PCR [Tylko do odczytu] [tryb zgodności]

2011-09-26

Podstawy techniki PCR

dr hab.

Ewa Balcerczak

y w lodówce polimeraza

Stara lecz mocna, enzym z

elaza

Stara lecz mocna, enzym z

elaza

y i sapie, dyszy i dmucha,

ar z aktywnego jej centrum bucha.

y zamkni

ta w swej ciemnej celi:

y zamkni

ta w swej ciemnej celi:

„Czy wszyscy o mnie ju

zapomnieli?

„Czy wszyscy o mnie ju

zapomnieli?

Od magistranta a

do docenta

Od magistranta a

do docenta

nikt mnie ju

chyba tu nie pami

ta !!"

nikt mnie ju

chyba tu nie pami

ta !!"

I marzy biedna polimeraza

e kto

bierze, w probówk

wkłada,

e kto

bierze, w probówk

wkłada,

A w tej probówce oba startery,

Jaka

matrycka, zasady cztery

Jaka

matrycka, zasady cztery

I bufor

wie

y, wonny jak wino....

I bufor

wie

y, wonny jak wino....

Ech, by si

enzym wtedy uwin

ł !!

Ech, by si

enzym wtedy uwin

ł !!

Tak by pop

dził wzdłu

nici obu,

Tak by pop

dził wzdłu

nici obu,

Tak z obu ko

ców zadał im bobu,

Tak z obu ko

ców zadał im bobu,

e nim by spostrzegł si

zwierz czy człek

e nim by spostrzegł si

zwierz czy człek

Amplifikacji nadszedłby kres.

Metoda

Metoda PCR

PCR (ang

(ang..

PPolymerase

olymerase C

Chain

hain

Reaction

eaction

)) jest

jest bardzo

bardzo czułą

czułą ii wydajną

wydajną

techniką

pozwalającą

szybkie,

ekspotencjalne

powielanie

wybranej

sekwencji

sekwencji kwasu

kwasu nukleinowego

nukleinowego..

Reakcja

Reakcja PCR

PCR jest

jest uwaŜana

uwaŜana obecnie

obecnie za

najwaŜniejsze

narzędzie

biologii

molekularnej

molekularnej..

PCR umoŜliwia w czasie kilku godzin uzyskanie 10

-10

kopii wyjściowego DNA.

Amplifikuje tylko wybrany, krótki fragment DNA
(od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad)

Cykl pierwszy

Cykl drugi

Cykl trzeci

Cykl czwarty

Historia PCR

1985

Pierwsza publikacja o technologii PCR (Science)

1986

Oczyszczona polimeraza Taq pierwszy raz uŜyta w PCR zamiast fragmentów Klenowa

Oczyszczona polimeraza Taq pierwszy raz uŜyta w PCR zamiast fragmentów Klenowa
Pierwsze zastosowanie w sądzie USA do identyfikacji DNA (HLA

Pierwsze zastosowanie w sądzie USA do identyfikacji DNA (HLA--DQA)

DQA)

1987

Przyznanie podstawowego patentu firmie Cetus

1988

Wprowadzenie zautomatyzowanej maszyny (termocyklera) przez Perkin Elmer

Wprowadzenie zautomatyzowanej maszyny (termocyklera) przez Perkin Elmer
Publikacja w Science dotycząca pierwszego PCR z Taq

Publikacja w Science dotycząca pierwszego PCR z Taq

1989

Polimeraza Taq ogłoszona przez Science cząsteczką roku

Polimeraza Taq ogłoszona przez Science cząsteczką roku
Wprowadzenie AmpliTaq® DNA Polymerase (pierwsza rekombinacyjna polimeraza

Wprowadzenie AmpliTaq® DNA Polymerase (pierwsza rekombinacyjna polimeraza

Taq)

Porozumienie Hoffmann

Porozumienie Hoffmann--La Roche Inc. & Cetus dotyczące rozwoju diagnostyki

La Roche Inc. & Cetus dotyczące rozwoju diagnostyki

opartej na PCR

opartej na PCR
1990

1990

Pierwszy kit PCR dla HLA DQA, polimorficzny locus uŜywany do identyfikacji ludzi,

dla potrzeb sądu.

Pierwsza amplifikacja I detekcja DNA przy zastosowaniu sondy fluorescencyjnej

dająca podstawę do rozwoju w przyszłości technologii "real

dająca podstawę do rozwoju w przyszłości technologii "real--time PCR” (TaqMan®)

time PCR” (TaqMan®)

Odczynniki w reakcji PCR

-- matrycowe DNA

matrycowe DNA (powielana sekwencja)

(powielana sekwencja)

-- startery (primery)

startery (primery) komplementarne do

komplementarne do

końców sekwencji do powielenia

-- polimeraza

polimeraza

-- dNTP

dNTP

-- bufor

bufor

-- odpowiednie oprzyrządowanie

odpowiednie oprzyrządowanie

2011-09-26

Warunki reakcji RT

Warunki reakcji RT--PCR

PCR

ilość cząsteczek matrycy: 10

-- 10

temperatura hybrydyzacji: o 5

C poniŜej Tm (55

C -- 70

stęŜenie starterów: 0.1

stęŜenie starterów: 0.1 -- 0.5 mM

0.5 mM

stęŜenie MgCl

: 1

: 1-- 3 mM, ze wzrostem stęŜenia wzrasta

3 mM, ze wzrostem stęŜenia wzrasta

wydajność reakcji ale równieŜ wzrasta niespecyficzna

amplifikacja i zmniejsza się dokładność syntezy

stęŜenie dNTP: 200 mM

Reakcja PCR składa się z 25

Reakcja PCR składa się z 25--40 cykli

40 cykli

KaŜdy cykl obejmuje

KaŜdy cykl obejmuje trzy etapy

trzy etapy

Denaturacja

Denaturacja
Swoista hybrydyzacja = annealing

Swoista hybrydyzacja = annealing
Elongacja

Elongacja

Cykl PCR:

Etapy reakcji PCR

Mieszanina

reakcyjna

Denaturacja Annealing

Elongacja

5’ 3’

...

GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

3’

5’

DENATURACJA temp. około 95 C

5’

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

5’

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

CACTAC AGCTAT

T G C A

2011-09-26

Primery

Stosunek

Stosunek zasad

zasad C+G

C+G do

do A+T

A+T powinien

powinien być

być jak

jak

najbliŜszy

najbliŜszy 50

50%

% ii podobny

podobny dla

dla primerów

primerów F

F ii R

zapewniający

zapewniający odpowiednią

odpowiednią temperaturę

temperaturę hybrydyzacji

hybrydyzacji..

Zaprojektowane

primery

nie

powinny

powinny::

być

komplementarne

siebie

(self

(self--annealing)

annealing);;

ani

tworzyć

tworzyć stabilnych

stabilnych struktur

struktur drugorzędowych

drugorzędowych typu

typu

„spinka

„spinka do

do włosów”

włosów” (hairpin)

(hairpin)..

Powinny

Powinny mięć

mięć urozmaiconą

urozmaiconą sekwencję

sekwencję ii odpowiednią

odpowiednią

długość

długość (zwykle

(zwykle ok

ok.. 20

20 nt

nt..),

), jeŜeli

jeŜeli mają

mają namnoŜyć

namnoŜyć

specyficznie

specyficznie określoną

określoną sekwencję

sekwencję.. NaleŜy

NaleŜy sprawdzić

sprawdzić

homologię

homologię primerów

primerów do

do sekwencji

sekwencji matrycy

matrycy..

5’

CACTAC

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..

AGCTAT

T G C A

ANNEALING temp. około 45 - 60 C

5’

CACTAC

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
.

AGCTAT

T G C A

ELONGACJA temp. około 72 C

5’

CACTAC

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

AGCTAT

T G C A

ELONGACJA temp. około 72 C

5’

CACTAC

GAGC

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

ATTG

AGCTAT

T G C A

2011-09-26

5’

CACTAC

GAGCTA

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

AAATTG

AGCTAT

T G C A

5’

CACTAC

GAGCTAGCGCCATTTAA

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

CTCGATCGCGGTAAATTG

AGCTAT

T G C A

5’

CACTAC

GAGCTAGCGCCATTTAACTCGAT

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

TGATGCTCGATCGCGGTAAATTG

AGCTAT

T G C A

5’

CACTAC

GAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA

3’

...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...

3’

5’

...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...

TGATGCTCGATCGCGGTAAATTG

AGCTAT

100

Denaturacja

Dołączanie

startera

WydłuŜanie

startera

Cykl 1

Cykl 2

°C

Jednostka

czasu

PROFIL TERMICZNY CYKLU

5’

3’

5’

3’

Początkowa matryca (+)

Początkowa matryca (-)

5’

3’

starter1

starter2

PIERWSZY CYKL TERMOREPLIKACJI DNA

2011-09-26

5’

3’

Początkowa matryca (+)

5’

3’

Początkowa matryca (-)

5’

3’

starter1

5’

3’

starter2

PRODUKTY PIERWSZEGO CYKLU TERMOREPLIKACJI

5’

3’

Początkowa matryca (+)

5’

3’

starter1

5’

3’

Początkowa matryca (-)

5’

3’

starter2

5’

3’

starter1

5’

3’

starter2

5’

starter2

3’

5’

3’

starter1

DRUGI CYKL TERMOREPLIKACJI DNA

5’

3’

Matryce początkowe

5’

3’

5’

3’

5’

3’

Fragmenty DNA o niezdefiniowanej długości

Właściwe fragmenty

3’

5’

3’

PRODUKTY DRUGIEGO CYKLU TERMOREPLIKACJI DNA

ZaleŜność liczby cykli od wyjściowej liczby cząsteczek

matrycowego DNA

Liczba cząsteczek matrycy

Liczba cykli

300 000

25 – 30

15 000

30 – 35

1 000

35 – 40

40 - 45

Wizualizacja produktu reakcji PCR

Elektroforeza w Ŝelu agarozowym

Elektroforeza w Ŝelu agarozowym
Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym

Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym

Barwniki wykorzystywane do uwidocznienia produktu

reakcji PCR:

--bromek etydyny

bromek etydyny

--sole srebra

sole srebra

Schemat elektroforezy

2011-09-26

Wpływ stęŜenia jonów magnezu na przebieg PCR

Optymizacja liczby cykli.

19 21 23 25 27

Polimerazy DNA i RNA, nukleotydylotransferazy DNA i RNA

Polimerazy DNA i RNA, nukleotydylotransferazy DNA i RNA,

enzymy katalizujące syntezę DNA i RNA. Substratami tej reakcji są

trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP i NTP).

Polimerazy były izolowane i klonowane z wielu organizmów: T4,

E. coli,

T7, T5.

Przełomową modyfikacją udoskonalającą oryginalnie opisaną technikę

PCR było zastąpienie fragmentu Klenowa polimerazy DNA I z

E. coli

przez termostabilną polimerazę z

Thermus aguaticus

(Taq)

Polimeraza Taq jest obecnie uŜywana do większości reakcji PCR.

Wiele jej cech moŜe być zarówno wadą i zaletą. Brak aktywności 3'

do 5' egzonukloeazy uniemoŜliwiające korektę błędów. Wykazano

dodatnią korelację między aktywnością egzonukleoityczną 3' to 5'

oraz wiernością syntezy.

Taq w jednym cyklu na dołączony nukleotyd myli się z częstością od

2*10

2*10--4 do 2*10

4 do 2*10--5

W związku z opatentowaniem Taq oraz poszukiwaniem

enzymów o większej dokładności i termostabilności

rozpoczął się wyścig w izolowaniu i patentowaniu

nowych termostabilnych polimeraz z roŜnych gatunków.

Wiele termostabilnych polimeraz o aktywności DNA

polimerazy typu I, izolowanych jest z

ekstremotermofili naleŜących do

Archebacteria

(temp.

optymalna powyŜej 80 ˚C) izolowanych z dna oceanów

w pobliŜu kominów geotermalnych.

Wśród

Archebacteria

znajdują się gatunki

hipertermofilne o optymalnej temp. wzrostu powyŜej

100 ˚C. NaleŜą one głównie do trzech rodzajów:

Pyrodictium, Pyrococcus, and Pyrobaculum

. .

Charakterystyka DNA polimeraz

Taq

Vent

DeepVen Pfu

Tth

UlTma

Źródło

Thermus Thermococcus Pyrococcus Pyrococcus Thermus Thermotoga
aquaticus litoralis

GB-D

furiosus thermopilus maritima

97.5 10 130 ? 120
T

1/2

C 40 360 400 180 20 >50

92.5C 130 ? ? ? ? ?

Aktywność + -

+ -

5’-3’

Aktywność -

+ + + -

3’-5’

Szybkość 75 >80 >80 60 >33 ?
Syntezy (pz/s)

Końce

3’A >95% tępe >95% tępe ? 3’A Tępe

Optimum Mg(mM) 1.5 2.0 ? 1.5-2.0 ? ?

Optimum KCl(mM) 50 10 ? 10 ? ?

2011-09-26

przechowywanie

DNA w temp. 4

DNA w temp. 4 C , dłuŜsze

C , dłuŜsze --20

20 C

RNA

RNA w temp.

w temp. --70

70 C (cDNA

C (cDNA --20

20 C)

Modyfikacje PCR

RT--PCR

PCR

„gniazdowy” PCR

„gniazdowy” PCR
„multiplex” PCR

„multiplex” PCR

Reverse Transcriptase

Reverse Transcriptase--PCR

PCR

••

proces

PCR

poprzedzony

jest

przepisaniem

przepisaniem informacji

informacji zz mRNA

mRNA na

cDNA

cDNA (komplementarny

(komplementarny DNA)

DNA) w

w reakcji

reakcji

odwrotnej

odwrotnej transkrypcji

transkrypcji ((

ReverseTranscriptase

••

w obecności

obecności odpowiedniego

odpowiedniego startera

startera

(najczęściej

(najczęściej uniwersalny

uniwersalny oligo

oligo dT

dT lub

lub

oligonukleotyd

oligonukleotyd swoisty

swoisty dla

dla pojedynczego

pojedynczego

matrycowego

matrycowego RNA)

RNA)

Podstawy reakcji RT-PCR

Materiał biologiczny

RNA

AAAAAAAAA

AAAAAAA

Synteza cDNA

AAAAAAA

Hybrydyzacja ze specyficznym starterem

Hybrydyzacja z oligo (dT

)

Hybrydyzacja z heksamerami

AAAAAAA

TTTTTTT

cDNA

PCR

Zanieczyszczenie RNA genomowym DNA

Genomowe DNA

mRNA

2011-09-26

„Gniazdowy”(nested) PCR

••

obejmuje

obejmuje dwie

dwie następujące

następujące po

po sobie

sobie reakcje

reakcje PCR

PCR

••

po pierwszej

pierwszej reakcji

reakcji PCR

PCR zz uŜyciem

uŜyciem jednej

jednej pary

pary

starterów

starterów następuje

następuje druga

druga reakcja

reakcja PCR

PCR (matrycą

(matrycą jest

jest

produkt

produkt pierwszej

pierwszej reakcji),

reakcji), w

w której

której stosuje

stosuje się

się inne

inne

startery

startery zlokalizowane

zlokalizowane

bliŜej

bliŜej środka

środka powielanego

powielanego

fragmentu

fragmentu DNA

DNA..

••

ostateczny

ostateczny wynik

wynik tak

tak przeprowadzonego

przeprowadzonego procesu

procesu jest

jest

wielokrotnie

bardziej

bardziej wiarygodny

wiarygodny

od uzyskanego

uzyskanego

metodą

metodą zwykłego

zwykłego PCR

PCR (wzrost

(wzrost czułości

czułości ii swositości

swositości

diagnostycznej)

„Multiplex”PCR

w jednej

jednej mieszaninie

mieszaninie reakcyjnej

reakcyjnej wykorzystuje

wykorzystuje się

się

więcej

więcej niŜ

niŜ jedną

jedną parę

parę starterów

starterów

moŜna

moŜna namnaŜać

namnaŜać kilka

kilka genów

genów w

w jednej

jednej probówce

probówce

moŜna

moŜna wykonać

wykonać porównawczą

porównawczą analizę

analizę półilościową

półilościową --

namnoŜeniu,

namnoŜeniu, obok

obok analizowanego

analizowanego

fragmentu

DNA,

poddaje

poddaje się

się matrycę

matrycę standardową

standardową (gen

(gen metabolizmu

metabolizmu

podstawowego),

podstawowego), uzyskując

uzyskując jej

jej ściśle

ściśle mierzalne

mierzalne ilości

ilości..

Pozwala

Pozwala to

równieŜ

równieŜ kontrolować

kontrolować

poprawność

przebiegu

przebiegu prowadzonego

prowadzonego procesu

procesu

Schemat multiplex PCR