niebieskiego 
 
Ekspresja GFP w E.coli i C. elegans – połączenie DNA gospodarza z DNA kkodującym GFP – 
powstaje białko hybrydowe (fuzyjne) 
 
Problemy z wild type GFP 
Widmo absorpcji podobne do widma emisji 
Widmo absorpcji cytotoksyczne (światło o wys. energii) 
Skłonność do dimeryzacji 
 
Rozwój i modyfikacje GFP 
- przez mutacje punktowe – zamiany poszczeŋólnych aminokwasów dały nam białka 
fluorescencyjne o całej palecie barw 
 
Modyfikacje GFP 
Optymalizacja ekspresji w różnych typach komórek 
Optymalizacja właściwości spektralnych – absorpcja bardziej długofalowa, pojedynczy pik  
 
Obserwacje mikroskopowe 
 
Do badanego białka dołączony GFP 
- możemy je zobaczyć w jądrze, w cytoplazmie mało 

- albo tylko w cytoplazmie, w jądrze nie 
- albo tylko w jąderkach 
- albo tylko w cytoplazmie i jąderkach etc. 
 
Możemy zaobserwować jak zmienia się lokalizacja białek po dodaniu antybiotyku – gdzieś zanika 
fluoresecencja, gdzieś się zwiększa, etc. 
 
Składanie obrazu w 3D z wielu płaszczyzn (mikroskop konfokalny zbiera światło tylko z jednej 
płaszczyzny naraz) 
 
Badanie ruchu organelli przez wybarwianie białek specyficznych dla danych organelli  
- mitochondriów, aktyny, chromosomów 
Obserwujemy w czasie – robimy zdjęcia w odstępach czasowych. 
 
Jak zbadać dynamikę i zachowanie się badanego białka w komórce? 
 
FRAP – Fluorescence Recovery After Fotobleaching – po potraktowaniu silnym światłem po 
jakimś czasie białko traci zdolność do fluorescencji (fotowybielanie),  
 
gdzieś kierujemy silny laser, tam chromofor przestaje emitować światło, robi się ciemno  – jeżeli 
cząsteczki białka są ruchliwe to fotowybielone dyfunduja do innych obszarów, a niefotowybielone 
dyfundują w miejsce gdzie były fotowybielone, świecenie wraca, do tego jest krzywa.  
 
Jeżeli są niemobilne (związane przez coś), nie ma dyfuzji, ruchu. 
 
Czego możemy się dowiedzieć? 
- Jak szybko poruszają się białka 
- przez jakiś czas białka pozostają związane? 
- jaki jest % białek związanych 
- jak wpływają substancje 
 
Fotoaktywacja/fotokonwersja. 
 
Konwersja molekuły w jednym rejonie, obserwować dyfuzję do innych rejonów – obserwowanie, 
jak szybko przemieszczaą się białka 
 
Badanie interakcji między biiałkami – dlaczego kolokalizacja nie wystarcza 
 
rozdzielczosc jest za mała = 200 nm 
białka mają 1; 2 nm. 
 
Foerster Resonsnce Energy Transfer 
 
Zrobimy dwa białka fluoresecncyjne, donor i akceptor, 
wzbudzamy donor → przekazujeon energie akceptorowi i wraca do podstawowego → akceptor 
świeci, po czym wraca  do podstawowego 

Donor nie świeci, zachodzi to przy oldegłości < 10nm. 
 
Widmo emisji donora musi się pokrywać z widmem absorpcji akceptora  
 
Standard do FRETa zestaw add gena Cerulean Venus 
 
FRET – Zasada fotowybielania akceptora 
 
Mamy donor i akceptor, energia d idzie do a, wybielamy akceptor i donor odżywa, zaczyna 
świecić. 
 
Ekspresja informacji genetycznej 
 
U prokariota 
Fragment DNA (gen - ciągły) zawieszony w cytoplazmie ulega transkrypcji i powstaje mRNA, 
mRNA ulega translacji i powstaje białko. 
U eukariota 
W cytoplazmie mamy wydzielone błonami jądro, w jądrze siedzi DNA → jednostka 
transkrypcyjna składa się z intronów (elementy niekodujące – usuwane w trakcie dojrzewania 
RNA) i eksonów (elementy kodujące – gen nieciągły) → ulega transkrypcji i powstaje pierwotny 
transkrypt RNA → następuje modyfikacja potranskrypcyjna → dodawanie czapeczki na końcu 5', 
splicing (wycinanie intronów) RNA, poliadenylacja na końcu 3' → powstaje mRNA z czapeczką na 
końcu 5' i z poliadenylowanym końcem 3' → następuje eksport tej cząsteczki z jądra a następnie 
translacja w wyniku której powstaje białko. 
 
Rodzaje chromatyny: 
- euchromatyna – luźna, aktywna transkrypcyjnie  - jasna na elektrogramie, bardziej w środku 
jądra 
- heterochromatyna – skondensowana, brak transkrypcji – ciemna na elektrogramie, skupiona 
bliżej błony jądrowej 
 
Mechanizmy regulujące dostęp do genów: 
- metylacja DNA 
- modyfikacja post-translacyjna histonów 
- kompleksy remodelujące 
- warianty histonów (zmiana histonów) 
- niekodujące RNA, ncRNA 
 
chromosom → chromatyna → składa się z nukleosomów → cytozyny w DNA pod wpływem 
enzymów metylotransferaz mogą ulec metylacji 
histony mogą zaś zostać metylowane, fosforylowane, acetylowane. 
 
Transkrypcja możliwa 
- chromatyna aktywna 
- brak metylacji cytozyn  
- acetylacja histonów 

 
Transkrypcja zahamowana 
- chromatyna skondensowana 
- metylacja cytozyn 
- deacetylacja histonów 
 
Obie formy mogą w siebie przechodzić w zależności od potrzeb organizmu (ścisła regulacja)  
 
Remodelowanie chromatyny – modyfikacja lub zmiana położenia nukleosomów w procesie 
zależnym do energii z ATP. 
Mamy 3 ściśnięte nukleosomy (histony: H2A, H2B, H3, H4) nawinięte na nie ściśle DNA + 
remodeler chromatyny (kompleks białkowy) + ATP → zapętlanie, ślizganie, uwalnianie → pozycja 
otwarta przesunięta, pozycja otwarta stara, stara zamknięta pozycja 
Może też nastąpić wymiana histonów. 
 
Transkrypcja 
- synteza RNA na matrycy DNA, katalizowana jest przez polimeraznę RNA zależną od DNA. 
- synteza RNA zachodzi zawsze w kierunku od końca 5' cząsteczki RNA do jej końca 3'  
- tylko jedna nić DNA jest transkrybowana, 
- DNA wyznacza kolejność w jakiej reszty nukleotydowe zajmują swoje miejsce w powstającym 
polirybonukleotydzie, dzięki komplementarności zasad. 
 
Nić kodująca, sensowna 5' – 3', non-template strand. 
Nić antysensowna, niekodująca 3' – 5' 
Te dwie nici są ze zobą połączone wiązanami wodorowymi – potrójnymi między cytozyna a 
guaniną, potrójnymi między adeniną a tyminą. → transkrypcja, rozplątujemy nici DNA, 
polimeraza doczepia się do nici antysensownej i na tej matrycy syntetyzuje z komplementarnych 
do niej nukleotydów nić RNA → powstaje RNA o kolejności nukeotydów takiej same j jak w nici 
sensownej tyle że tymina zastąpiona uracylem. 
 
Tworzenie wiązania fosfodiestrowego w trakcie transkrypcji – znaleźć mechanizm reakcji 
Od 3' do 5' matrycy tworzy się nić od 5' do 3' RNA 
 
Jednostka transkrypcyjna – sekwencja DNA rozciągająca się od promotora do terminatora, może 
zawierać jeden lub kilka genów 
 
DNA 5' – 3' – nić sensowna 
          3' – 5' – nić antysensowna 
 
upstream – sekwencja powyżej promotora  dowsntream – region poniżej promotora 
promotor →pierwszy nukleotyd po promotorze+1 region transkrybowany (ulega transkrypcji i 
powstaje RNA) → terminator 
 
RNA powstałe po transkrypcji taka sama sekwencja jak nić sensowna. 
 
Etapy transkrypcji 

- rozpoznanie promotora – związanie polimerazy RNA do obu nici DNA w rejonie promotora 
(kompleks zamknięty) i rozplecenie DNA w rejonie promotora (kompleks otwarty) 
- inicjacja – synteza pierwszych  2- 9 nukleotydów 
- elongacja – opuszczenie przez polimerazę RNA promotora i wydłużani łańcucha  RNA 
 
- terminacja – zakończenie syntezy RNA 
 
Polimeraza przemieszcza się w tzw. bąblu  transkrypcyjnym 
Tam gdzie przeszła DNA się zwija na powrót, tam gdzie siedzi polimeraza nić matrycowa i 
kodująca rozplataja się, syntetyzuje się RNA na nici matrycowej, powstaje hybrydowa helisa 
RNA-DNA powstającego RNA z nicią matrycową. 
 
Budowa bakteryjnej polimerazy RNA zależnej od DNA 
Podjednostki polimerazy bakteryjnej 
alfa – składanie enzymu (40kDa) 
beta – centrum katalityczne (155 kDa) 
beta prim – wiązanie DNA (160 kDa) 
omega – utrzymywanie aktywności enzymu (10 kDa) 
sigma – rozpoznawanie promotora (32-90 kDa) 
 
Holoenzym: dwie podjednostki alfa, jedna beta, jedna beta prim, jedna omega, jedna sigma.  
 
Czynniki sigma 
 
sigma70 – podstawowy czynnik E.coli zaangażowany w rozpoznawanie promotorów genów 
ulegających konstytutywnej transkrypcji 
sigma32 – rozpoznaje promotory genów kodujących białka szoku termicznego 
sigma54 – syntetyzowany przez Klebsiella pneumoniae w czasie głodu azotowego, stymuluję 
ekspresję genów asymilacji azotu 
sigmaF i sigmaE – syntetyzowane przez Bacillus subtilis, stymulując ekspresję genów 
niezbędnych do utworzenia spor 
 
Promotor rozpoznawany przez czynnik sigma70 E.col 
 
TTCACA …..........16-18 pz...........TATAAT...........5-8pz.......CG/AT 
sekwencja -35                                 sekwencja -10                   + 1 
 
sekwencje zgodne promotorów E.coli (najbardziej zachowawcze sekwencje zaznaczono tłustym 
drukiem) 
 
Terminacja transkrypcji u E.coli 
Terminacja z udziałęm terminatora samodzielnego 
DNA 3' – 5' – nić matrycowa 
         5' – 3' 
→ mamy sekwencję odwróconego palindromu (czytaną tak samo od 5 do 3, jak i od 3 do 5), 
umożliwiającą oddysocjowanie polimerazy od kompleksu transkrypcyjnego a potem AAAA  

→ transkrypcja odwróconego palindromu daje RNA o strukturze spinki do włosów – 
jednoniciowe, potem dwuniciowe, między tym wiązania wodorowe – dalej, przy końcu 3' same 
uracyle 
Dalej nie pójdzie, spinka do włosów się tworzy i nie zrobi się hybrydowa helisa (?), wiązania też 
są słabe do dalej idą same pary A-U - kompleks się rozpada, polimeraza się odlącza 
 
Terminacja zależna od Rho 
(kiedy mamy słabszy palindrom, ale nie mamy samej sekwencji A -U potem 
do RNA dołącza się Rho  
→ kompleks elongacyjny zatrzymuje się na pętli spinki do włosów → Rho rozbija wiązania 
wodorowe między zasadami RNA i DNA. 
 
Dojrzewanie pre-rRNA u E.coli 
 
Pre-rRNA:  (tu działa endonukleaza III)-sekwencja 16SrRNA-(III)-tRNA-(III)-sekwencja 
23SrRNA(III)(P)sekwencja 5SrRNA (F) 
 
Dojrzewanie pre-tRNA u E.coli 
5'- mamy sekwencję dodatkową odcinaną przez RNazę P → sekwencja dojrzała tRNA → 
sekwencja CCA odcinana przez Rnazę Z → sekwencja odcinana przez RNAzę D 
 
Inhibitory transkrypcji u bakterii 
- ryfampicyna – działa na podjednostkę beta polimerazy RNA i blokuje tworzenie pierwszego 
wiązania fosfodiestrowego 
- aktynomycyna D – interkalator, wiąże się do DNA w regionach bogatych w pary G-C, 
uniemożliwiając wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA. 
 
Polimerazy eukariotyczne w odróżnieniu od bakteryjnej polimerazy RNA nie wiążą się same z 
DNA. 
Każda polimeraza eukariotyczna współdziała z określoną grupą czynników transkrypcyjnych 
Tf1 (transcription factor 1) – wspołdziala z polimerazą I 
Tf II – współdziała z polimerazą II 
 
Promotor polimerazy I 
Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA I 
UBF → TBP – TATA binding protein + trzy cząsteczki TAFs – TBP associated factors → 
polimeraza RNA I 
 
Polimerazy RNA zależne od DNA (Eukariota) 
Polimeraza 

 

 

 

Transkrybowane geny 

Polimeraza RNA I (RNAP I)   

geny kodujące 25S/28S, 5,8 S i 18S rRNA 

Polimeraza RNA II (RNAP II) 

geny kodujące białka: geny kodujące większość malych  

 

 

 

 

 

jądrowych RNA snRNA, miRNA 

Polimeraza RNA III (RNAP III) 

geny kodujące tRNA, 5S rRNA, U6-snRNA, małe jąderkowe 

 

 

 

 

 

RNA (snoRNA), miRNA 

Polimeraza RNA mitochondrialna i chloroplastowa. 

 
Polimeraza RNA I – niewrażliwa na alfa-amanitynę 
polimeraza RNA II – bardzo wrażliwa na alfa-amanitynę, kilka-kilanaście nM 
polimeraza RNA III – wrażliwa na duże stężenia – 1µM. 
 
Dojrzewanie pre-rRNA 
- cięcia endo i egzonukleolityczne 
- dodawanie grup metylowych 
- przeksztalcanie urydyny w pseudourydynę 
- splicing 
 
Metylacja pre-rRNA 
 
C/D snoRNA (ang. small nucleolar RNA) 
 
snoRNA składa się z boxu C, sekwencji komplementarnej do rRNA, boxu D  
przyłączają się komplementarne zasady rRNA 
powstaje kompleks snoRNA -rRNA 
następuje metylacja 
kompleks snoRNA-zmetylowane w miejscu komplementarnym rRNA 
zmetylowane rRNA odłącza się 
 
Pseudourydylacja pre-rRNA 
ACA snoRNA 
 
snoRNA tworzy tu pętle 
 
Introny 
gen bakteryjny na dwuniciowym DNA składa się z promotorwa i rejonu kodującgo – są ciągłe 
5'->3' 
3'->5' 
 
gen eukariotyczny na dwuniciowym DNA jest nieciągły – zawiera promotor i rejony kodujące 
(eksony) naprzemiennie z rejonami niekodującymi (intronami) 
5'->3' 
3' → 5' 
 
Typ intronu   

Miejsce występowania 

Introny GU-AG 

Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA 

Introny AU-AC 

Jądrowy eukariotyczny pre-mRNA 

Grupa I 

 

Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny 

Grupa II 

 

Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny 

 
Splicing pre-rRNA 
Zachodzi autokatalitycznie – nie uczestniczy żaden inny enzym białkowy 
Bierze udział guanozyna z GTP, GDP, GMP 

pre-rRNA 5'-ekson-intron-ekson-3' 
guanozyna przyłacza się do kńca 5' intronu i atakuje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy eksonem 
poprzedzającem a intronem, w wyniku tego ataku wiązanie zostaje przecięte → wolny ekson z 
grupą OH, intron z dołączoną guanozyną i drugi dołączony ekson 
grupa OH eksonu 1 atakuje fiązanie fosfodiestrowe między intronem a eksonem 2, przecięcie 
tego wiązania, eksony łączą się, intron z guanozyną zostaje wywalony. Intron ostatecznie ulega 
degradacji. 
Ważna jest natywna struktura drugorzędowa i trzeciorzędowa intronu – jest ona bardzo ważna, 
jeżeli się ją rozplecie za pomocą czynników denaturujących, splicing nie zajdzie.  
Splicing pre-rRNA zachodzi w trzech transferach. 
 
Nagroda Nobla z chemii w 1989 
„za odkrycie katalitycznych wlaściwości RNA” 
Thomas R. Cech, Sidney Altman. 
 
 
 
Promotor podstawowy dla polimerazy RNA II 
Do promotora podstawowego przyłączają się podstawowe (ogólne) czynniki transkrypcyjne (GTFs 
– ang. general transcription factors) i polimeraza RNA II tworząc kompleks preinicjacyjny. 
 
BRE – Miejsce rozpoznania TFIIB (-37 do -32) – Sekwencja TATA (-31 do-26) – Sekwencja Inr 
– inicjatora (-25 do +2) – MTE – Miejce Motywu 10 – Rdzenne Miejsce Promotora w dół od 
sekwencji inicjatora DPE 
 
Elementy regulatorowe 
Moduły promotora podstawowego, elementy regulacyjne i enchancery u Eukariota 
enhancer 

elementy regulacyjne BRE-Sekwencja TATA-INR 

-1000...-500  -500... -70   

 

 

 

   +1 

 

 

Elementry regulacyjne: 

Moduły konstytucyjne  

→ 

Aktywatory konstytutywne  

(jeżeli znajdują się przed genem ulegającym przed genem ekspresji konstytutywnie [zawsze]) 
 
Moduły odpowiedzi   

 

→  

Moduły komórkowo specyficzne 

→ aktywatory regulacyjne 

Moduły wiążące regulatory rozwoju →  
 
Jeden enhancer – wzmocnienie wielu genów naraz, elementy regulacyjne tylko w odniesieniu do 
jednego genu 
 
Sekwencja wzmacniająca  może aktywować gen działając: 
- z dużej odległości 
enhancer działa na promotor mimo ze jest od niego oddalony i powoduje wzmocnienie ekspresji 
jednostki transkrypcyjnej 
- niezależnie od orientacji 
- poniżej, powyżej genu który aktywuje. 

 
Sekwencje wzmacniające 

Sekwencje wyciszające 

(enhancery)   

 

(silencery) 

 
aktywatory   

 

represory 

 
koaktywatory  

korepresory 

 
S. wzmacniająca lub element regulacyjny → aktywator → koaktywator 
S. wyciszająca lub element regulacyjny → represor → korepresor 
Do enchancera przyłącza się białko aktywatora – wygięcie nici DNA, dołącza się cząsteczka 
mediatora (koaktywatora) – nić się ugina, kompeks ten oddziaływuje z polimerazą II lub 
komplekesem promotora TATA-GTFy- pol II 
Białka aktywatorowe: 
- wspomagają składanie komp;eksu gólnych czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA  
- zmieniają strukturę chromatyny 
 
Mediator – most molekularny 
- Powszechny u eukariontów – występuje zarówno w drożdżach, jak i u ssaków 
- Kompleks 25-30 białek (u ssaków co najmniej siedem różnych kompleksów Mediatora); 
- wymagany do transkrypcji większości genów transkrybowanych przez polimerazę II  
- bierze udział zarówno w regulacji pozytywnej jak i negatywnej, chociaż powszechnie nazywany 
koaktywatorem, to jest również korepresorem jak i podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym.  
 
Mdiator, oddziaływuje z RNAPII, TFIIF 
 
Modułowa struktura promotora genu ludzkiej insuliny 
GC-A5-OCT-E2-A3-CRE-A2 
 
Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą uczestniczyć zarówno w aktywacji jaki i represji 
tranksrypcji  
 
T – hormon tarczycy (ang. 

thyroid hormone) 

TR – receptor hormonu tarczycy (ang. 

thyroid hormone receptor) 

TRE - element odpowiedzi na hormon tarczycy (ang. 

thyroid hormone response element) 

 
jeżeli TR bez dołączonego T wiąże się z TRE → hamuje transkrypcję 
jeżeli TR z dołączonym T wiąże się z TRE (zmiana konfiguracji, mogą się dołączyć cząsteczki 
koaktywatorów)→ aktywuje transkrypcję 
 
Czynniki transkrypcyjne zbudowane są z kilku domen 
Główne domeny czynników transkrypcyjnych to: 
- domena wiążąca DNA 
- domena transkatywacyjna 
 
Dodatkowe domeny  

- dimeryzacyjna 
- regulatorowa (wiązania hormony, fosforylacji) 
- sygnał importu/eksportu jądrowego 
 
Klasyfikacja białek wiążących (specyficznie) DNA 
- we względu na domeny wiążące DNA 
HTH (ang. helix-turn-helix, helisa-skręt-helisa) 
palec cynkowy (ZF, an.g ZN finger) 
domena zasadowa 
domena TBP 
 
- ze względu na domeny dimeryzacji 
HLH (ang. helix-loop-helix, helisa-pętla-helisa) 
zamek leucynowy (LZ, ang. leucine zipper) 
 
- wielu nie daje się sklasyfikować 
 
Domena typu helisa-skręt-helisa (HTH) 
- pierwsza zidentyfikowana struktura wiążąca DNA 
- dwie alfa helisy połączone ostrym srkętem, pierwsza helisa kontaktuje się ze szkieletem 
fosforanowym, druga dokładnie pasuje do rowka większego DNA w miejscu występowania 
specyficznej sekwencji, 
- wysoce konserwatywny motyw wiążący DNA występujący w wielu prokariotycznych i 
eukariotycznych białkach wiążących DNA (represor laktozowy, regulatory  
 
Domena typu palec cynkowy 
- palec cynkowy – najpowszechniejsza domena wiązania DNA u Eukariota 
- składa się z beta-kartki, za którą następuje ostry skręt i alfa-helisa, atom cynku utrzymują 2 
Cys i 2 His (Cys2His2) lub 4-6 Cys (Cys 4-6) 
 
W niektórych białkach występują wielokrotne powtórzenia tej domeny. 
 
(TFIIIA – dziewięc klasycznych palców cynkowych [Cys2His2] 
receptory homonów steroidowych [Cys4-6]) 
 
Białko TBP (ang. TATA-binding protein) 
- Wiąże sekwencje TATA w promotorach, jest też niezbędne do inicjacji transkrypcji z 
promotorów pozbawionych TATA; 
- wchodzi w skład TFIID, ale także ogólnych czynników dla pol I i pol III RNA;  
- pojedynczy peptyd z częścią środkową w formie zgiętej beta-kartki, obejmującej DNA niczym 
siodło, z dwiema helisami po bokach 'siodła' i na końcach; 
- lekko rozkręca helisę DNA i silnie ją zagina 
 
Domena typu zamek leucynowy 
- zamek leucynowy – złozony z alfa-helis dwu oddzielnych monomerów, które dimeryzują dzięki 
leucynom regularnie rozmieszczonym na obu helisach, zawierają też reszty argininy, które 

przytrzymują szkielet fosforanowy po obu stronach rowka większego 
- rozpoznają i wiążą palindromowe sekwencje DNA w rowki większym 
- zamykają się na DNA jak para nożyczek prostopadłych do podwójnej helisy  
- np. AP1, drożdżowy czynnik transkrypcyjny GCN4, C/EBP (ang. CCAAT enhancer-binding 
protein) 
 
Regulacja aktywacji czynników transkrypcyjnych 
 
a) brak czynnika: w tkance jeden gen jest niekatywny, bo nie ma czynnika, w tkance drugiej 
czynnik obecny, migruje do jądra, wiąże się z DNA i aktywuje gen, gen ulega ekspresji  
b)czynnik nieaktywny – syntetyzowany jest cały czas w formie nieaktywnej, pod wpływem 
pewnych bodźcow jest aktywowany, migruje do jądra, wiąże się z DNA, gen staje się aktywny, 
gen ulega ekspresji 
 
Regulacja aktywności czynników transkrypcyjnych 
aktywacja czynnika w wyniku: 
związania liganda – niektywny czynnik, nieaktywny gen – wiąże się ligand, czynnik z ligandem 
zmienia komfornację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny. 
oddysocjowania od inhibitora – czynnik nieaktywny związany z inhibitorem, po oddyscocjowaniu 
zmienia konformację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny 
modyfikacji chemicznej – czynnik nieaktywny, 
cięcia prekursora  
 
Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA II 
promotor podstawowy z sekwencją TATA – jednostka transkrypcyjna → start transkrypcji 
dołącza się TFIID 
TFIID = TBP + TAFs 
TBP łączy się z TATA,  
TAFsy, białka towarzyszące TBP, dodatkowe białka o masach cząsteczkowych: 250, 150  – wiążą 
się do sekwencji inicjatorowej, 60, 40 – wiążą się do sekwencji  DPE, 110, 80, 24, 30 
Kompleks ten łączy się do sekwencji promotorowej, co umożliwia przyłączenie kolejnyczh 
cyznników, TFIIA i TFIIB, po ich dołączeniu mogą się dołączyć: TFIIF z dołączoną polimerazą 
RNA II  i inne czynniki,  także TFIIE i TFIIH 
polimeraza RNA II zawiera ogon CTD – największa podjesnotksa polimerazy II mający reszty 
seryn mogące ulec fosforylacji, 
do ogona CTD dołączają się reszty fosforanowe z UTP, ATP, CTP, GTP – przejście ze stadium 
inicjacji do elongacji, ma on właściwości helikazy – rozplatania DNA → zaczyna powstawac RNA, 
transkrypcja 
 
Elongacja transkrypcji przez polimerazę II 
- podstawowe zasady elongacji transkryptów – takie same dla bakterii i eukariiontów, istotna 
różnica dotyczy długości transkryptów 
- u bakterii transkrypty długości do kilku kpz – czas transkrypcji do kilku minut 
- u ekariontów transkrypty do 2400 kpz (liczne introny) – czas transkrypcji do 20 godzin co 
wymaga dużej stabilności kompleksu transkrypcyjnego 
- w jądrze komórkowym przerywaniu i zatrzymywaniu polimeryzacji przeciwdzialają czynniki 

elongacyjne (np. P-TEFb, Elongina A, ELL, TFIIS). 
 
Dojrzewanie pre-mRNA (hnRNA ang. heterogenous nuclear RNA) 
- Tworzenie czapeczki na końcu 5' transkryptu (ang. 

capping) 

- Splicing (składanie pre-mRNA) 
- Poliadenylacja końca 3' transkryptu 
- Redagowanie (ang. 

editing) 

 
Budowa „czapeczki” 
 
Gppp + pppN → (transferaza guanylilowa) → GpppN → metylotransferaza guaninowa → 
7MeGpppN – czapeczka typu 0 – guanozyna z grupą metylową przy pozycji siódmej guaniny, 
połączona jest ona wiązaniem 5'-5' trójfosforanowym z kwasem nukleinowym, mRNA 
 
Rola: 
- zabezpiecza przed działaniem egzonukleaz 
- ułatwia asocjacje miejsca 5' splicingowego z U1 snRNA 
- stanowi sygnał transportu do cytoplazmy 
- stymuluje inicjację translacji. 
 
Introny w genach człowieka 
 
Gen   

 

Długość (kb)  Liczba intronów 

Część genu, którą stanowią introny 

Insulina 

 

1,4 

 

2 

 

 

67 

Albumina surowicy  18 

 

13 

 

 

89 

Kolagen typu VII 

31 

 

117 

 

 

71 

Dystrofina 

 

2400   

48 

 

 

>99 

 
Budowa intronów GU-AG 
 
Intron 
Końcowka 3' eksonu (A/C A G)- intron: 5'GU PuAGU (...) miejsce rozgałęzienia CUPuAPy 
(...)trakt polipirymidynowy Py rich (…) akceptorowe miejsce składania: NC AG3' koniec 5' 
eksonu: (G) 
 
Ogólny schemat splicingu pre-mRNA 
Pre-mRNA 5'-ekson-intron GU—A—AG- ekson-3' 
etap I: adenozyna atakuje GU 
tworzy się struktura lassa – wiązanie pomiędzy guanozyną a adenozyną,  
wolna grupa OH eksonu poprzedzającego atakuje miejsce splicingowe 3' 
dochodzi do połączenia eksonów, lasso zostaje uwalnianie → likwidania rozgałęzienia, 
degradacja. 
 
Synteza ludzkiego snoRNA U16 
Gen dla białka rybosomalnego L1 
DNA  Egzon – Intron 3' – Egzon 

Część intronu przy końcu 3' to sekwencja U16 snoRNA 
Transkrypcja 
Powstaje pre-mRNA  Egzon – Intron 3' – Egzon 
Splicing 
Powstaje mRNA i lasso intronu 
 

 

 

przetwarzanie intronu 

 

 

 

powstaje snoRNA – U16 i jakieś nieprzydatne skrawki 

 
Błędy w splicingu 
Pominięcie egzonu 
 
Egzon 1 – Intron – Egzon 2 – Intron – Egzon 3 
Egzon 2 został wycięty razem z intronami: zostaje Egzon 1 połączony z Egzonem 3 
Egzon 1 – Egzon 3 
 
Wybór kryptycznego miejsca splicingu → miejsce w egzonie przypomina koniec intronu, może 
zostać błędnie rozpoznane 
Egzon 1- Intron – Egzon 2(w środku kryptyczne miejsce splicingu) 
Lasso tworzy się w miejscu kryptycznego miejsca splicingu i część egzonu od intronu do niego 
zostaje wycięta wraz z intronem. Powstaje RNA: Zawierajace Egzon 1 połączony z drugą cześcią 
Egzonu 2 
Egzon 1-część Egzonu 2 
 
Rola snRNP w splicingu pre-RNA 
 
snRNP = snRNA (small nuclear RNA) + białka (proteins) – kompleksy 
 
Kompleks angażujący: 
5'-Egzon-Intron z przyłączonym U1-snRNP na końcu 5', dalej w miejscu rozgałęzienia (tam 
gdzie adenozyna) przyłącza się białko, SF1, U2AF dalej gdzie szlak polipirymidynowy, koniec 5' –
Egzon-3 
Następnie U2-snRNP przyłącza się tam gdzie SF1, do miejsca rozgałęzienia → dochodzi do 
oddziaływań między U1-snRNP i U2-snRNP → dołączenie się kolejnych kompleksów: U4/U6-
snRNP i U5-snRNP → kompleksy te przyciągają się, dochodzi do zbliżenia końca 5' i 3' i 
miejsca rozgałęzienia → powstaje spliceosom 
 
Rola białek SR w splicingu w pre-mRNA 
 
5'-intron z dołączonymi białkami – eksonow wzmacniacz splicingu (ESE) 
Do ESE przyłączają się biała SR → umożliwia to rozpoznanie SF1 i U2AF-om końca 3' intronu: 
traktu polipirymidynowego, miejsca rozgałęzienia. 
 
Introny AU-AC 
- Znalezione jak dotąd w ok. 20 genach u człowieka, roślin i Drosophila 
- Ich wycinanie przebiega identycznie z intronami GU-AG 
- Odmienny zestaw (?) 

 
Alternatywny splicing 
 
DNA → Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5 
pre-mRNA → Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5 
Alternatywny splicing: mogą powstać cząsterczki mRNA o kolejności eksonów: 
12345 → po translacji powstaje białko A 
1245 → po translacji powstaje białko B 
1235 → po translacji powstaje białko C 
 
Różne warianty białka to izoformy 
 
Możliwości alternatywnego splicingu RNA: 
- wycięcie lub pozostawienie intronu – jeden intron zostaje i staje się eksonem 
- wycięcie lub pozostawienie eksonu – jest wyjebywany z przylegającym intronem 
- wzajemne zastępowanie eksonów – wycina się eksony z intronami i zamienia eksony miejscami 
- alternatywne miejsce splicingu – wycinane jest np. pół intronu – działa jak kryptyczne miejsce 
splicingu, tyle że nie jest to proces patologiczny. 
- trans-splicing – łączone są ze sobą eksony pochodze pierwotnie z 2 różnych cząsteczek RNA. 
 
Poliadenylacja końca 3' mRNA eukariotycznego 
 
Pre-mRNA: 5'-(...) - AAUAAA – CA – GU – 3' 
Składanie kompleksu poliadenylującego: 
Do miejsca AAUAAA dołącza się CPSF, do CA-polimeraza poli(A), na nią siadają białka: PABP, 
CstF siada na dinukleotyd GU, koniec 3' jest zbędny i zostaje odcięty – wszystko za 
nukleotydem CA 
Poliadenylacja: 
poliadenylowane mRNA: 5'- (…) - AUAAAA – CAAAAAAAAAAAA, polimeraza poli(A) dołącza 
kolejne adenozyny, na niej siedzi białko PAPB 
 
 
 
Tworzenie końca 3' mRNA histonów 
Sygnały cięcia:  
trzon o długości 6 pz – 4-nukleotydowa pętla – ok. 12 nukleotydów – CAAGAAAGA – 3' 
Cięcie z udziałem U7-snRNA 
U7-snRNA ma sekwencję CUUUCU, która dołącza się do GAAAGA - (? dalej jest coś czego nie 
rozczytałam przy przepisywaniu, sorry ?) - reszty adenylowe nie są dodawane 
 
Redagowanie mRNA 
procesy powodujące zmianę informacji kodowanej w cząsteczce mRNA 
 
Funkcje redagowania 
- tworzenie nowych kodonów start lub stop 
- usuwanie kodonów stop 

- tworzenie ramek odczytu 
- zmiany w kodowanych aminokwasach 
 
1. Mechanizm konwersji zasad 
deaminacja: 
cytozyna + H

2

O → urydyna + NH

3

 

adenozyna + H

2

O → inozyna + NH

3

 

bądź aminacja

;

 

 
Redagowanie transkryptu apolipoproteiny B 
kodon #1...gen apolipotroteiny B...kodon #4564 
Edycja zachodzi w kodonie #2153 CAA 
Transkrypcja zachodzi tak samo w wątrobie i jelicie, następnie: 
a) w wątrobie – mRNA nie ulega edycji → po translacji powstaje apolipoproteina B-100; 4562 
aminokwasy 
funkcja: transport cholesterolu w krwi 
b) w jelicie – niezedytowane mRNA ulega edycji RNA – na skutek tego kodon #2153 CAA (=Gln) 
ulega wymianie na UAA (=STOP) → pod wpływem translacji powstaje apolipoproteina B-48, 
2152 aminokwasy, funkcja: absorpcja lipidów z jelita. 
 
Mechanizm redagowania poprzez insercję/delecję nukleotydów 
 
Pan-editing – readagowanie na wielką skalę (mitochondria pierwotniaków) 
Dodawanie lub usuwanie U – bierze w tym udział guideRNA, gRNA, które wiąże się z pre -mRNA, 
naznacza  on miejsce w pre-mRNA gdzie ma dojść do zmiany, tam działa endonukleaza, następnie 
działa 
- egzonukleaza – wycina U 
- UTP + TUT-aza (transferaza) → dodaje U 
Następnie następuje sklejenie porozczinanych kawałków. 
 
Od DNA do mRNA – struktura eukariotycznego mRNA 
DNA: promotor->ekson1-intron1-ekson2-intron2-ekson3 (sekwencja ulegająca transkrypcji – 
gen podzielony intronami: od eksonu1 do eksonu2) 
Transkrypcja 
pierwotny transkrypt:  
ekson1( zawiera kodon aug – start dla translacji)-intron1-ekson2-intron2-ekson3(zawiera kodon 
uga, uag lub uaa – stop translacji) 
Dojrzewanie mRNA 
Dojrzały mRNA: Czapeczka(m

7

G)-5'UTR(region 5' nie ulegający translacji)-część eksonu1od 

kodonu start (aug)-ekson2-część eksonu3 od kodonu stop (uga, uag, uaa)-3'UTR(region 3' nie 
ulegający translacji)-AAA-AAA(ogon poli[A]) 
 
Struktura bakteryjnego mRNA: 
5'UTR-Białko1-Białko2-Białko3-UTR3' 
Przed genem kodującym każde białko oddzielne miejsc startu translacji. 
 

Promotor polimerazy III 
- geny dla 5S rRNA wewnątrz sekwencji kodującej – Box A, Box C 
- geny dla tRNA wewnątrz sekwencji kodującej – Box A, Box D 
- gen dla U6-snRNA – PSE i TATA, pod sekwencją kodującą 
 
Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA III 
Gen dla tRNA 
A-Box, B-Box → dołączają się czynniki TFIIIC → dolącza się TFIIIB: kompleks z 3ech białek: 
TBP, BRF, B

cośtam

 → dołącza się on przed A-Boxem, dołącza się polimeraza III 

 
Dojrzewanie pre-tRNA 
Modyfikacja chemiczna nukleotydów  
Urydyna → rybotymidyna (T) 
 
Splicing pre-tRNA 
Splicing tRNA oddzielnych aktywności nukleazy i ligazy. Wiązania ekson-intron są wycinane 
przez nukleazę, tworząc 2', 5'-cykliczny fosforan i koniec 5'-OH. 
 
Terminacja transkrypcji genów eukariotycznych  
- terminacja transkrypcji genów grupy I 
(?znowu nie mogę doczytać?) dołączenie się PTRF powoduje oddysocjowanie polimerazy i 
transkryptu od matrycy DNA  
- terminacja transkrypcji genów grupy II – związana z poliadenylacją końca 3' transkryptu 
- terminacja trankrypcji genów grupy III – transkrypt odcinany przez polimerazę 
 
Inhibitory transkrypcji w komórkach eukariotycznych: 
 
a-amanityna – wiąże się do RNAPII w pobliżu centrum katalitycznego, jest nieodwracalnym 
inhibitorem, gdyż uruchamia degradację największej podjednostki RNAPII do której się wiąże 
(inhibitor bardzo selektywny ale powoli działający) 
 
aktynomycyna-D – interkalator, wiąże się się do DNA w regionach bogatych w geny G-C 
uniemożliwiają wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA (inhibitor szybko 
działający, malo selektywny) 
 
DRP-(5,6-dichloro-1-beta-Ribo-furanosyl-Benzimidazole) – hamuje elongację transkrypcji 
katalizowaną przez RNAPII, ponadto upośledza dojrzewanie rRNA (inhibitor szybko działający 
lecz mało selektywny) 
 
Flavopiridol – jw. 
 
Tryptolid – izolowany z rośliny Trypterygium wilfordii (?polskiej nazwy nie doczytam?) 
stosowanego w tradycyjnej medycynie chińskiej hamuje inicjację transkrypcji prowadzoną przez 
RNAPI i RNAPII. 
 
Model kompleksu poru jądrowego (NPC ang. nuclear pore complex) 

- cytoplazmatyczne filamenty – dołączone do cytoplazmatycznego pierścienia 
- cytoplazmatyczny pierścień w zewnętrznej błonie 
- spoke-ring assembly (?) - kompleks poru jądrowego, w błonie jądra (transbłonowy) 
- na środku pierścień środkowy – łączy poszczególne elementy 
- w środku pierścienia środkowego centralny transporter – transbłonowy, centralny kanał (? dalej 
nie mogę rozczytać?) 
- do wewnętrznej błony jądrowej zakotwiczony pierścień jądrowy 
- do tego doczepiony jądrowy koszyk (kosz) 
 
NPC kręgowców zbudowane są z około 30 różnych białek z nukleoporynami, które występują w 8 
lub 16 (czasem nawet 32) kopiach na NPC 
 
Nukleoporyny (nups) podzielono na trzy klasy 
FG – zawierają domeny bogate w powtórzenia Phe-Gly zaangażowane w translokację receptorow 
transportu 
nukleoporyny pozbawione domen FG; stanowią elementy strukturalne NPC 
nukleoporyny należące do białek błonowych, zakotwiczają NPC w blonie jądrowej. 
 
Transport przez kompleks poru jądrowego 
 
Transport aktywny: 
RNA/białko rozpoznawane i wiązane z receptorami transportu → wiązanie kompleksu transportu 
z NPC i translokacja przez kanał centralny → uwolnienie RNA/białka z kompleksu transportu  
Przejście przez poryny wiąże się z dostarczeniem energii (rozkładem GTP) 
 
Karioferyny – pojedyncza rodzina receptorów transportu  
- importyny 
- eksportyny 
 
Rozpoznają bezpośrednio lub pośrednio z udziałem cząsteczek adaptorowych (?) krótki peptyd 
sygnalny na transportowanym białku tj. sygnał lokalizacji jądrowej (NLS – ang. nuclear 
localization signal) lub sygnał eksportu jądrowego  (NES – ang. nuclear export signal) 
Jądro: Ran-GDP → 

RanGEF  (Ran-GDP-exchange  factor)

 → Ran-GTP 

Cytoplazma: Ran-GTP → 

RanGAP  (Ran-GTPase-deactivating  protein)

 → Ran-GDP 

 
 
Karioferyny - specyficzne receptory transportu przez błony jądrowe: eksportyny i importyny, 
wymagają białka Ran z GDP/GTP, w jądrze przewaga Ran-GTP, w cytoplaznie przega Ran-GDP  
 
Import 
Białka które są transportowane do jądra posiadają sekwencję NLS, czyli miejsce lokalizacji 
jądrowej, sekwencja ta wiąże się z importyną, powstaje taki kompleks transportu, przechodzi on 
przez kompleks poru jądrowego do jądra 
Do kompleksu bialko-importyna w jądrze przyłącza się Ran-GTP – oddyscjowanie białka, 
importyna połączona z Ran-GTP powraca poryną do cytoplazmy 
W białku działa Ran GAP (hydrolaza GTP związanego z Ran) daje energię do rozdysocjowanie 

kompleksu 
 
Eskport 
Białka ma sekwencję NES (sygnał eksportu jądrowego) – sekwencja ta łączy się z eksportyna i z 
bialkiem Ran-GTP, tworzy się potrójny kompleks, przechodzi przez porynę w cytoplazmie białko 
Ran GAP, rozdysocjowanie eksportyny, białka, Ran-GDP + Pi. Eskportyna przechodzi z 
powrotem przez por jądrowy. 
 
Szlaki eksportu RNA 
 
tRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → wiązanie z exp-t 
i Ran-GTP, przez pory przechodzą do cytoplazmy 
 
mRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązaniez czynnikami transportowymi → wiązanie z exp -5 
i Ran-GTP → transport przez por do cytoplazmy 
 
snRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie zczynnikami transportowymi → wiązanie z 
białkami CBC, PHAX, CRM1, Ran-GTP – transport przez por do cytoplazmy. 
 
mRNA – nie wymaga białka Ran-GTP → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami 
transportowymi → mRNA przechodzi przez por jako kompleks białkowy, do tego dowiązują się 
inne białka 
 
Etapy translacji 
- inicjacja 
- elongacja – rosnący polipeptydowy łańcuch aminokwasów połączonych wiązaniem połączonych 
wiązaniem peptydowym 
- terminacja 
 
Rola tRNA w translacji 
mRNA → do niego lączy się antykodonem tRNA → do tRNA przyłączony aminokwas 
 
kodon glicyny: GGA → do niego dołącza  się tRNA

Gly

 z dołączoną Gly (glicyną) 

 
Budowa tRNA 
ramię akceptorowe (koniec 5' i 3') → na końcu 3' ostatni nukleotyd A → tam dołącza się 
aminokwas; miejsce konserwatywne CCA (?) 
ramię D – zawiera dihydroksyurydynę (decyduje o tym jakie aminokwasy mogą się dołączyć do 
danej cząsteczki tRNA) 
ramię T

Ψc  – tymina, pseudourydyna, cytozyna 

ramię C 
ramię antykodonowe – po ramieniu C 
trójka nukleotydów – anty-kodon – komplementarne do kodonu, dołącza się do odpowiedniego 
kodonu na matrycy mRNA 
między antykodonowym a  TΨc ramię zmienne – w tRNA I klasy (??) 3-5 nukleotydów, w II 
klasy 13-21 nukleotydów 

 
tRNA izoakceptorowe – kilka typów tRNA oddziałujące z jednym aminokwasem  
 
Mechanizm aminoacylacji  
Etap 1: aktywacja aminokwasu 
aa + ATP ↔ aa~AMP + PPi 
Etap 2: Przenoszenie grupy aminoacylowej na tRNA 
aa~AMP + tRNA ↔aa-tRNA + AMP 
 
Syntetaza aminoacylo~tRNA wiąże aminokwas i ATP → dołącza do aminokwasu AMP, wytwarza 
się PPi → rozkłada na 2PO

4

2- 

→ następnie chwyta tRNA i łączy z zaktywowanym aminokwasem, 

wypuszcza AMP  
 
tRNA łączy się z aminokwasem przez adeninę na końcu ramienia akceptorowego 
 
Charakterystyczne cechy syntetaz aminoacylo-tRNA 
 
Cecha  

 

 

Enzymy klasy I 

Struktura centrum 

 

Równoległa harmonijka β 

aktywnego enzymu 
Oddziaływanie z tRNA 

mniejszy rowek  

 
Nietypowe przykłady aminoacylacji → do tRNA przyłączony jest inny aminokwas, który dopiero 
potem jest modyfikowany np. Bacillus, tRNA przyłączający glutaminę → przy łącza się kwas 
glutaminowy → modyfikacja w glutaminę 
metionina → N-formylometionina 
seryna → selenocysteina 
 
Oddziaływanie kodon-antykodon 
 
3' 36-35-34 5' – antykodon tRNA 
5' 1  - 2 – 3 3' – mRNA 
 
Działanie komplementarności par zasad na pozór (?), zasada tolerancji Cricka 
''Pierwsza zasada od 5'-końca antykodonu moŻe z pierwszą i drugą zasadą kodonu tworzyć 
tylko właściwe pary, natomiast z trzecią zasadą kodonu - nawet trzy róŻne pary. Oddziaływanie 
tego rodzaju między pierwszą zasadą antykodonu i trzecią kodonu jest znane pod nazwą: zasada 
tolerancji Cricka.'' 
→ oddzialywanie między III nukleotydem kodonu a pierwszym antykodonu → oddziaływanie 
natywne (?), nie musi być kanoniczne: 
G-U 
Inozyna (zmodyfikowana puryna) – może oddziaływać z A, C  lub U 
→ dzięki temu jeden antykodon może oddziaływać z różnymi kodonami 
61 kodonów – ok. 30 antykodonów 
 
Budowa rybosomu 

Rybosom 70S – prokariota 
2500000 Da  
a) podjednostka 50S 
- 23S rRNA – 2900 nukleotydów 
- 34 białka 
-5S rRNA – 120 nukleotydów 
b) podjednoska 30S  
– 21 białek 
- 16S rRNA – 15400 nukleotydów 
 
Rybosom 80S – eukariota 
4200000 Da 
a) podjednostka 60S 
- 28S rRNA – 4700 nukleotydów 
- 48 białek 
- 5S rRNA – 120 nukleotydów 
b) 40S 
- 18S rRNA 
- 32 białka 
 
Porównanie rybosomu bakteryjnego, drożdżowego i ludzkiego 
40S drożdży → dużo białek dodanych 
40S człowieka → kilka białek dodanych 
głowa 
dziób 
platforma 
ramię 
ciało  
ostroga 
w dużej podjednostce u człowieka więcej białek dodanych niż w drożdżowej 
 
Miejsca wiązania tRNA na rybosomie 
 
Duża podjednostka 
Miejsce A  - aminoacylowe - tkwi na dużej podjednostce 
Miejsce P – inicjatorowy tRNA podczas inicjacji, cząsteczki tRNA dołączają się do mRNA, 
miejsce peptydowe 
Miejsce E – exit → tu się przesuwa cząstki (tRNA) przed odłączeniem ich od rybosomu  
 
Mała podjednostka 
- miejsce dekodujące na małej podjednostce, oddziaływanie między kodonem a antykodonem 
 
Centrum peptydylo-transferazy – dochodzi do tworzenia się wiązania peptydylowego między 
aminokwasem aminoacylotRNA w miejscu a a łańcuchem polipeptydowym w miejscu P.  
 
Nagroda Nobla z chemii 2009  

„za badania struktury i funkcji rybosomu” 
 
Biogeneza rybosomu drożdżowego  
Proces skomplikowany, dużo dodatkowych białek bierze udział, jąderko, nukleoplazma, 
cytoplazma  
→ transkrypcja RNA → pre-rRNA ulega cięciom, dołączają się pierwsze białka → 90S pre-
rybosom  
→ podział na 2 podjednostki: 
pre-40S i pre-50S, kolejne cięcia  w rRNA, białka rybosomalne dołączają się → w cytoplazmie 
końcowy etap dojrzewania 
 
Translację jednej cząsteczki mRNA może prowadzić jednocześnie kilka rybosomów, co znacznie 
zwiększa wydajność wykorzystywania mRNA 
 
cząsteczka mRNA od 5'AUG do UAA 3' – wzdłuż niej siedzą sobie rybosomu, każdy syntetyzuje 
polipeptyd, wolny N-koniec, powstaje wiele polipeptydów w jednym czasie, rybosomy przesuwają 
się od końca 5' do 3', na końcu 3' wypuszczają wolny polipeptyd/białko 
 
Struktura mRNA  
Prokariotyczne mRNA 
 
5'UTR (miejsce nieulegające translacji)|białko 1||białko 2||białko 3||UTR 3' 
wiele miejsc inicjujących start translacji (dla każdego białka oddzielne) 
 
Eukariotyczne mRNA 
5'm

7

G UTR-jeden kodon start dla translacji- białko 1 - UTR -AAAA 3' 

przy końcu 5' guanozyna zmetylowana w pozycji 7 – czapeczka; przy końcu 3' ogon 
poliadenylowy 
 
Bakteryjne miejsce wiązania rybosomu 
AGGAAGGU – RBS – rybosome binding site – na mRNA 
UCCUCCA – 12S rRNA – sekwencja Shine-Dalgarno 
 
Inicjacja translacji u E.coli 
IF – ang. initiation factor 
 
Inicjacja inna u bakterii, inna u eukariotów 
 
Mała podjednostka rybosomalna 

IF 

 

 

 

 

30S 

IF1 IF2 IF3 

Inicjatorowy tRNA – fenylometionylotRNA 
mRNA, który ulega translacji 
 
Rybosom – przyłączenie IF1, IF3 powoduje dosocjację podjednostek uniemożliwiającą 
przyłączenie dużej podjednostki  
→ do kompleksu dołącza się mała podjednostka + IF + IF3,  

przyłącza się formylometionylotRNA, mRNA,czynnik IF2 związany z GTP, przyłączają się 
przypadkowo, następnie zmiany konformacji  → kompleks inicjacyjny 30S → oddysocjowanie 
czynników IF1 i IF3 → hydroliza GTP związanego z IF2 → oddysocjowanie czynnika IF2 → 
oddysocjowanie tych wszystkich czynników umożliwia dołączenie się dużej podjednostki → 
kompleks inicjacyjny 60S 
 
Inicjacja u eukariotów  
Inicjacja translacji u Eukariota 
eIF – ang. eukaryotic initiation factor > 10, niektóre z nich składają się z kilku podjednostek  
 
Przyłączanie kompleksu preinicjacyjnego do mRNA 
kompleks preinicjacyjny 
inicjatorowy tRNA – metionylo-tRNA z dołączonym eIF2 związanym z GTP – mała podjednostka 
rybosomu – 3-eIF-3 → inicjatorowy kompleks translacyjny (?), miejsce regulacji translacji u 
eukariotów, konserwatywny (?) 
 
Mechanizmy transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów przy udziale RNA 
 
Regulacja ekspresji genów przy udziale ryboprzełączników (ang. riboswitch) 
Ryboprzelącznik- ustrukturyzowany fragment mRNA, znajdujący się na końcu 5' w częscie nie 
ulegającej translacji (nie zawierającej sekwencji kodującej białko. Ma on dwa fragmenty: aptamer, 
mogący wiązać specyficzny ligand i platformę ekspresyjną. Wiązanie ligandu w aptamerze 
powoduje zmianę w platformie ekspresyjnej tak, że transkrypcja nie zachodzi. 
A – hamowanie tranksprypcji - jeżeli aptamer nie ma związanego ligandu, platforma ekspresyjna 
tworzy struktura zwaną anty-terminatorem – spinka do włosów w dół, nie przeszkadza to w 
transkrypcji 
jeżeli aptamer zwiąże ligand, anty-terminator przekształca się w terminator, spinka do włosów w 
górę, transkrypcja nie zachodzi 
B – hamowanie translacji – w platformie ekspresyjnej siedzi RBS – białko wiążace rybosom, tak 
dowiązuje się rubosom i rozpoczyna translację 
jeżeli ligand wiąże się z aptamerem zmiana konformacji RNA tak że RBS staje się niedostępne  dla 
rybosomu – translacja nie zachodzi. 
Regulacja przy udziale ryboprzełączników wiążących TPP (pirofosforan tiaminy) – niezbedna 
substancja dla metabolizmu cukrowego 
mRNA – białka wiążące TPP (receptory) są wiązane przez mRNA związane z syntezą i 
transportem  TPP, jeżeli TPP jest obficie w po|zywce wtedy synteza własnego bylaby stratą 
energii, dlatego mamy mechanizm hamujący wtedy transkrypcje. 
Jeżeli stężenie TPP jest małe – komórka musi dosyntetyzować → mRNA 5'-ryboprzełącznik z 
aptamerem i miejscem wiązanie rybosomu, dołącza się rybosom, translacja regionu kodującego, 
wtedy gen działa → zwiększa się poziom TPP, dolącza do ryboprzełącznika (aptameru) – miejsce 
wiążące rybosom niedostępne – translacja nie zachodzi, gen wyłączony. 
 
Mechanizmy potranslacyjnej represji genów przez ncRNA w komórkach bakteryjnych. 
 
Mamy mRNA z miejscami wiązania rybosomu, przyłączają się rybosomu, jeżeli jest tam snRNA 
wiąże się z sekwencją RBS – 'przykrywają ją' – uniemożliwiając wiązenie rybosomów, jeżeli takie 

snRNA się dowiąże to zaraz wpada Rnasa (E, III) i tnie mRNA powodując jego degradację. 
 
Interferencja RNA – mechanizm kontroli ekspresji genów u Eukariota 
 
Interferencja RNA (RNAi) to zachowawczy ewolucyjnie mechanizm wyciszenia ekspresji genów 
przez małe cząsteczki RNAo długości ~ 20-30 nukleotydów 
Funkcją maszynerii RNAi jest m.in. ochrona genomu przed wirusami, hamowanie przemieszczania 
się do transpozonow wewnątrz genomu, regulacja aktywności genów. 
 
Historia odkrycia interferencji RNA 
Pierwszych dowodów na wyciszanie RNA dostarczyły w 1990 roku badania zespołu R. Jorgensena 
nad modyfikacją koloru kwiatów petunii 
 
Wprowadzenie transgenu – dodatkowej kopii genu syntazy chalkonowej – syntaza chalkonowa 
odpowiedzialna za produkcję antyocyjanów – myslał, że więcej genów będzie powodowało 
nadekspresję i ściemnienie kwiatów – wynik nietypowy, czesci kwaitów pstrokata purpurowo- 
biała a część w ogóle biała. 
Sytuację, w której wyciszeszniu ulega zarówno własny gen jak iw prowadzony nazywamy 
kosupresją. 
 
S. Guo i K. Kemphues użyli antysensownego RNA aby specyficznie inaktywować gen zwany par-1 
u Caenorhabditis elegans (1995 r) 
Dna → na jego matrycy mRNA –> do niego dołącza się komplementarny antysensowny framgent 
RNA → rybosom nie może się po tym fragmencie przesuwać → translacja nie zachodzi. 
 
Caenorhabditis elegans 
Pierwszy podzial zygoty w trakcie embriogenezy jest asymetryczny → odpowiada za to gen PAR -
1. 
 
Wprowadzenie antysensownego RNA kinazy PAR-1 spowodowało zanik aktywności tego białka. 
Pierwszy podział był symetryczny. 
 
Ku zaskoczeniu badaczy ten sam efekt obserwowano po wprowadzeniu sensownego RNA! - a 
miala to być próba kontrolna. 
 
Przełom w wyjaśnieniu teg zjawiska – badania Andrew Fire'a i Craiga Mello opublikowane w 
Nature w 1998 r. 
 
C. elegans typu dzikiewgo→ mutageneza delecyjna genu unc-22 → fenotyp twitcher (kurczenia 
ciała_ spowodowany unieczynnieniem genu unc-22 (delecja unc-22), co powoduje utrate kontroli 
nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang. uncoordinated 
 
po wprowadzeniu sensownego RNA – brak efektu 
po wprowadzeniu antysensownego RNA → brak efektu 
po otrzymaniu dwuniciowego (ds) RNA → fenotyp twitcher. 
Analiza ilościowa mRNA genu unc-22 

Tam gdzie nie było efektu fenotypu ilośc mRNA była stabilna i zbliżona do typu dzikiego 
Tam gdzie był twitcher mRNA było na bardzo niskim poziomie lub niewykrywalne 
 
Wniosek: dsRNA powoduje wyciszenie endogennego genu – nazwano do zjawisko interferencją. 
 
Wnioski płynące z badań nad C. elegans. 
 
- Mechanizm RNAi jest bardzo specyficzny (wprowadzony do komórki dsRNA) o sekwencj i 
odpowiadającej fragmentowi endogennego genu, wycisza tylko ten mRNA); 
 
- dsRNA musi zawierać sekwencje odpowiadające dojrzałemu mRNA aby wywołaś efekt RNAi 
(dsRNA zawierający sekwencje intronowe lub promotorowe nie wywołuje odpowiedzi);  
 
- wyciszenie przebiega postranskrypcyjnie, prawdopodobnie na terenie cytoplazmy; 
 
- do wywołania RNAi wystarczy obecność zaledwie kilku cząsteczek dsRNA, co gueruje działanie 
mechanizmu amplifikujacego cząsteczki dsRNA i/lub katalitycznego 
 
- RNAi może być przydatnym narzędziem w genomice funkcjonalnej organizmów eukariotycznych. 
 
W jaki sposób dwuniciowe cząsteczki RNA wywołują wyciszanie docelowego mRNA? 
 
A. J. Hamilton i D.C Baulcombe, jako pierwsi (1999r.) pokazali, że w potranskrypcyjne 
wyciszanie genów u roślin (PTGS) są zaangażowane krótkie, 25-nukleotydowe dsRNA 
 
Mechanizm interferencji RNA – badania nad Drosophila melanogaster 
 
dsRNA – obcy dwuniciowy RNA bedący składnikiem RNA → muszki potrafią go zniszczyć.  
Bierze w tym udział występująca u eukariotów rybonukleaza Dicer → dsRNA jest cięte na siRNA 
i inaktywowane 
siRNA – małe, interferujące RNA, dwadzieścia kilka nukleotydów, specyficzne, dwa końce 
niezwiązanie na nici jednej z jednej strony, dwie z drugiej – lepkie końce 
Dolączają się białka – argonauta i inne, tworzy się RISC (an.g RNA-induced silencing complex)  
siRNA zostaje rozwinięte, jedna nić zostaje pocięta czyli zdegradowana,a  druga wiąże się z 
komplementarnym RNA i powoduje jego degradację, tną nam to nukleazy gdzie jest zaznaczone 
siRNA. 
 
Proces RNAi przebiega w szczegółach nieco inaczej u roślin, grzybów, bezkręgowców i 
kręgowców. Odpowiednio też u roślin proces ten często nazywa się potranskrypcyjnym 
wyciszaniem genów – PTGS (ang. postrtranscriptional gene silencing), tłumieniem genów u 
grzybów (ang. quelling) i RNAi u zwierząt. 
 
Obecnie wiadomo, że małe RNA są kodowane przez genomy eukariotyczne. Ze względu na 
mechanizm biogenezy i typ białek Argonaute (Ago) z któryi są zasocjowane dzielimy je na trzy 
klasy: 
 

- siRNA (~21 nt): endo-siRNA i exo-siRNA 
 

 

 

 

 

 

→ oddziałuja z białkami Ago 

- miRNA (microRNA, ~22nt) 
 
- piRNA (~24-31 nt) – RNA oddziałujące z białkami Piwi 
 
miRNA – regulatory ekspresji mRNA w komórkach zwierzęcych i roślinnych 
 
- Regulują ekspresję genów poprzez hamowanie ekspresji mRNA (uważa s ię, że ekspresja ok. 10-
30% genów kodujących białka w komórkach zwierzęcych jest regulowana przez miRNA)  
 
- odkryte w 1993 roku (lin-4 u C.elegans) 
 
Biogeneza miRNA 
w jądrze mamy geny je kodujące, czasem są to introny, RNA pol II/II transkrypuje, mamy pri -
mikroRNA → tniemy, powstaje pre-mikroRNA, eksportyna 5  i Ran-GTP dowiązuje sie, 
transportowane do cytoplazmy → cięcie Dicerem w kompleksie z TRBP 
 
Zasady oddziaływania miRNA – mRNA 
 
Sekwencja kodująca – koniec 3' UTR – koniec poliadenylowy,  
Do fragmentu 3' UTR dołącza się miRNA w kompleksie białkowym na zasadzie 
komplementarności – komplementarność pełnia u roślin, u zwierząt tylko niektóre nukleotydy (od 
2 do 8 nukleotydu i potem znowu) 
 
Wyciszanie ekspresji genów 
a) transkrypcyjne wyciszanie genów (ang. transcriptional gene silancing – TGS) → modyfikacja 
chromatyny ->brak transkryptu RNA 
b) potranskrypcyjne wyciszanie genów (ang. post-transciptional gene silencig-PTGS) 
- zahamowanie translacji 
- degradacja mRNA 
 
RNAi jako narzędzie badawcze 
Jeżeli wprowadzimy dwuniciowe RNA i wyciszymy dany gen możemy po obserwacji fenotypu 
wnioskować o jego funkcji 
gotowe wektory ekspresji RNAi → do jądra, tam powstaje RNAi, możemy tez od razu 
zsyntetyzować RNAi de novo w wyniku syntezy chemicznej i wprowadzić do komórki  gotowe 
 
Zastosowanie technologii malych RNA w rolnictwie 
wyciszanie genów sluży do eliminacji elrgenów z orzeszków ziemnych 
kontrola szkodników,  
 
Zastosowanie technologii małych RNA w terapii chorób u człowieka 
Schorzenie 

 

 

 

Etap 

AMD (starcze zwyrodnienie plamki) II faza badań klinicznych 
Cukrzycowy obrzęk plamki (DME)  II faza badań klinicznych 

RSV (wirus zapalenia oskrzeli) 

II faza badań klinicznych 

 
Aktywacja RNA (ang. RNA activation, RNAa) 
Pierwsze doniesienie o istnieniu mechanizmu RNAa – 2006r. → aktywacja ekspresji genów za 
pośrednictwem małych dsRNA zwanych saRNA (ang, small activating RNA) → saRNA są 
komplementarne do pewnych regionów promotorowych DNA i aktywują transkrypcję DNA ok. 
10-krotnie 
 
Molekularne podstawy chorób nowotworowych 
 
Biologia molekularna nowotworu  
* onkos (z greckiego) – masa, guz; logos – nauka → ONKOLGIA 
* nowotwór (łac. nieoplasma) – nieprawidłowy  i nadmierny rozrost tkanki ustroju, 
nieskoordynowany z pozostałymi tkankami, trwający mimo ustapienia czynnika, który go wywołał. 
 
Nowotwór łagodny – komórki rozrastające się tworzą pojedyczny guzek, otorbiony, który 
powiększa stopniowo swój rozmiar i rozpycha okoliczne tkanki, nie dając przrzutów. Takimi 
nowotworami są np. tłuszczaki, wywodzące się z tkanki tłuszczowej. Występują w tkance 
podskórnej pod postacią miękkich, ruchomych guzków. 
 
Nowotwor złośliwy – nowotwór rozrastający się w sposób naciekający – wnika między komórki 
prawidłowej tkanki. Nie ma wyraźnej granicy między nowotworem złośliwym a łagodnym.  
 
* rak – nowotwór złośliwy wywodzący się z tkanek  nabłonkowych – skóry, płuc , piersi, trzustki, 
wątroby, innych narządów, jest najczęściej  spotykanym nowotworem złośliwym; w literaturze 
anglosaskiej i popularnie synonim nowotworu złośliwego (ang. carcinoma) 
* mięsak – rodzaj nowotworu złośliwego, który powstaje z tkanki mięśniowej, tłuszczowej i 
chrząstki 
*chłoniak – nowotwór złośliwy powstający wukladzie limfatycznym 
 
Nowotwór złośliwy miejscowo – mają niektóre cechy nowotworów złośliwych, ale nie dają 
przerzutów, lub mają histologiczne cechy nowotworu łagodnego a często dają nawroty. Należą do 
nich: 
- rak podstawnokomórkowy skóry 
- większość glejaków złoźlwych mózgu 
- guz mieszany ślinanek 
 
Nowotwór jest chorobą o podłożu genetycznym rozwijający się w wyniku zmian w różnych genach 
o charakterze: 
- mutacji – dotyczą następujących genów 
* protoonkogeny (mutacja powoduje ich aktywację – onkogeny) 
* geny supresorowe (mutacja powoduje ich inaktywację) 
* geny naprawy DNA (mutacja powoduje niestabilność genetyczną) 
* geny microRNA (mutacja powoduję zmianę ekspresji białek) 
- zaburzeń epigenetycznych, np. hipermetylacji genów 
 

Mutacje genowe zwiększające ryzyko rozwoju nowotworu  
a) dziedziczne  
b) nabyte  
- spontaniczne 
- działanie czynników środowiskowych 
 
Pojedyncza mutacja nie powoduje transformacji nowotworowej 
 
Zmiany  

Zwiększona ilość 

 

Wzrost polipa  

Wzrost złośliwego 

komórkowe:  podziałów komórkowych 

 

 

 

guza (carcinoma) 

ZmianyZaktywowany   

gen supresorowy 

drugi gen 

DNA:   

onkogen 

 

 

guza    

 

supresorowy  

 

 

 

 

 

 

zinaktywowany 

guza zinaktywowany 

Nowotów nie jest chorobą dziedziczną, dziedziczą się predyspozycje do zachorowania.  
 
Predyspozycje genetyczne można podzielić na  
- predyspozycje silne – związane z dziedziczonymi od rodziców zmianami (najczęściej mutacjami) 
w genach supresorowych i genach naprawy DNA 
 
Nazwa zespołu 

 

 

Gen 

Typ nowotworu 

Zespół siatkówczaka   

 

RB1  siatkówczak, mięsaki 

Polipowatość gruczolakowata jelit  APC  rak jelita grubego, kostniaki 
Zespół Blooma 

 

 

BLM  białaczki, chłoniaki  

 

 

 

 

 

 

i gruczolakoraki układu  

 

 

 

 

 

 

pokarmowego 

Zespół Li-Fraumeni   

 

TP53  mięsaki, glejaki, rak piersi, rak 

 

 

 

 

 

 

kory nadnerczy 

Dziedziczny niepolipowaty   

 

rak jelita grubego, trzonu 

rak jelita 

 

 

 

 

macicy, moczowodu  

 

 

 

 

 

 

i miedniczki nerkowej 

 
Etapy karcynogenezy 
Przekształcanie się komórki prawidłowej w nowotworową nazywamy transformacją nowotworową. 
To złozony proces w którym można wyodrębnić cztery etapy 
 
ETAP I 
Preinicjacja 
Ekspozycja na karcynogeny: chemiczne, fizyczne, biologiczne 
Chemiczne: związki alkilujące, barwniki akrydynowe, wielkopierścieniowe węglowodory 
aromatyczne 
Fizyczne: promieniowanie UV 
Biologiczne: wirusy (HPV, Epstein Barr, HCV typu B, Herpesvirus) 
 

          bakterie (Helicobacter pylori) 

Trwa całe życie 
 
ETAP II 

Inicjacja 
Ngromadzenie zmian prowadzących do transformacji  
Trwa od kilku do 20-30 lat 
Tor mutacyjny 
Predyspozycje genetyczne 
 
ETAP III 
Promocja 
Selekcja klonalna 
Nowotwór in situ 
Trwa zwykle do kilku lat  
 
Etap III nieleczony zawsze przechodzi w ETAP IV 
Progresja 
Dalsza selekcja mutacji 
Nowotwór nabywa zdolność do przerzutowania 
Trwa od kilku miesięcy do kilku lat 
 
„Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku” 
 

http://www.onkologia.org.pl/

 

 
Spośród 100 typów nowotworów rozpoznawanych każdego roku, zaladwie kilka stanowi aż 60 
proc. wszystkich zachorowań. 
U mężczyzn dominuje rak: pluca (20 proc.), gruczołu krokowego (14 proc.), jelita grubego (7 
proc.), pęcherza moczowego (7 proc.) oraz żołądka (5 proc.) 
U kobiet dominują rak: piersi (23 proc.), płuca (9 proc.) , trzonu macicy (7 proc.), jelita grubego 
(6 proc.), jajnika (5 proc.) 
 
Rak zaczyna powstawać wówczas, gdy komórka wyłamuje się z mechanizmów regulujących jej 
podziały i degradację. 
 
Cykl komórkowy a transformacja nowotworowa  
 
M (profaza, metafaza anafaza,  telofaza) → G0 – zatrzymanie podziałów i końcowe róznicowanie  
 
Czas trwania cyklu komórkowego 
 
Typ komórek   

 

 

Czas trwania cyklu komórkowego 

Komórki embrionalne żaby   

30 minut 

Komórki drożdży piekarniczyc 

1,5- 3 godziny 

Komórki nabłonka jelit 

 

~ 12 godzin 

Ssacze fibroblasty 

 

 

 

 
Układ kontroli cyklu komórkowego „włącza” replikację i mitozę oraz sprawdza, czy poprzedni 
etap cyklu został zakończony, czy komórka jest w pełni przygotowana do następnego etapu  

 
Punkty kontrolne cyklu komórkowego – punkty kontrolne G1 i G2. 
 
Programator cyklu komórkowego: M → G1 → S → M  
 
wejście w fazę S – punkt kontroli G1: 
czy środowisko jest sprzyjające? 
czy DNA jest uszkodzony? 
 
Kontrola cyklu komórkowego oparta jest na zmianach w aktywnościa kinaz zleżnych od cyklin 
Cdk (ang. cyclin - dependent kinase) 
 
U ssaków poszczególne etapy cyklu komórkowego są regulowane przez cztery różne kinazy 
zależne od cyklin 
 
Kompleks cyklina-Cdk 

Cyklina 

Partner Cdk 

G1-Cdk 

 

 

cyklina D* 

Cdk 4, Cdk 6 

G1/S-Cdk 

 

 

cyklina E 

Cdk 2 

S-Cdk  

 

 

cyklina A 

Cdk 2 

M-Cdk 

 

 

 

cyklina B 

Cdk 1 

 
* U ssaków są 3 różne cykliny D 
 
Cykliny są pozytywnymi regulatorami kinaz zależnych od cyklin, a ich poziom zmienia się w 
czasie cyklu komórkowego. 
 
Do pełnej aktywności Cdk niezbędna jest fosforylacja aktywująca 
 
Cdk + cyklina + CAK (kinaza aktywująca) →kompleks CAK-Cdk → aktywny kompleks  Cdk-
cyklina 
 
Aktywność Cdk może być hamowana przez fosforylację oraz przyłączanie białek inhibitorowych.  
 
Cdk ufosforylowana jedną resztą fosforanową – aktywna, tworzy kompleks z cykliną, może być 
jeszcze ufosforylowana  fosfatazą Cdc25 i wtedy jej aktywność jest zahamowana  – druga reszta 
fosforanu dziala hamująco. Podwójnie ufosforylowana Cdk może być zdefosforylowana do formy 
aktywnej przez kinazę Wee1 
 
Aktywność Cdk jest regulowana przez degradację cyklin. 
 
Połączenie różnych Cdk z cyklinami uruchamia kolejne zdarzenia w komórce  
 
* Zaburzenia w transmisji sygnałów wzrostu – onkogeny 
(pedał gazu w samochodzie się zaciął wciśnięty!) 
 
* utrata zdolności do rozpoznawania sygnałów antywzrostowych – geny supresorowe 

(hamulce przestaly działać) 
 
* zaburzenia w systemach naprawy DNA – geny stabilizujące 
(mechanik nic nie warty!) 
 
Protoonkogeny – stymulują wzrost komórek → nadmierna aktywność → onkogeny → powstanie 
nowotworu 
 
DNA protoonkogenu 
a)mutacja w genie onkogenu → hiperaktywne białko w normalnej ilości 
b) zwielokrotnienie kopii genu → normalne białko w nadmiarze 
c) gen przenoszony do nowego locus na DNA pod innymi mechanizmami  kontroli – nowy 
promotor → normalne białko w nadmiarze 
 
Onkogen jest dominujący w stosunku do swojego prawidłowego allela. 
 
Funkcje białek kodowanych przez protoonkogeny  
- czynniki wzrostowe np. PDGF (ss) 
- receptory czynników wzrostu 
np. receptor EGF (erbB) 
↓ 
Src(src) – Ras (ras)- Raf(raf) 
- kinazy białkowe lub białka aktywujące kinazy białkowe, cdk 
- cykliny – białka które kontrolują cykl komórkowy np. cyklina D 
 
Geny supresorowe (anty-onkogeny) hamuja rozwój komórek → mutacje powodujące zmianę 
funkcji → powstawanie nowotworu 
 
* do powstania nowotworu dochodzi, gdy dwie niezależne mutacje unieczynniają oba allele 
supresora 
* o „predyspozycji genetycznej” do nowotworu mówimy, gdy jeden z dziedziczonych alleli jest już 
uszkodzony 
* dwa najlepiej scharakteryzowane geny supresorowe nowotworów to geny kodujące białko p53  
 
Białko p53 „strażnik genomu” 
 
przed zmianą genomu → foton UV → po – dimery tymidynowe 
→ aktywacja p53 w komórkach opalonej na czerwono skóry → dwa możliwe efekty: 
* zahamowanie cyklu komórkowego 
* naprawa DNA umożliwia wznowienie cyklu komórkowego 
lub 
* apoptoza 
* komórka umiera 
 
Mechanizm regulacji cyklu komórkowego przez p53  punkcie restrykcyjnym G1/S 
 

promienie X → uszkodzenie DNA → aktywacja kinazy białkowej i fosforylacja p53: 
Mdm

2 

+ p53' → Mdm

2

 + aktywne, stabilne p53 

(w przypadku, gdy do uszkodzenia DNA nie dochodzi, p53' nie jest fosforylowane i ulega 
degradacji w proteasomach) 
Aktywne p53 wiąże się do regionu regulatorowego genu p21 
Transkrypt genu p21 + aktywne p53 → translacja genu p21 → powstaje p21 (inhibitor białka 
Cdk) 
Ufosforylowane,aktywne G1/S – Cdk i S-Cdk + p21 → nieaktywne, skompleksowane z p21 
C1/S-Cdk i S-Cdk 
 
Apoptoza – prgramowana śmierć komórki 
Etapy apoptozy: 
kondensacja chromatyny i kurczenie się komórki → fragmentacja DNA → rozpad jądra → 
tworzenie ciałek apoptotycznych 
 
Infekcja a nowotworzenie  
Bakterie: 
- Helicobacter pylori (rak i chłoniak żołądka) 
- Chlamydia (chłoniaki) 
- Fusobacterium nucleatum (rak jelita grubego i odbytu) 
Pasożyty: 
- przywra krwi (rak pęcherza moczowego) 
- motylica wątrobowa (rak przewodow żółciowych) 
Wirusy: 
-Epstein Barr Virus (chłoniak Burkitta, rak nosogardła) 
- HPV 16, 18, 31, 33 (rak szyjki macicy, sromu, pochwy, jamy ustnej i gardla)  
- HHV-8 (mięsak Kaposiego) 
- Hepatitis B i C (rak wątrobowokomórkowy) 
- HTLV-1, HIV 
 
Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) a nowotwór  
 
E7 → pRB/E2F – blokowanie zajścia w fazę S cyklu komórkowego  
Jeżeli ten mechanizm zawiedzie mamy do czynienia z nieprawidłową proliferacją komórki → 
reaguje białko p53 – kontrola cyklu komórkowego, apoptoza 
Jeżeli nie zadziała ono na E6 w kompleksie w E6-12 → wydłużona proliferacja komórki → wtedy 
E6 + C-Myc → HERT → powoduje skracanie telomerów – starzenie się komórki, jeżeli jednak 
telomery nie skracają się mamy do czynienia z immortalizmem komórki  
 
Mürger K et al. J. Viral 2004 
 
Cechy komórki nowotworowej 
- samowystarczalność w zakresie sygnałów wzrostu (proliferacji) 
- ignorowanie sygnałów hamowania proliferacji 
- unikanie apoptozy – samobójstwa komórki 
- angiogeneza 

- inwazja (?) tkanek i przerzutowanie 
- nieograniczony potencjał replikacyjny – nieśmiertelność 
 
Przyczyny powstawania nowotworów 
- obecnie nie można z całą pewnością określić przyczyny większości nowotworów  
- epidemiolodzy uważają, że 31% (?) nowotworów u ludzi wywołują czynniki środowiskowe  
- narażenie na czynniki rakotwórcze musi trwać przez wiele lat, aby postępująca dysplazja uległa 
przemianie nowotworowej 
- niektóre wyjątki 
a) białaczki indukowane promieniowaniem jonizującym – 2 lata 
b) nowotwory wieku dziecięcego – uw. genetycznie 
 
Diagnostyka molekularna 
Poznanie mechanizmów molekularnych prowadzących do rozwoju nowotworu przyczyniło się do 
powstania testów umożliwiających:ocenę ryzyka zachorowania 
 

 

 

 

          ocenę przebiedu choroby i ustalenia prawdopodobieństwa 

 

 

 

 

 

          nawrotu choroby po zabiegu 

Testy mogą być wykonywane w próbkach materiału biologicznego: pobrnego pod pacjenta 
(fragment guza, próbka moczu czy krwi) w materiale archiwalnych (blok parafinowy)  
 
* markery prognostyczne – wskazują na przewidywalny przebieg naturalny choroby i rokowania 
* markery predykcyjne – markery, których obecność jest związana z prawdopodobieństwem 
uzyskania korzyści (najczęściej – obiektywna odpowiedź na leczenie) 
* markery ryzyka – dają możliwość oszacowania ? 
 
Markerem biochemicznym jest dowolna substancja wielkocząsteczkowa umożliwiająca odróżnienie 
komórki prawidłowej od nowotworowej (najczęściej białko adhezyjne lub empatyczne)  
 
* specyficzne dla pewnych komórek ale w prawidłowych warunkach nieobecne w dorosłym 
organizmie (albo w danej tkance): AFP, CEA 
* obecne w prawidłowych komórkach, ale w mniejszym stężeniu niż wykrywalne 
 
Pożądane cechy idealnego markera 
- wysoka czułość i wysoka swoistość – czułość testu – zdolność do wykrycia nowotworu (np. 
czułość rzędu 80% - badanie wykrywa chorobę u 8 na 10 chorych, 20% wyników – test fałszywie 
ujemny) 
 
Markery biochemiczne – CEA, ang. carcinoembryonic antigen 
Glikoproteina, produkowana w życiu płodowym przez przewód pokarmowy, wątrobę i trzustkę.  
 
Podwyższony w: 
- raku jelita grubego ( u 2/3 pacjentów wzrost CEA – pierwsza oznaka choroby) 
- innych chorobach rozrostowych ( w 30-50%): raku piersi, torbielakogruczolakoraku jajnika, 
gruczolakoraku szyjki macicy 
- także: u palaczy, w przebiegu POChP, w chorobach zapalnych jelita grubego, zapaleniu 
wątroby, marskości wątroby, niewydolności nerek 

- także: u 3% zdrowej populacji