M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
B
UDOWA I DZIAŁANIE MIKROSKOPU
Do obserwacji bardzo małych obiektów, np. komórek, tkanek zwierzęcych i
roślinnych, wykorzystywane są przyrządy optyczne - mikroskopy. Technika mikroskopowa
znalazła szerokie zastosowanie we wszystkich gałęziach nauki (geologia, metalurgia,
chemia), a szczególnie w naukach biologicznych i medycznych. Dzięki zastosowaniu
mikroskopów można określić morfologię komórek, ich strukturę wewnętrzną, a także
obserwować procesy fizjologiczne (np. sposób rozmnażania, zdolność ruchu). W
mikroskopie powstający obraz jest odwrócony, powiększony i pozorny.
W zależności od sposobu uzyskiwania powiększenia wyróżniamy mikroskopy:
- świetlne (optyczne),
- elektronowe.
W mikroskopach optycznych powiększenia uzyskuje się dzięki układowi soczewek
optycznych, w zależności od rodzaju i ustawienia oświetlenia i soczewek wyróżniamy
mikroskopy:
- z jasnym polem widzenia (zwykłe),
- z ciemnym polem widzenia,
- do obserwacji w ultrafiolecie,
- kontrastowo-fazowe,
- konfokalne,
- fluorescencyjne.
M
IKROSKOP OPTYCZNY
Mikroskop świetlny składa się z dwóch
układów:
optycznego - utworzony z dwóch
zbierających zestawów soczewek, tj.
obiektywu i okularu, oraz aparatu
oświetlającego i oświetlenia;
mechanicznego - który zawiera
podstawę,
statyw,
tubus
z
urządzeniem rewolwerowym, stolik
przedmiotowy
z
urządzeniem
krzyżowym,
mechanizm ruchu
(śrubę
makrometryczną
i
mikrometryczną) do regulowania
ostrości obrazu.
Zakres przesuwu śruby makrometrycznej dla typowych mikroskopów wynosi 56 mm – jeden
pełny obrót to 18 mm. Śruba mikrometryczna ma zakres 2 mm, skok 0,1 mm.
Pokrętła śrub są bardzo precyzyjnymi urządzeniami (wrażliwymi) – nie należy ich
przesuwać do oporu i wszelkie manipulacje wykonywać oburącz.
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
Oświetlenie, dawniej lusterko, obecnie zwykle sztuczne światło. Oświetlacze mają przysłonę
i matówkę (rozprasza światło, zapewnia równomierne oświetlenie oglądanego przedmiotu).
Oświetlenie należy dostosować do powiększenia – przy małych powiększeniach stosujemy
słabe natężenie oświetlenia, przy dużych – silne. Przy mikroskopowaniu z użyciem immersji
należy ustawić aparat oświetlający w górnym położeniu.
Aparat oświetlający (aparat Abbego) kieruje promienie świetlne od źródła światła poprzez
preparat do obiektywu. W skład aparatu Abbego wchodzą:
- kondensor (zespół 2-3 soczewek) silnie skupiający światło na preparacie,
- przysłona irysowa (diafragma) regulująca ilość światła wpadającego do
kondensora.
Obiektywy są zbudowane z kilku lub kilkunastu
soczewek skupiających, sklejonych balsamem
kanadyjskim, co minimalizuje wady optyczne
pojedynczych soczewek (aberracje sferyczne,
chromatyczne).
Najbliżej
preparatu
jest
soczewka czołowa.
Obiektywy:
achromatyczne,
fluorytowe,
apochromatyczne – największy stopień
korekcji wad.
Obiektywy mogą być suche (powietrzne) i
zanurzeniowe (immersyjne). Obiektywy suche
powiększają do 60 razy, immersyjne 90 do 150
razy.
Okulary są zbudowane z zespołu soczewek płasko-wypukłych i powiększają na zasadzie
lupy. Soczewka bliżej oka to soczewka oczna, ta bliżej obserwowanego przedmiotu to
soczewka polowa. Okulary powiększają 2-30 razy (podane na oprawce soczewki ocznej).
Z
ASADA DZIAŁANIA MIKROSKOPU
1) promienie światła zostają skierowane ze źródła światła na preparat przez aparat
Abbego; wiązka światła najpierw przez otwór przesłony irysowej przechodzi na
soczewki kondensora , które skupiają je,
2) przez otwór w stoliku światło pada na preparat, na którym część promieni ulega
ugięciu, a część przechodzi niezmieniona do ośrodka znajdującego się między
preparatem a soczewką czołową obiektywu,
3) następuje pierwsze powiększenie przedmiotu, dzięki czemu dostajemy obraz
powiększony, odwrócony i rzeczywisty,
4) z obiektywu obraz trafia do okularu, który działa jak lupa, w wyniku czego dostajemy
obraz prosty, powiększony i pozorny.
Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu, jeśli mamy
nasadkę dwuokularową to dodatkowo należy wynik przemnożyć przez powiększenie nasadki.
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
Schemat powstawania obrazu przedmiotu w mikroskopie
AB – przedmiot,
F1 – ognisko obiektywu
F2 – ognisko okularu
A’B’ – obraz wytworzony przez obiektyw,
A”B”– obraz widziany w okularze
Ważną wielkością charakteryzującą mikroskop i decydującą o jakości obrazu jest jego
zdolność rozdzielcza – najmniejsza odległość między dwoma punktami, które mikroskop
pozwala jeszcze rozróżnić. Przy słabej zdolności rozdzielczej dwa punkty preparatu leżące
blisko siebie widoczne są dla obserwatora jako jeden, a wraz z jej polepszeniem oddalenie
obrazu tych punktów od siebie rośnie.
Zdolność rozdzielcza mikroskopu wzrasta wraz ze wzrostem kąta, pod jakim światło wpada
do obiektywu i zależy od współczynnika załamania środowiska znajdującego się między
obiektywem a obserwowanym przedmiotem.
Zdolność rozdzielczą mikroskopu (D) opisuje wzór:
AN
D
2
gdzie: λ - długość fali światła oświetlającego preparat (dla światła widzialnego przyjmuje się
λ = 0,55
m),
AN - apertura numeryczna obiektywu.
Apertura numeryczna jest wielkością charakteryzującą obiektyw i jest zaznaczona na jego
oprawie. Jest to zdolność układu optycznego do przyjmowania światła, wyraża się wzorem:
sin
n
AN
gdzie: n - współczynnik załamania światła w środowisku między preparatem a obiektywem,
przy czym n = 1,0002 dla powietrza, n = 1,505 dla olejku cedrowego,
α - kąt aperturowy zawarty między skrajnym promieniem wchodzącym do obiektywu,
a osią optyczną jego soczewek.
Obiektywy o silnym powiększeniu mają wartość apertury numerycznej większą niż słabiej
powiększające.
Zdolność rozdzielczą mikroskopu można powiększyć stosując do oświetlenia preparatu
promieniowanie o długości fali krótszej od światła białego (ludzkie oko dostrzega w dolnym
zakresie barwy światło o długości fali ok. 340 nm) lub przez zwiększenie apertury
numerycznej. Zwiększenie apertury numerycznej obiektywu można osiągnąć przez
wypełnienie przestrzeni między preparatem a obiektywem cieczą o współczynniku
załamania światła większym od współczynnika załamania światła w powietrzu, np.
olejkiem immersyjnym (cedrowym, rycynowym). Apertura numeryczna obiektywów suchych
wynosi poniżej 1,0, a immersyjnych 1,2-1,6.
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
Bieg promieni świetlnych w systemie
immersyjnym i suchym, p – szkiełko
przedmiotowe,
n
–
szkiełko
nakrywkowe, a – powietrze, b-
immersja
Zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego zwykłego wynosi 0,2 m.
Odległość robocza – odległość między soczewką czołową obiektywu a preparatem w
momencie prawidłowego ustawienia ostrości obrazu w miarę zwiększania powiększenia
odległość robocza maleje.
Przestrzeń robocza – przestrzeń między soczewką czołową obiektywu a preparatem w
chwili najlepszego widzenia.
T
ECHNIKA KORZYSTANIA Z MIKROSKOPU ŚWIETLNEGO
1) Ustawić mikroskop 15-20 cm od krawędzi stołu.
2) Sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne części (obiektyw, okular, lusterko) przetrzeć
miękką, suchą ściereczką.
3) Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensorową znajdującą się pod stolikiem.
4) Przekręcając śrubą makrometryczną podnieść tubus tak, aby obiektywy znalazły się 3 – 5
cm nad stolikiem.
5) Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw o najmniejszym powiększeniu.
6) Przygotowany preparat umieścić na stoliku i docisnąć zaciskami.
7) Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki czołowej obiektywu.
Następnie bardzo wolno, patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, oddalać
stolik od obiektywu aż do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za
pomocą śruby mikrometrycznej.
8) Kolejno włączać w oś optyczną mikroskopu obiektywy o coraz większej sile
powiększającej. Każdorazowo oddalać stolik od obiektywu, a następnie patrząc z boku
przestawić rewolwerem obiektyw i postępować jak od punktu 6.
9) W przypadku mikroskopowania przy użyciu obiektywów immersyjnych należy najpierw
znaleźć obraz obiektywem suchym, a następnie podnieść obiektyw do góry i na preparat
nanieść kroplę olejku immersyjnego. Patrząc z boku opuścić obiektyw aż do zanurzenia się
soczewki czołowej w olejku. Skorygować światło (podnieść kondensor). Znaleźć ostry
obraz manipulując śrubami makro- i mikrometryczną.
10)
Po zakończeniu mikroskopowania obiektyw przemyć alkoholem.
11)
Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej,
wyłączyć i przykryć.
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
Dodatkowe informacje:
mikroskop optyczny działający na spolaryzowane światło UV osiąga maksymalne
powiększenie 3500x. Mikroskopy działające na zwykłe światło widzialne
maksymalnie 1600x.
mikroskop elektronowy pozwala osiągnąć powiększenie ok. 250 000 razy. Zastąpienie
wiązki elektronów wiązką jonów (mikroskop jonowy) pozwala uzyskać powiększenia
do 5 mln razy, w szczególności dla mikroskopu protonowego (jony wodoru).
Posługiwanie się mikroskopem immersyjnym
1. Umieścić kroplę olejku cedrowego na szkiełku przedmiotowym z preparatem.
2. Kondensor podnieść maksymalnie do góry.
3. Patrząc z boku mikroskopu za pomocą rewolweru wprowadzić obiektyw immersyjny
(pow. 100x) w oś optyczną mikroskopu.
4. Śrubą makrometryczną opuścić obiektyw aż do zanurzenia w olejku (patrząc z boku
mikroskopu).
5. Wyregulować światło.
6. Przy pomocy śruby makrometrycznej odszukać obraz preparatu, śrubą
mikrometryczną wyregulować ostrość.