Program ćwiczeń z inżynierii genetycznej –KP-III rok Biologii
Ćwiczenie 1 i 2: Metody izolacji, oczyszczania DNA
kolokwium wstępne: sprawdzenie podstawowych wiadomości z zakresu genetyki, i biologii
molekularnej
izolacja DNA plazmidów o różnej masie cząsteczkowej i różnej ilości kopii metodami lizy alkalicznej
izolacja DNA plazmidowego metodą Holmesa-Quigley’a (metoda termiczna)
teoria: budowa kwasów nukleinowych, plazmidy, metody izolacji i oczyszczania DNA
Ćwiczenie 3 i 4: Metody rozdziału DNA w żelach agarozowych
Izolacja całkowitego DNA bakterii
elektroforeza kwasów nukleinowych
charakterystyka właściwości preparatów DNA: określanie stężenia, ciężaru cząsteczkowego i form
konformacyjnych,
porównanie obrazu elektroforetycznego plazmidowego i całkowitego DNA
teoria: elektroforeza DNA w stałym i zmiennym polu elektrycznym, enzymy (inne niż
restryktazy) stosowane w inżynierii genetycznej
Ćwiczenie 5 i 6: Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do konstrukcji mapy fizycznej DNA
przygotowanie reakcji trawienia DNA pojedynczymi enzymami restrykcyjnymi i kombinacjami
enzymów podwójnych – omówienie zasad przygotowania reakcji
oznaczanie wielkości fragmentów restrykcyjnych w oparciu o markery wielkości DNA
konstrukcja mapy restrykcyjnej wstawki plazmidu
teoria: enzymy restrykcyjne i mapowanie restrykcyjne
zaliczenie pisemne materiału Ćwiczeń 1-4
Ćwiczenie 7 i 8: Reakcja łańcuchowa polimerazy
przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji
analiza uzyskanych wyników-ocena wydajności i specyficzności amplifikacji
teoria: projektowanie starterów, czynniki wpływające na specyficzność i wydajność amplifikacji,
odmiany i zastosowania reakcji PCR
Ćwiczenie 9 i 10: Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych
przygotowanie DNA wektora plazmidowego i wstawki
elektroforetyczna kontrola jakości trawienia
ligacja DNA
teoria: wektory DNA
zaliczenie pisemne materiału Ćwiczeń 5-8.
Ćwiczenie 11 i 12: Transformacja bakterii E. coli DH5
zrekombinowanym DNA.
przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja
teoria: metody wprowadzania i selekcji zrekombinowanego DNA w biorcach,
Ćwiczenie 14. Analiza wyników klonowania
trawienie enzymami restrykcyjnymi i rozdział elektroforetyczny zrekombinowanego DNA
transformantów
teoria: hybrydyzacja kwasów nukleinowych – rodzaje, zastosowanie, metody znakowania sond
molekularnych.
Techniki
sekwencjonowania
DNA,
przygotowanie
matryc,
reakcji
sekwencjonowania
Ćwiczenie 15 Zaliczenie materiału ćwiczeń. 9-14.
Przykładowa literatura i zasoby internetowe:
1.Brown, T.A. Genomy. PWN
2.Piotr Węgleński Genetyka molekularna PWN 2008
3.Markiewicz Z. Biologia molekularna bakterii. PWN 2006
www.dnaftb.org
www.dnai.org
Ćwiczenie 1 -2
Plazmidy bakteryjne – izolacja plazmidowego DNA
Plazmidy stanowią pozachromosomalny materiał genetyczny bakterii. Warunkują one szereg cech
fenotypowych jak oporność na leki, syntezę substancji o charakterze antybiotyków (bakteriocyn),
toksyn i innych związków. Plazmidy występują w formie kolistych cząsteczek DNA i różnią się
między sobą pod względem wielkości oraz liczby kopii w komórce. W inżynierii genetycznej
plazmidy wykorzystujemy często jako wektory do przenoszenia DNA pomiędzy komórkami tych
samych lub różnych organizmów.
Celem ćwiczenia jest izolacja z komórek E. coli plazmidów, które różnią się wielkością oraz
liczbą kopii dwoma różnymi metodami. DNA plazmidowe pUC19 i pUC98 będzie
wykorzystywane na kolejnych zajęciach/
Plazmidy: pUC19, pUC98, pK19mobGII, pBBRMCS-1 (Km
R
), pMP220
1. Izolacja plazmidowego DNA za pomocą zestawu MINIPREP EXPRESS MATRIX ™
(BIO 101)
5 ml hodowli E. coli zawierającej odpowiedni plazmid inkubować z wytrząsaniem przez noc
w temp. 37ºC w płynnym podłożu LB uzupełnionym odpowiednim antybiotykiem
w próbówce Eppednorfa odwirować 1,5 ml nocnej hodowli 1 min. przy 14 tys. RPM
(UWAGA!!! żeby zwiększyć wydajność izolacji niskokopijnych plazmidów, można
odwirować w tej samej próbówce dodatkową 1,5 ml porcję hodowli bakteryjnej)
usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej
osad bakteryjny dokładnie zawiesić w 150
l buforu TCG, nie pozostawiające zbitych grudek
osadu bakterii
dodać 300
l alkalicznego SDS (UWAGA! bufor przygotować na świeżo przed użyciem z 2N
NaOH i 10% SDS) i delikatnie wymieszać przez odwracanie
dodać 230
l buforu octanowego i delikatnie wymieszać przez odwracanie (powinien być
widoczny biały osad)
wirować 5 min.
supernatant przenieść ostrożnie do nowej próbówki Epp. tak by nie pobrać białego osadu
dodać 400
l EXPRESS MATRIX (UWAGA! zawiesinę dokładnie wymieszać przed
dodaniem) i zmieszać przez odwracanie ok. 5 razy (DNA plazmidowe wiąże się do złoża
silikonowego)
wirować 30 sek., usunąć supernatant za pomocą pompki wodnej
dodać 500
l 70% etanolu i wymieszać, tak aby cały osad doprowadzić do jednorodnej
zawiesiny
wirować 30 sek., dokładnie usunąć etanol odsączając za pomocą pompki wodnej
osad podsuszyć w SpeedVacu (ok. 5 min)
dodać 30
l wody i bardzo dokładnie wymieszać za pomocą końcówki do pipet (UWAGA!
dokładne zawieszenie kompleksu złoże-DNA zapewnia maksymalną wydajność elucji
plazmidowego DNA)
wirować 2 min.
supernatant zawierający plazmidowe DNA przenieść do nowej próbówki Epp i zamrozić w
temp. -20˚
Materiały
bufor TC pH 8.0
Tris-HCl (pH 8.0)
10 mM
EDTA
1 mM
bufor TCG
glukoza
50 mM
Tris-HCl (pH 8.0)
25 mM
EDTA
10 mM
bufor octanowy
octan potasu (5M)
60 ml
kwas octowy lodowaty
11.5 ml
H
2
O dest.
28.5 ml
alkaliczny SDS
SDS
1%
NaOH
0.2 M
Przygotowany z 10% SDS i 2M NaOH bezpośrednio przed użyciem,
2. Izolacja plazmidowego DNA metodą Holmsa, Quigley’a
5 ml hodowli E. coli zawierającej odpowiedni plazmid inkubować z wytrząsaniem przez noc
w temp. 37ºC w płynnym podłożu LB uzupełnionym odpowiednim antybiotykiem
w próbówce Eppednorfa odwirować 1,5 ml nocnej hodowli 1 min. przy 14 tys. RPM
(UWAGA!!! żeby zwiększyć wydajność izolacji niskokopijnych plazmidów, można
odwirować w tej samej próbówce dodatkową 1,5 ml porcję hodowli bakteryjnej)
usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej
osad bakteryjny bardzo dokładnie zawiesić w 350
l buforu STET, nie pozostawiające
zbitych grudek bakterii (UWAGA bufor STET bardzo się pieni, należy pipetować go
bardzo delikatnie)
dodać 25
l lizozymu o stęż. 10 mg/ml, zamieszać końcówką pipety
mieszankę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 40 sekund i natychmiast odwirować 10 min.
supernatant przenieść ostrożnie do nowej próbówki Epp. tak by nie pobrać osadu z próbówki
dodać 0,6 objętości izopropanolu, bardzo dokładnie wywieszać przez odwracanie
wirować 15 min, supernatant delikatnie odsączyć za pomocą pompki próżniowej, a osad
wypłukać 0,5 ml 70% etanolu,
odwirować 5 min, supernatant delikatnie odsączyć za pomocą pompki próżniowej
osad podsuszyć w SpeedVacu (ok. 5 min), a następnie rozpuścić w 20
l buforu TC + RNaza
20
g/ml)
zamrozić w temp. -20˚
Bufor STET
NaCl
0.1 M
Tris HCl pH 8.0
10 mM
EDTA pH 8.0
1 mM
Triton X-100
5 %
bufor TC+RNaza
Bufor TC + RNaza 20
g/ml
Ćwiczenie 3 i 4
Metody rozdziału DNA w żelach agarozowych
Celem ćwiczenia jest izolacja genomowego (całkowitego DNA) bakterii oraz rozdział
elektroforetyczny próbek genomowego DNA oraz plazmidowego DNA wyizolowanego na
poprzednich zajęciach i porównanie obrazu elektroforetycznego. W przypadku rozdziału
plazmidowego DNA należy zaobserwować zależność drogi migracji od wielkości cząsteczki
plazmidu, obecność form konformacyjnych, ilości i jakości DNA, zależnie od zastosowanej
metody izolacji plazmidu
A) Izolacja genowego DNA za pomocą zestawu Genomic DNA Prep Plus
Zasada działania zestawu do izolacji genomowego DNA opiera się (podobnie jak w
przypadku plazmidu) na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w buforach o
wysokiej sile jonowej. Komórki bakterii poddawane są lizie w uniwersalnym buforze
lizującym (LT), zawierającym sole i detergenty niejonowe. Dodatkowo w procesie lizy
uczestniczy silna proteaza (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komórek i
degradacji wszystkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnę ze
specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, zaś
zanieczyszczenia zostają wypłukane z kolumny buforem A1 zawierającym 96% etanol.
Oczyszczone DNA wymywane jest z kolumny niskojonowymi buforami np. buforem TC lub
wodą. Stopień oczyszczenia DNA pozwala na jego wykorzystanie w analizie restrykcyjnej i
PCR.
Protokół izolacji genomowego DNA
W próbówce Eppendorfa odwirować 1.5 - 5 ml (zależnie od gęstości) hodowli bakteryjnej (5
min./ 14 tys. RPM)
Osad zawiesić w 100
l buforu TE
Dodać 200
l uniwersalnego buforu lizującego LT
Dodać 20
l roztworu Proteinazy K
Całość wymieszać i inkubować 20 min w temp. 37ºC
Przenieść próbówkę do 75ºC i inkubować przez 5 min.
Próbówkę intensywnie wytrząsać np. na worteksie przez 20 sek.
Wirować przez 5 min (15 tys. RPM)
Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do czyszczenia genomowego DNA
Kolumnę umieścić nowej próbówce, a następnie wirować 1 min. (15 tys. RPM)
Wyjąc minikolumnę wraz z próbówką i dodać do kolumny 500
l r-ru płuczącego A1
Wirować 1 min przy 15 tys. RPM
Kolumnę umieścić nowej próbówce i dodać do kolumny 400
l r-ru płuczącego A1
Wirować 1 min przy 15 tys. RPM
Osuszoną kolumnę umieścić w nowej próbówce i do złoża znajdującego się na dnie kolumny
dodać 30
l wody dejonizowanej.
Inkubować próbówkę przez 5 min. w temp. pokojowej
Kolumnę umieścić nowej próbówce i wirować 1 min przy 15 tys. RPM
Minikolumnę usunąć a oczyszczone DNA znajdujące się w eluacie zamrozić w -20ºC.
Sprawdzić ilość wyizolowanego DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym.
B) Elektroforeza agarozowa DNA
Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych jest techniką używaną do
rozdziału, oznaczania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Rozdział polega na migracji
rozdzielanych substancji pod wpływem przyłożonego prądu elektrycznego. W obojętnym pH
DNA ma ładunek ujemny i wędruje do anody. Stosowane techniki różnią się od siebie
zdolnością rozdzielczą i zakresem rozdziału.
Przygotowanie żelu agarozowego
przygotować 100 ml 0,7% żelu agarozowego w buforze elektroforetycznym 1X stęż. TBE.
Rozpuścić agarozę we wrzącej łaźni wodnej i gotować jeszcze przez co najmniej 10 min.
ostudzić żel do temp. ok. 60ºC i wylać żel do rynienki tak aby ustawiony nad nią grzebień
został zanurzony w żelu i spowodował powstanie studzienek
po zastygnięciu żelu (minimum 30 min) wyjąć grzebień i napełnić aparat buforem 1X stęż.
TBE do wysokości 5 mm nad powierzchnię żelu
Przygotowanie próbek DNA
Do sprawdzenia ilości wyizolowanego DNA używany jest zwykle niewielka ilość (kilka
l)
uzyskanego w trakcie izolacji roztworu DNA. Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat
przy nakładaniu do próbki dodajemy kilka
l buforu TC lub wody. Do tak przygotowanej
próbki dodajemy 6x stężonego buforu obciążającego (do końcowego stężenia 1X). Bufor
obciążający służy do zagęszczenia próbki DNA tak by umożliwić jej nałożenie do studzienki
w żelu. Bufor obciążający zawiera jeden lub dwa barwniki do elektroforezy tj. ksylen cyjanol
(0,25%) i błękit bromofenolowy (0,25%) oraz 40% sacharozę lub 30% glicerol. Barwniki
elektroforetyczne mirują w żelu razem z cząsteczkami DNA. Błękit bromofenolowy migruje
ok. 2,2 razy szybciej niż ksylen cyjanol. Szybkość migracji błękitu bromofenolowego
odpowiada szybkości migracji liniowej cząsteczki dsDNA (dwuniciowe DNA) o wielkości
300pz, podczas gdy ksylen cyjanol migruje z szybkością równą fragmentom dsDNA o
wielkości 4000pz.
UWAGA!!! próbki DNA do elektroforezy przygotowujemy w nowych próbówkach Epp,
pozostałą część przechowujemy do dalszych oznaczeń. Całość przygotowanej próbki
nakładamy na żel.
włączyć zasilanie ze stabilizatora prądu do aparatu do elektroforezy, dla uzyskanie
optymalnego rozdziału napięcie powinno wynosić ok. 5V/cm odległości pomiędzy
elektrodami aparatu do elektroforezy (w naszym przypadku ok. 120V)
prowadzić elektroforezę aż do momentu kiedy barwnik osiągnie 3/4 długości żelu
wyłączyć zasilanie, wyjąć żel wraz z rynienką i umieścić w wanience zawierającej wodny
roztwór bromku etydyny (0,5 mg/ml) barwić żel co najmniej 10 -15 min.
podświetlić żel lampą UV i obserwować powstałe prążki DNA. Zaobserwować odmienną
ruchliwość elektroforetyczną różnych form DNA plazmidowego i genomowego.
UWAGA!!! Bromek etydyny jest silnym mutagenem - stosować rękawiczki i unikać
bezpośredniego kontaktu roztworu bromku etydyny ze skórą
Materiały
bufor TBE-1 x stężony (Tris-boranowy)
Tris base
10,8 g
kwas borowy
5,5 g
0.5M EDTA pH 8.0
4 ml
H
2
O dest.
do 1000 ml
bufor obciążający
błękit bromofenolowy
0,25%
sacharoza
40%
Ćwiczenie 5 i 6
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do konstrukcji mapy fizycznej DNA
Celem ćwiczenia jest konstrukcja mapy fizycznej wstawki plazmidu pUC98 przy użyciu
enzymów restrykcyjnych. W trakcie ćwiczeń studenci przygotowują reakcje trawienia DNA
pojedynczymi enzymami restrykcyjnymi i kombinacjami enzymów podwójnych, a następnie
oznaczają wielkości fragmentów restrykcyjnych w oparciu o ruchliwość elektroforetyczną w
żelu agarozowym i porównanie drogi migracji fragmentów DNA z markerami wielkości. Na
tej podstawie konstruowana jest mapa restrykcyjna wstawki plazmidu pUC98.
Przygotowanie reakcji trawienia plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi
UWAGA!!! Enzymy restrykcyjne należy trzymać w lodzie!!!!
Ważna jest kolejność dodawania składników mieszaniny: H
2
O, DNA, bufor, enzym!!!
A) trawienia pojedynczymi enzymami
UWAGA!!! końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 15µl
pUC98 EcoRI
pUC98 HindIII
pUC98 PstI
ok. 500 ng DNA pUC98
1,5 µl bufor EcoRI
1,5 µl enzym EcoRI
ok. 500 ng DNA pUC98
1,5 µl bufor HindIII
1,5 µl enzym HindIII
ok. 500 ng DNA pUC98
1,5 µl bufor PstI
1,5 µl enzym PstI
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej 15 µl
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej 15 µl
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej 15 µl
B) Trawienie podwójnymi kombinacjami enzymów restrykcyjnych
UWAGA!!! końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20µl
pUC98 EcoRI/HindIII
pUC98 EcoRI/PstI
pUC98 HindIII/PstI
ok. 500 ng DNA pUC98
1 µl bufor EcoRI
1 µl bufor HindIII
1 µl enzym EcoRI
1 µl enzym HindIII
ok. 500 ng DNA pUC98
1 µl bufor EcoRI
1 µl bufor PstI
1 µl enzym EcoRI
1 µl enzym PstI
ok. 500 ng DNA pUC98
1 µl bufor PstI
1 µl bufor HindIII
1 µl enzym PstI
1 µl enzym HindIII
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej 20 µl
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej 20 µl
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej 20 µl
Przygotowane mieszaniny reakcyjne wymieszać, krótko zwirować i inkubować w temp. 37ºC.
W międzyczasie przygotować 1% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym
grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i
zalać 1x stężonym buforem TBE. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny reakcyjne krótko
zwirować, do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do studzienek w żelu.
UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (trawione
enzymami EcoRI i HindIII DNA bakteriofaga λ lub marker typu drabinka). Prowadzić
rozdział elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4 długości żelu. Po tym
czasie żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle UV i poddać obraz
analizie w celu ustalenia wielkości fragmentów restrykcyjnych.
Ćwiczenie 7 i 8
Technika PCR
Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii
R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR
wykorzystując materiał genomowego DNA RtTA1 wyizolowany na drugich zajęciach.
Wydajność i skuteczność amplifikacji sprawdza się elektroforetyczne (elektroforeza w 1%
żelu agarozowym). Powielone fragmenty DNA zostaną poddane rekombinacji do wektora
plazmidowego na kolejnych zajęciach. W celu ułatwienia rekombinacji startery do reakcji
PCR wyposażono w sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej – objętość końcowa 50
l
składnik (stęż. wyjściowe)
stęż. końcowe
objętość (
l)
uwagi!!!
woda
xxx
najpierw woda
DNA
500 ng
xxx
10X stęż. bufor reakcyjny
1 X
5
25 mM MgCl2
2,5 mM
5
2 mM dNTP
100-200
M
3
5
M starter Fw
0,2-0,4
m
2
5
M starter Fw
0,2-0,4
m
2
Polimeraza Taq (1U/
l)
1-2 U
1
polimeraza Taq jako
ostatni składniki
mieszaniny
końcowa objętość
50
l
Profil termiczny reakcji
temperatura (˚C)
czas (s)
wstępna denaturacja
96
300
denaturacja
94
10
30 cykli
anealing starterów
57
10
elongacja
72
60
W międzyczasie przygotować 1,5% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z
ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do
elektroforezy i zalać 1x stężonym buforem TBE.
Po zakończeniu reakcji amplifikacji mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, pobrać do nowej
próbówki Epp 10 µl mieszaniny do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do
studzienek w żelu.
UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (marker typu
drabinka). Prowadzić rozdział elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4
długości żelu. Po tym czasie żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle
UV i poddać obraz analizie w celu ustalenia wydajności i specyficzności amplifikacji
fragmentu DNA.
Ćwiczenia 9-10
Klonowanie genów w wektorach plazmidowych
Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA powielonego techniką PCR na poprzednich
zajęciach do wektora plazmidowego. Etapy postępowania:
Przygotowanie DNA wektora (pUC19 trawiony równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi)
Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR (trawienie równocześnie dwoma
enzymami restrykcyjnymi)
przygotowanie reakcji ligacji DNA
transformacja komórek kompetentnych E. coli DH5α)
analiza zrekombinowanych klonów (izolacja plazmidowego DNA, analiza restrykcyjna i
elektroforeza w 1% żelu agarozowym lub PCR kolonijny).
1) Przygotowanie plazmidu pUC19 do klonowania – trawienie wektora dwoma enzymami
restrykcyjnymi
Poddajemy trawieniu ok. 500 ng pUC19 równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi w celu
linearyzacji wektora oraz utworzenia „lepkich końców”.
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną:
DNA pUC19
Ok. 500 ng
X
l
Bufor Enzymu I
1 X stężony
1
l
Bufor Enzymu II
1 X stężony
1
l
Enzym I
10 U
1
l
Enzym II
10 U
1
l
H
2
O dejonizowana, jałowa
do końcowej objętości 20µl
Przeprowadzamy trawienie w temp. 37˚C przez min. 1 godz.
Efektywność trawienia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu
agarozowym
2) Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR (trawienie dwoma enzymami
restrykcyjnymi)
Poddajemy trawieniu dwoma enzymami restrykcyjnymi ok. 500 ng fragmentu DNA amplifikowanego
PCR, oczyszczonego po amplifikacji, w celu uwolnienia „lepkich końców”.
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną:
fragment PCR-DNA
Ok. 500 ng
X
l
Bufor Enzymu I
1 X stężony
1
l
Bufor Enzymu II
1 X stężony
1
l
Enzym I
10 U
1
l
Enzym II
10 U
1
l
H2O dejonizowana, jałowa
do końcowej objętości 20µl
Przeprowadzamy trawienie w temp. 37˚C przez min. 1 godz.
Efektywność cięcia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu
agarozowym.
3) Łączenie cząsteczek DNA wektora z wyizolowanym z żelu DNA fragmentu PCR - reakcja
ligacji
Przy klonowaniu fragmentów DNA obowiązuje zasada molowego nadmiaru ilości klonowanego
fragmentu w stosunku do wektora. Mieszanina reakcyjna powinna mieć jak najmniejszą objętość, co
poprawia skuteczność ligacji.
Do reakcji ligacji używamy:
pUC19/strawiony dwoma enzymami
restrykcyjnymi:–125 ng DNA
4 µl mieszaniny reakcyjnej
fragment PCR/strawionego dwoma enzymami
restrykcyjnymi: - ok. 250 ng DNA
12 µl mieszaniny reakcyjnej
bufor ligazy (końcowe stężenie 1X)
2 µl
ligaza faga T4 (1U/
l)
2 µl
UWAGA!!! Mieszaninę reakcyjną przygotowujemy w próbówkach Epp. 0,5 ml
Tak przygotowana mieszanina jest właściwą reakcją ligacji.
Oprócz niej przygotowuje się zwykle reakcję kontrolną, w której zamiast klonowanego
fragmentu dodaje się dejonizowaną sterylną H
2
O.
Reakcję ligacji przeprowadza się w temp. 12˚C przez ok. 16 godz
.
Ćwiczenie 11-12
Wprowadzanie cząsteczek DNA do komórek bakteryjnych – transformacja.
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie zrekombinowanego DNA uzyskanego na poprzednich zajęciach
do bakterii E. coli i wyselekcjonowanie na płytkach ze stałym podłożem transformantów, które
pobrały zrekombinowane cząsteczki plazmidu.
Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest
przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek
dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy.
Proces transformacji został opisany u wielu rodzajów bakterii: najwyższą częstość uzyskuje
się w obrębie tego samego gatunku (tak jest np. w przypadku bakterii z rodzaju Haemophilus),
znacznie niższą – między gatunkami. Wysoką aktywność transformującą wykazuje dsDNA w formie
liniowej. Wydajność transformacji zależy między innymi od stężenia DNA i od kompetencji komórek
biorcy. Zwiększenie stężenia DNA powyżej dawki nasycającej nie powoduje wzrostu liczby
transformantów. U wielu bakterii (Haemophilus, Streptococcus, Bacillus) pobieranie DNA z otoczenia
jest rezultatem ich naturalnego stanu kompetencji.
Natomiast w przypadku szczepów Escherichia coli stan kompetencji bakterii uzyskuje się na
drodze indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami wapnia). Metoda
wykorzystująca 0,1 M roztwór chlorku wapnia jest powszechnie stosowanym sposobem otrzymania
tzw. komórek kompetentnych. W tym stanie bakterii E. coli są zdolne do pobierania z otoczenia
cząsteczek kolistego DNA np. plazmidu.
Przygotowanie komórek kompetentnych:
1. Szczep Escherichia coli DH5α lub XL1-Blue odmłodzić przez dodanie 0,4 ml nocnej hodowli
bakterii do 40 ml jałowej pożywki LB.
2. Bakterie hodować w temperaturze 37˚C do uzyskania OD
600
= 0,4.
3. Następnie hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w łaźni lodowej na 5 min. Bakterie osadzić
rzez wirowanie w jałowej próbówce (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min).
4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml zimnego, jałowego roztworu 0,05 M CaCl
2
. Całość inkubować w
łaźni lodowej przez 30 minut.
5. Bakterie osadzić przez ponowne wirowanie (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min. ).
6. Osad bakteryjny zawiesić w 1 ml zimnego, jałowego roztworu CaCl
2
(0,05M).
7. Bakterie są gotowe do użycia.
W celu zwiększenia wydajności transformacji inkubację w lodzie można przedłużyć do 12 godzin.
Transformacja komórek bakteryjnych zrekomninowanym DNA
1. Do jałowej próbówki z 0,1 ml zawiesiny komórek kompetentnych dodać pipetą automatyczną
całość mieszaniny ligacyjnej przygotowanej na poprzednich zajęciach.
Równolegle wykonać próby kontrolne:
0,1 ml komórek kompetentnych – kontrola komórek – kontrola mutacji spontanicznych
0,1 ml komórek kompetentnych + kontrola ligacji (całość kontrolnej mieszaniny ligacyjnej
tj. wektor trawiony enzymami, poddawany ligacji bez wstawki)
0,1 ml komórek kompetentnych + 2 µl plazmidu pUC19 nietrawionego – kontrola
kompetencji
0,1 ml komórek kompetentnych + 5µl mieszaniny pUC19/Bam/Hind – kontrola
wydajności trawienia wektora
2. Po delikatnym wymieszaniu próbówkę inkubować w łaźni lodowej przez 30 – 40 minut.
3. Po tym czasie przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC i inkubować przez 2 minuty.
4. Dodać do próbówek 1 ml ogrzanej do 37ºC płynnej pożywki LB (bez antybiotyku). W celu
uzyskania ekspresji genów wprowadzonych do komórki, bakterie inkubować przez 45-60 minut
wytrząsarce w temperaturze 37ºC.
5. Po tym czasie przenieść na płytki z podłożem LB zawierającym antybiotyk (podłoże selekcyjne). W
tym celu hodowle krótko odwirować (1 min, 13 tys RPM), usunąć supernatant a osad zawiesić w 50 -
100
l płynnej pożywki LB. Właściwą ligację wysiać na podłoże z antybiotykiem z dodatkiem X-gal i
IPTG. Pozostałe kontrole wysiać na podłoża uzupełnione tylko antybiotykiem. Bakterie dokładnie
rozprowadzić głaszczką na powierzchni podłoża agarowego. Płytki inkubować przez 12-24 godzin w
temperaturze 37ºC.
6. Po inkubacji w temperaturze 37ºC, policzyć kolonie, które wyrosły na wszystkich płytkach.
Obliczyć wydajność tranformacji.
Analiza zrekombinowanych klonów.
1. Izolacja DNA plazmidowego i analiza restrykcyjna z użyciem enzymów flankujących polilinker
wektora pUC19.
2. PCR z kolonii lub na matrycy wyizolowanego DNA plazmidów z zastosowaniem starterów
komplementarnych do flankowania fragmentu DNA lub starterów uniwersalnych wektora.
Ćwiczenie 13-14
Analiza wyników klonowania - PCR kolonijny
Celem ćwiczenia jest potwierdzenie obecności zrekombinowanego plazmidu zawierającego
fragment DNA bakterii RtTA1 w transformantach E. coli uzyskanych na poprzednich
zajęciach. Jednym ze sposobów szybkiego przeszukiwania zrekombinowanych klonów jest
tzw. PCR kolonijny, w którym jako źródło materiału genetycznego do amplifikacji
wykorzystujemy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki selekcyjnej za
pomocą sterylnej ezy lub końcówki pipety. Taki materiał biologiczny poddajemy działaniu
wysokiej temp. bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej zawierającej wszystkie składniki
niezbędne do powielenie fragmentu DNA zrekombinowanego w wektorze plazmidowym. W
trakcie inkubacji w temp. 96ºC bakterie ulegają lizie uwalniając materiał genetyczny, które
stanowi matrycę do amplifikacji DNA w reakcji PCR.
Wykonanie
:
Przygotować mieszaninę reakcyjną wg schematu podanego w tabeli.
(Należy pamiętać, że przygotowanie mieszaniny reakcyjnej rozpoczynamy od dodania H
2
O, a
enzym jest ostatnim składnikiem)
MgCl
2
20 µl
Bufor dla polimerazy Taq
20 µl
dNTP
8 µl
Starter pUC Fw
4 µl
Starter pUC Rw
4 µl
Polimeraza Taq
8 µl
H
2
O
136 µl
Mieszaninę rozpiptetować po 20
l do małych (0,2 ml) próbówek Eppendorfa i dodać
sterylnie przy pomocy ezy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośredni z płytki.
Przeprowadzić reakcję PCR wg pokazanego poniżej profilu termicznego reakcji
Profil termiczny reakcji
temperatura (˚C)
czas (s)
wstępna denaturacja
96
240
denaturacja
94
15
25 cykli
anealing starterów
57
15
elongacja
72
30-60*
* w zależności od długości fragmentu DNA sklonowanego w wektorze plazmidowym
Skuteczność amplifikacji sprawdzamy przez elektroforezę 15 µl mieszaniny reakcyjnej w
1,5% żelu agarozowym w obecności markera typu drabinki.