1 

 

Transformacja bakterii E. coli 

metodą elektroporacji 

Materiał: elektrokompetentne komórki E. coli (szczep DH5α) przechowywane w postaci stocków glicerolowych (-

80°C). 

1. 

Zawiesinę elektrokompetentnych komórek rozmrozić na lodzie. Umieścić w lodzie kuwetę do 

e

lektroporacji (szczelina grubości 1 mm) w celu jej schłodzenia. 

2. 

Przenieść  40  μl  zawiesiny  bakterii  do  kuwety  elektroporacyjnej  tak,  aby  cała  zawiesina 

znajdowała się na dnie kuwety. Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Trzymać w lodzie. 

3. 

Dodać 100 ng plazmidowego DNA. 

4. 

Ustawić parametry elektroporacji wg poniższej tabeli: 

 

grupa 1 

grupa 2 

grupa 3 

grupa 4 

grupa 5 

grupa 6 

 

napi

ęcie 

[kV] 

0.9 kV 

1.1 kV 

1.3 kV 

1.6 kV 

1.7 kV 

 

Kontrola 

(-) 

Warunki 

wspólne (dla wszystkich grup): 

Mode: 2.5kV/RESISTANCE High Voltage 

Resistance: R5 (129 ohm) 

5. 

Wytrzeć  kuwetę  elektroporacyjną  do  sucha  (!!!),  umieścić  w  komorze  elektroporatora  i 

zabezpieczyć przez dokręcenie. 

6. 

Przyłożyć impuls (przycisk ‘PULSE). 

7. 

Odczytać i zapisać wartość czasu trwania impulsu oraz faktyczną wartość napięcia. (UWAGA: 

przed następną elektroporacją należy nacisnąć ‘RESET’) 

8. 

Niezwłocznie dodać 1 ml pożywki LB (bez ampicyliny!) ogrzanej do temp. 37° C. 

9. 

Przenieść bakterie do probówek 1.5 lub 2.0 ml. 

10. 

Inkubować w temperaturze 37° C z wytrząsaniem przez 1 godz. 

11. Dla 

kontroli 

do

świadczenia  należy  użyć  jednej  porcji  (40  μl)  bakterii 

elektrokompetentnych bez podawania impulsu  elektrycznego. Post

ępować identycznie 

jak z bakteriami poddawanymi elektroporacji. 

12. 

Wysiać  bakterie  na  płytki  z  zestaloną  pożywką  LB  z  dodatkiem  czynnika  selekcyjnego 

(ampicyliny) 

– do posiewu pobrać po 1 i/lub 10 μl hodowli rozcieńczonej 1:100 i natychmiast 

rozprowadzić równomiernie po całej płytce Petriego za pomocą głaszczki. 

13. 

Szalki inkubować w cieplarce 37° C przez 24 h do uzyskania wzrostu transformantów. 

Protokół przygotowania komórek elektrokompetentnych: 

1. 

Przygotować 1 litr hodowli E.coli na podłożu LB (inkubować z wytrząsaniem przez noc do OD

600

=0,5-1,0, 

co odpowiada  ~10

10

 

komórek/ml). 

2. 

Schłodzić hodowlę w lodzie. Zwirować (4000 g, 15’, 4°C), osad komórek rozbić i zawiesić w 1 objętości 

(1 litr) zimnej sterylnej wody. 

3. 

Ponownie zwirować hodowlę i zawiesić w 0,5 objętości zimnej wody. Powtórzyć płukanie. 

4. 

Zwirować hodowlę i zawiesić w 0,02 objętości zimnej wody. 

5. 

Zwirować hodowlę i zawiesić w 0,002-0,003 objętości zimnej wody z dodatkiem 10% glicerolu. 

Rozporcjować zawiesinę po 40 µl do jałowych probówek i przechowywać w temp. -80°C.