czas-12.indd

739

Streszczenie

Wstęp: wykorzystywanie potencjału autoregeneracji

w celu odtwarzania i zastępowania tkanek z zasto-

sowaniem własnych komórek pacjenta stanowi ele-

ment nowego podejścia do leczenia – medycyny re-

generacyjnej. Tego typu postępowanie terapeutyczne

jest już stosowane w chirurgii szczękowo-twarzowej

oraz chirurgii stomatologicznej. Medycyna i biolo-

gia regeneracyjna stwarzają interesujące perspek-

tywy także w stomatologii: możliwość uzyskania

funkcjonalnych żywych zębów metodami in vitro,

potencjalnej alternatywy do współczesnych metod

uzupełniania braków uzębienia.

Cel pracy: niniejszy artykuł przedstawia główne

założenia, podstawy doświadczalne oraz kierunki

badań w dziedzinie biologicznego uzyskiwania zęba

zastępczego.

Podsumowanie: prace nad uzyskaniem biologiczne-

go zęba zastępczego prowadzone są w wielu ośrod-

kach i można w nich wyróżnić dwa główne nurty:

wywodzący się z inżynierii tkankowej oraz opierają-

cy się na biologii rozwoju i embriologii. Podstawo-

wą różnicę między obu podejściami można opisać

następująco: w podejściu inżynieryjnym dąży się do

skonstruowania zęba z wykorzystaniem rusztowań

z materiałów biozastępczych, zaś w podejściu bio-

logicznym/embrionalnym do stworzenia warunków

uruchamiających naturalne mechanizmy rozwoju

zęba. Perspektywa zastosowań klinicznych jest jesz-

cze odległa i wymagać będzie pogłębienia wiedzy na

temat wielu mechanizmów biologii zęba.

Medycyna regeneracyjna w stomatologii

– „ząb z próbówki” – stan zaawansowania badań

nad uzyskaniem żywych zębów zastępczych

Regenerative medicine in dentistry – “a test-tube tooth”

– current state of research on vital substitute teeth (bioteeth)

Ewa Olender

Artur Kamiński

1, 2

Izabela Uhrynowska-Tyszkiewicz

Hubert Wanyura

Z Zakładu Transplantologii i Centralnego Banku Tkanek WUM,

Kierownik: dr hab. med. A. Kamiński

Z Kliniki Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej WUM, Kierownik: prof. dr hab. med. H. Wanyura

Summary

Introduction: Reconstruction and regeneration of

tissues through the use of patient’s own cells and

the induction of the autoregenerative potential

are elements of a new approach towards medical

treatment – the regenerative medicine. This kind of

treatment is already practised in maxillofacial and

oral surgery. Regenerative medicine and biology

also create interesting prospects for dentistry: to

create functional vital substitute teeth by means

of in-vitro technique. It is a potential alternative

to contemporary methods of missing tooth

replacement.

Aim of the study: To present the assumptions,

research foundations and trends in the ﬁeld of

biotooth development.

Conclusions: Research concerning biotooth is being

carried out in many centres. Two main trends can be

distinguished: the ﬁrst one originating in tissue en-

gineering and the second one based on developmen-

tal biology and embryology. The basic difference

between these two approaches can be described as

follows: the engineering-related approach aims at

constructing a tooth with the use of biosubstitute

material scaffolds, while embryology/developmen-

tal biology-related approach aims at creating con-

ditions capable of triggering natural mechanisms

of tooth development. Clinical application is not to

be expected soon and will require broadening of the

knowledge of many mechanisms involved in tooth

biology.

KEYWORDS:

regenerative medicine, cell culture, biotooth

HASŁA INDEKSOWE:

medycyna regeneracyjna, hodowle komórkowe,

biologiczny ząb zastępczy

Czas. Stomatol., 2010, 63, 12, 739-748

http://www.czas.stomat.net

740

E. Olender i in.

Czas. Stomatol.,

Wprowadzenie

Substytucja utraconych zębów ma długą hi-

storię – już starożytni Etruskowie, Egipcjanie,

Rzymianie oraz Majowie praktykowali róż-

ne jej formy z zastosowaniem takich materia-

łów jak: muszle, żelazo, kości zwierzęce [24].

Teoretycznie najlepszym substytutem byłyby

zęby naturalne – uzyskane z własnego ma-

teriału biologicznego pacjenta, bezpośrednio

w jego docelowej lokalizacji. Powyższa kon-

cepcja, choć wydawała się przez wiele lat nie-

możliwa do zrealizowania, nie była jednak

pozbawiona racjonalnych przesłanek: natural-

ne rozwiązania spotykane w świecie zwierząt

świadczą o istnieniu wielu wariantów wymia-

ny i odnowy uzębienia oraz o ogromnym po-

tencjale regeneracyjnym organizmu, w tym o

możliwości odtwarzania nie tylko zębów, ale

także żuchwy wraz z uzębieniem. Argument

podnoszący różnice mechanizmów biologicz-

nych i związane z nimi nieprzekraczalne ba-

riery traci swoją aktualność wobec faktu, że w

warunkach eksperymentalnych udało się wy-

indukować powstanie zębów u ptaków, groma-

dy zwierząt, która w warunkach naturalnych

uzębienia nie ma.

Znaczny postęp, jaki dokonał się w poznaniu

procesu rozwoju zęba, embriologii, biologii

komórek macierzystych, a także w technikach

hodowli komórkowej i iżynierii tkankowej,

pozwala postrzegać odtwarzanie czynnościo-

wych żywych zębów – zębów z hodowli – jako

realną przyszłą alternatywę do współczesnych

metod uzupełniania braków uzębienia [22, 23].

Wykorzystywanie autoregeneracji z zastoso-

waniem własnych tkanek i komórek pacjenta

ma już obecnie miejsce np. w chirurgii szczę-

kowo-twarzowej oraz chirurgii stomatologicz-

nej i stanowi element nowego podejścia do le-

czenia – medycyny regeneracyjnej. Prace nad

uzyskaniem biologicznego zęba zastępczego

prowadzone są w wielu ośrodkach badaw-

czych, także niepublicznych. Autorytety jak

profesor Paul Sharp z King’s College London

wyrażają optymistyczne opinie na temat rysu-

jących się perspektyw.

Cel pracy

Celem pracy było opisanie głównych zało-

żeń, podstaw doświadczeń oraz kierunków ba-

dań w dziedzinie uzyskiwania biologicznego

zęba zastępczego.

Metodyka prób uzyskiwania biologiczne-

go zęba zastępczego

Wytwarzanie żywych zębów zastępczych

będzie w mniejszym lub większym stopniu

opierać się na naturalnych mechanizmach bio-

logicznych rozwoju zęba. Zależność ta jest bar-

dzo wyraźna zwłaszcza w przypadku podejścia

biologicznego, które zakłada reprodukcję pro-

cesu embrionalnego. Jednak również trady-

cyjna inżynieria tkankowa, w której podsta-

wę stanowi wykorzystanie materiałów bioza-

stępczych, obok zastosowania odpowiedniej,

biokompatybilnej matrycy, musi, uwzględniać

naturę rozwoju zęba i dokonać wyboru wła-

ściwego składnika biologicznego – komórek

– oraz uzyskać kontrolę nad ich namnażaniem

i różnicowaniem.

Prowadzi się obecnie badania nad wykorzy-

staniem do tego celu: komórek macierzystych

miazgi zęba (ang. Dental Pulp Stem Cells –

DPSC), komórek macierzystych pozyskanych

z zębów mlecznych (ang. Stem cells from

Human Exfoliated Deciduous teeth – SHED),

komórek macierzystych woreczka zębowego

(ang. Dental Follicle Stem Cells – DFSC),

komórek macierzystych wierzchołkowej czę-

ści brodawki zębowej (ang. Stem Cells of the

Apical part of the Papilla – SCAP), komórek

macierzystych więzadła przyzębnego (ang.

741

2010, 63, 12

Ząb z próbówki

Periodontal Ligament Stem Cells – PDLSC)

oraz komórek macierzystych szpiku kostne-

go (ang. Bone Marrow Mesenchymal Stem

Cells – BMSC) [12, 23]. Sterowanie pro-

cesem wzrostu będzie skuteczniejsze dzięki

znajomości i zastosowaniu czynników oddzia-

łujących w procesie naturalnym: związków

z grupy zwanej czynnikami wzrostu oraz z

grupy czynników transkrypcyjnych (uaktyw-

niających transkrypcję genów, czyli stymu-

lujących w efekcie syntezę różnych białek).

Podstawowe znaczenie mają: białka morfo-

genetyczne kości (ang. Bone Morphogenetic

Proteins – BMP), czynnik wzrostu ﬁbrobla-

stów (ang. Fibroblast Growing Factor – FGF),

białko genu sonic hedgehog – SHH, białka

szlaku sygnalizacyjnego Wnt oraz produkty

genów Pax9, Msx1, -2, Barx1, Pitx2, Lhx-6,

7, Lef, Runx2 [22, 36].

Podstawy doświadczalne

Wstępne doświadczenia dotyczące możli-

wości hodowli zęba polegały na obserwacji

wzrostu zawiązków zębów przeszczepianych

we wczesnych stadiach rozwoju. W doświad-

czeniach tych uzyskiwano w pełni uformowa-

ne korony i częściowo wykształcone korzenie.

Pierwsze doniesienia na ten temat zostały opu-

blikowane przez S. Glasstone już w 1936 r. [5].

W latch późniejszych podobne próby były po-

dejmowane przez Slavkina [27] oraz Kollara

[11] i Kocha [10]. Pomysł modyﬁkowania na-

turalnych zawiązków zęba powstał we wcze-

snych latach 50-ych XX wieku, kiedy to S.

Glasstone wykazała, że obie połówki podzie-

lonego na wczesnym etapie rozwoju zawiąz-

ka zęba podejmują dalszy rozwój i ostatecz-

nie przekształcają się w zęby o prawidłowej

wielkości. Doświadczenie to zademonstrowa-

ło plastyczność i zdolność do samoodnowy

zarodkowych zawiązków zęba, a tym samym

możliwość manipulowania zawiązkami bez

szkody dla ich czynności [6].

Innym zjawiskiem, które legło u podstaw

koncepcji tworzenia biologicznych substytu-

tów zęba, jest naturalna zdolność komórek

wyizolowanych z tkanek do spontanicznej re-

agregacji i tworzenia tkankopodobnych struk-

tur obserwowana początkowo na komórkach

organizmów nizszych. W latach 60-ych XX

w. wykazano, że również komórki zarodko-

we kręgowców spontanicznie reagregują i są

w stanie odtworzyć prawidłowy topograﬁcz-

nie układ charakterystyczny dla danego narzą-

du [33]. Przykładem zdolności do reagregacji,

który bezpośrednio przemawiał za możliwo-

ścią realizacji hodowli zęba z zawiązków, było

odtworzenie układu epitelialno-mezenchymal-

nego z rozdrobnionych tkanek zawiązka wsz-

czepionego w błonę kosmówkowo-owodnio-

wą zarodka kurzego, a następnie uzyskanie

z tak odtworzonej struktury po wszczepieniu

zwierzęciu-biorcy zawiązka zęba [15].

Kolejnym ważnym etapem formułowania

podstaw doświadczalnych i teoretycznych ho-

dowli zęba było prowadzenie tzw. ekspery-

mentów rekombinacyjnych, które polegały na

odpreparowywaniu składnika epitelialnego

bądź mezenchymalnego zawiązka i zastępo-

wania go inną tkanką, a następnie obserwowa-

niu wpływu takiej modyﬁkacji na rozwój zęba.

[35]. Doświadczenia te wykazały kluczową

rolę nabłonka jamy ustnej w indukcji rozwoju

zęba oraz uzależnienie dalszego rozwoju zęba

od wzajemnych oddziaływań między nabłon-

kiem jamy ustnej a mezenchymą. Kamieniem

milowym w rozwoju medycyny było przed-

stawienie pod koniec lat osiemdziesiątych XX

wieku przez transplantologa J. Vacantiego i

chemika R. Langera koncepcji odtwarzania

narządów w warunkach in vitro poprzez ho-

dowlę komórek tych narządów na biodegrado-

walnych rusztowaniach [2]. Sukcesy w rekon-

struowaniu fragmentów wątroby doprowadzi-

742

E. Olender i in.

Czas. Stomatol.,

ły do upowszechnienia tej metody i podjęcia

prób odtwarzania innych narządów, np.: mię-

śnia sercowego, jelita, tchawicy, a także zęba

(żywy ząb jest narządem, składa się bowiem

z tkanek różnych typów, które spełniają okre-

ślone czynności).

Główne założenia i kierunki badań współ-

czesnych

Zasadniczym celem jest wypracowanie spo-

sobu wytwarzania/indukowania powstawania

żywego zęba, który mógłby zastąpić ząb na-

turalny utracony przez pacjenta. Przewaga

zęba żywego nad substytutem zęba polega na

jego możliwościach adaptacyjnych i trwałości.

„Żywy” oznacza obecność składnika komór-

kowego. Obecnie wyróżnić można dwa głów-

ne nurty w poszukiwaniu sposobu realizacji

powyższego celu: nurt wywodzący się z in-

żynierii tkankowej oraz nurt opierający się na

biologii rozwoju i embriologii [19, 26].

Inżynieria tkankowa w celu odtwarzania tka-

nek z deﬁnicji wykorzystuje komórki, czynni-

ki wzrostu oraz, co jest charakterystyczne dla

tego nurtu, rozmaite materiały, z których wy-

konuje się rusztowania nadające kształt przy-

szłemu zębowi i na które wysiewa się w wa-

runkach in vitro komórki. W podejściu opie-

rającym się na biologii rozwoju nie stosuje

się rusztowań dla komórek, nacisk położony

jest na próbę odtworzania procesów embrio-

nalnych (głównie oddziaływań epitelialno-me-

zenchymalnych). Podstawową różnicę między

obu podejściami można opisać nastepująco:

w podejściu inżynieryjnym dąży się do skon-

struowania zęba, w podejściu biologicznym/

embrionalnym do stworzenia warunków uru-

chamiających naturalne mechanizmy rozwo-

ju zęba.

Teoretycznie istnieją cztery drogi uzyskania

biologicznego zęba zastępczego: 1) skonstru-

owanie zęba z użyciem rusztowań i komórek

od razu w całości i w postaci dojrzałej, 2) skon-

struowanie zęba z użyciem rusztowań, komó-

rek i czynników wzrostu w postaci niedojrza-

łej – dalszy rozwój następowałby w warun-

kach hodowli lub już w organizmie biorcy, 3)

indukowanie powstawania zęba z odpowied-

nio dobranych komórek poprzez odtworzenie

naturalnych warunków powstawania zawiązka

zęba, w warunkach poza organizmem lub w

organizmie biorcy, 4) indukcja powstania trze-

ciej i kolejnych generacji zębów w szczęce/żu-

chwie pacjenta poprzez manipulacje genetycz-

ne lub zastosowanie odpowiednich czynników

stymulujących (czynników wzrostu itp.) [19,

26]. Obecnie realizowane są próby głównie na

drodze drugiej i trzeciej.

Konstruowanie zastępczego żywego zęba

wyłącznie w warunkach in vitro oraz indukcja

trzeciej generacji zębów in vivo – dwie skraj-

ne koncepcje uzyskania żywych zębów zastęp-

czych – pozostają na razie w sferze rozważań

i badań wstępnych.

W praktyce prowadzi się intensywne prace

nad „trzecią drogą”, która łączy w sobie me-

todykę inżynierii tkankowej oraz wykorzysta-

nie mechanizmów biologii rozwoju. Ogólnie

rzecz biorąc, celem jest wytworzenie w wa-

runkach laboratoryjnych konstruktów o funk-

cji zawiązka zęba, który po wszczepieniu daw-

cy kontynuowałby rozwój, aż do uformowa-

nia dojrzałego, wyrzniętego zęba. Próby idą

w dwóch zasadniczych kierunkach: tworzenia

konglomeratu komórek zdolnych do różnico-

wania w komórki zęba i tworzenia jego tkanek

z zastosowaniem rusztowania-podpory dla ko-

mórek [19, 26].

Podejście inżynieryjne – z zastosowaniem

rusztowań

Ze względu na niewielki rozmiar ząb wy-

daje się być idealnym narządem-kandydatem

do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych.

743

2010, 63, 12

Ząb z próbówki

Pierwsze podejście, zbliżone do tradycyjnej in-

żynierii tkankowej, zakłada możliwość skon-

struowania zęba, o strukturze trójwymiarowej

uformowanej poprzez zastosowane rusztowa-

nia o odpowiednim kształcie. Na rusztowa-

nie wysiewane są odpowiednio dobrane ko-

mórki, które mnożąc się zasiedlają stopniowo

całe rusztowanie. Zazwyczaj materiał, z któ-

rego wykonane są rusztowania, jest biodegra-

dowalny, a więc z czasem zanika, a jego miej-

sce zajmuje macierz wytworzona przez ko-

mórki. Macierz utrzymuje wyznaczony przez

rusztowanie pierwotny kształt całej struktu-

ry. Ponieważ komórki i tkanki cechuje zdol-

ność do reagregacji, przyjmuje się również, że

zmieszanie odpowiednich typów komórek w

odpowiednich proporcjach i umieszczenie ich

na matrycy odwzorowujacej naturalne, trójwy-

miarowe środowisko powinno doprowadzić do

odbudowy tkanki czy narządu, z której dane

komórki pochodzą [2]. Podejście to budziło

duże nadzieje ze względu na zakładaną moż-

liwość łatwego modelowania kształtu hodo-

wanych zębów.

W praktyce, w warunkach eksperymental-

nych istotnie dokonano postępu w zakresie

kontroli kształtu żywego dzięki zastosowaniu

odpowiednio uformowanych rusztowań z gą-

bek kolagenowych i sekwencyjnemu wysie-

waniu komórek mezenchymy zębotwórczej w

bezpośrednim kontakcie z nabłonkiem zębo-

twórczym. Jednak efekty nie są w pełni zada-

walające [7]. Robey [25] zaproponował mody-

ﬁkację metody, według której każdą ze skła-

dowych zęba należy odtwarzać indywidualnie:

koronę z materiału syntetycznego o właści-

wościach szkliwa, wypełnioną biomateriałem

HA/TCP (hydroksyapatyt/fosforan wapnia) z

zawieszonymi w nim komórkami macierzy-

stymi, zaś korzeń z wykorzystaniem komórek

macierzystych więzadła przyzębnego PDLSC.

Konstrukt taki byłby wszczepiany np. do mię-

śnia, jako naturalnego „inkubatora”. Stamtąd,

w odpowiednim momencie byłby przeszcze-

piany do jamy ustnej. Autorzy koncepcji nie

opisują jednak szczegółowo sposobu odtwo-

rzenia zębiny korony i korzenia. Opisana me-

toda wykorzystywałaby nieresorbowalny ma-

teriał syntetyczny – nie byłby to więc w całości

ząb biologiczny. Byłby to zatem żywy implant.

Zaletą metody jest pełna kontrola nad kształ-

towaniem korony oraz możliwość zautoma-

tyzowania procesu wytwarzania zębów i tym

samym prowadzenia procesu na dużą skalę.

Wadą metody jest niemożność ominięcia eta-

pu inkubacji w tkankach biorcy.

Zespół P.C.Yelick zaproponował odmienną

metodę i wykonał jej eksperymentalną we-

ryﬁkację [3]. Z trzecich niewyrzniętych zę-

bów trzonowych świń (sześciomiesięcznych)

i szczurów (czterodniowych) pozyskiwa-

no tkanki zawiązka zęba w późnym stadium

pączka. Tkanki trawiono enzymatycznie w

celu uwolnienia komórek. Komórki następ-

nie namnażano i wysiewano na biodegrado-

walne rusztowania polimerowe (z poliglikolu,

polimleczanu, polimleczano-co-glikolu) ufor-

mowane na kształt zębów siecznych i trzono-

wych. Rusztowania dla komórek świńskich

miały wymiary 1 x 0,5 x 0,5 cm, dla szczu-

rzych 1 x 5 x 5 mm. Tak przygotowane kon-

strukty wszczepiano chirurgicznie szczurom

w tkankę sieci i pozostawiano na 12-30 tygo-

dni. Po tym czasie wszczepy eksplantowano i

poddawano analizie histologicznej. Analiza ta

potwierdziła obecność drobnych struktur zę-

bopodobnych o wymiarach od 1 do 2 mm, wy-

kazujących cechy kształtu koron zębów trzo-

nowych. Jednak we wszystkich przypadkach

kształt ten nie odwzorowywał kształtu użytego

rusztowania. Uzyskane twory były też znacz-

nie mniejsze, aniżeli wszczepione rusztowa-

nia. W powstałych strukturach obecne były

ameloblasty i odontoblasty. Nie stwierdzono

744

E. Olender i in.

Czas. Stomatol.,

wykształcenia się korzenia, ani tkanki kost-

nej, której tworzenie towarzyszy powstawaniu

zęba w warunkach naturalnych.

Wyniki powyższego doświadczenia inter-

pretuje się raczej jako dowód na reorganizo-

wanie się użytych elementów epitelialnych i

mezenchymalnych, nie zaś na formowanie sie

tkanek de novo. Porównywalne wyniki uzy-

skano w doświadczeniu z komórkami wyizo-

lowanymi z pączka zęba trzonowego cztero-

dniowego szczura. W odróżnieniu od poprzed-

niego doświadczenia, komórki przed wysia-

niem były utrzymywane w hodowli in vitro

przez 6 dni. Po tym czasie zostaly wysiane na

rusztowanie i wraz z nim wszczepione szczu-

rom-biorcom. Implanty pozostawiono na 12

tygodni. W efekcie doświadczenia otrzymano

drobne skupiska chaotycznie zorganizowanej

tkanki zębopodobnej, która nie osiągnęła roz-

miarów rusztowania [3].

W 2008 r. zespół P.C. Yelick wykonał do-

świadczenia z zastosowaniem rusztowania ob-

sianego w jednej części komórkami pocho-

dzącymi z zawiązka zęba w stadium pączka,

w drugiej mezenchymalnymi komórkami ma-

cierzystymi szpiku kostnego. Konstrukty wsz-

czepiano do żuchwy zwierzęcia-dawcy komó-

rek. Efekty oceniano po 12 i 20 tygodniach.

Stwierdzono obecność małych zębopodob-

nych tworów składających się z zębiny, szkli-

wa, miazgi, cementu, ozębnej, otoczonych zre-

generowaną tkanką kostną. Nie zaobserwowa-

no struktur korzenia [4].

Niepowodzenie w uzyskaniu jakichkolwiek

struktur korzeniopodobnych przełamał zespół

Sonoyamy w 2006 r. Na rusztowania z HA/

TCP ukształtowane na kształt korzenia wysie-

wano komórki macierzyste wywodzące się z

brodawki wierzchołkowej (SCAP) i więzadła

przyzębnego (PDLSC) świń [23], a następnie

umieszczano rusztowania w zębodole poeks-

trakcyjnym. Analiza tomograﬁczna i histolo-

giczna wykonana po 4 tygodniach i 6 miesią-

cach wykazała częściową regenerację korze-

nia (odtworzona została zębina) oraz ozębnej

[29].

Nie w pełni satysfakcjonujące efekty me-

tod inżynierii tkankowej tłumaczy się ne-

gatywnym wpływem samego rusztowania.

Rusztowanie stanowi barierę dla odontogen-

nych oddziaływań epitelialno-mezenchymal-

nych oraz dla przepływu informacji pozycyj-

nej (gradientu morfogenów) w kształtujacym

się zębie. Poza tym kwaśne produkty degrada-

cji tworzywa użytego do budowy rusztowania

wpływają niekorzystnie na mikrośrodowisko

tworzącego się zęba [8].

Podejście biologiczne

Drugie podejście, bez użycia rusztowania,

realizuje strategię w większym stopniu opar-

tą na naśladowaniu naturalnych procesów po-

wstawania zębów, obserwowanych w rozwoju

zarodkowym. Metoda ta wymaga pełniejszego

zrozumienia mechanizmów kontroli wczesnych

etapów wykształcania się zęba. Wiodącym

ośrodkiem, który podjął ten kierunek badań,

jest Katedra Rozwoju Twarzoczaszki w King’s

College w Londynie. Grupa badawcza skupia

sie wokół założyciela i kierownika Katedry –

profesora P. T. Sharpe’a. Zespół ten prowadzi

doświadczenia głównie na komórkach mysich,

zarodkowych, jak i osobników dorosłych. Osią

koncepcji jest wykorzystanie naturalnego po-

tencjału oddziaływań epitelialno-mezenchy-

malnych, zwłaszcza zdolności komórek na-

błonka jamy ustnej do indukcji rozwoju zęba

[17, 19]. Ich doświadczenia polegały na wy-

tworzeniu konglomeratu komórek mezenchy-

malnych nie pochodzących z zawiązka zęba,

które pokrywano warstwą komórek embrio-

nalnych komórek nabłonka jamy gębowej (ko-

mórki mezenchymalne należały do jednego

z trzech pierwotnie nieodontogennych typów

745

2010, 63, 12

Ząb z próbówki

komórek: mezenchymalnych zarodkowych

komórek macierzystych, nerwowych komó-

rek macierzystych, komórek szpiku osobni-

ka dorosłego), utrzymaniu konglomeratu w

warunkach hodowli przez 2-3 dni, a następ-

nie wszczepieniu go podtorebkowo do ner-

ki myszy i oceny jego struktury po 10 – 14

dniach. Po tym czasie stwierdzono wyraźne

formowanie struktur korony zęba i tkanki kost-

nej w każdym przypadku, niezależnie od ro-

dzaju zastosowanych komórek mezenchymal-

nych. Doniosłość tych wyników tkwi w fakcie,

że okazało się możliwym zastosowanie jako

komponentu mezenchymalnego komórek in-

nych niż zarodkowych, czy wywodzących się

z niewyrzniętych zębów [21].

W 2007 roku grupa badaczy skupiona wo-

kół T. Tsuji z Tokyo University zaproponowała

metodę także bez użycia rusztowania, w której

konglomerat komórek zatapiany był w kropli

żelu kolagenowego, a następnie inkubowany

in vitro bądź wszczepiany podtorebkowo do

nerki. W doświadczeniach z użyciem komó-

rek epitelialnych i mezenchymalnych wyizo-

lowanych z mysiego zawiązka siekacza uzy-

skano każdorazowo zawiązki zęba (zarówno

w wariancie in vitro, jak i in vivo). Zawiązki

te wszczepiano dorosłej myszy do zębodołu

po ekstrakcji siekacza. Obserwowano normal-

ny rozwój korony siekacza z obecnością szkli-

wa, miazgi, naczyń krwionośnych i nerwów, a

także początki wytwarzania struktur korzenia.

Nie wiadomo jednak, czy wytworzony ząb jest

w stanie się wyrznąć [20]. Poza badaniami do-

tyczącymi uzyskania samego zęba prowadzi

się także prace nad możliwością pełnego zasy-

milowania zęba zastępczego ze środowiskiem

jamy ustnej, w tym jego ukrwieniem i uner-

wieniem [14, 18].

Odniesienia do biologii kręgowców

Uzyskiwanie żywego zęba drogą hodowli

komórkowej będzie polegać, przynajmniej w

części, na wykorzystaniu i naśladowaniu pro-

cesów naturalnych. Poznanie mechanizmów

sterujących tymi procesami jest kluczowym

zadaniem. Zrozumienie podstaw odmiennej

biologii zęba u gatunków bardziej odległych

taksonomicznie i genetycznie od człowieka

może mieć także duże znaczenie.

Zęby są strukturami charakterystycznymi

dla kręgowców. Występują u ryb, płazów, ga-

dów i ssaków. Prawdopodobnie wykształciły

się jako przydatki skórne (podobnie jak wło-

sy czy gruczoły potowe), które wtórnie zaję-

ły obszar jamy gębowej i uzyskały połączenie

z kością [13]. U wielu ryb spodoustych bło-

na śluzowa jamy gębowej wysłana jest łuska-

mi plakoidalnymi, tworami o funkcji zębów,

podobnymi do tych, które pokrywają skórę.

Identyczność budowy wewnętrznej zębów i

łusek plakoidalnych oraz istnienie tworów po-

średnich świadczy o ich pełnej homologii [30].

Stanowi to przesłankę, by poszukiwać braku-

jącego komponentu epitelialnego niezbędne-

go do rozwoju zęba w nabłonku skóry. U ryb,

płazów i gadów okres życia zęba jest ograni-

czony. Po pewnym czasie ząb wypada, a na

jego miejsce wyrzyna się ząb należący do na-

stępnej generacji. Wymiana taka może trwać

całe życie. U rekinów, u których wymiana

zębów następuje szybko, można dostrzec na

przekroju szczęki lub żuchwy kolejne zęby w

różnym stopniu rozwoju. Wymiany następują

niezależnie od stanu zębów w danym momen-

cie używanych – rolą wymiany zębów nie jest

zastępowanie konkretnych zniszczonych zę-

bów. Sytuacja u ssaków, a więc i ludzi, w któ-

rej wymiana zębów następuje najwyżej jeden

raz i nie obejmuje nigdy wszystkich zębów

(diﬁodontyzm) nie jest zatem uniwersalnym

rozwiązaniem biologicznym [30].

Być może zjawisko występowania trze-

ciej generacji zębów u człowieka w przypad-

746

E. Olender i in.

Czas. Stomatol.,

ku mutacji genu Runx2 jest dowodem na to,

że poliﬁodontyzm może zostać przywrócony

przy zmienionej ekspresji niektórych genów.

Przykładem możliwości uruchomienia „uśpio-

nych” mechanizmów odontogenezy jest wy-

wołanie rozwoju zęba w jamie gębowej kur-

cząt. Mimo, że ptaki utraciły uzębienie 80 mi-

lionów lat temu, prawdopodobnie jako przy-

stosowanie do lotu, nadal jednak mają geny

umożliwiające odpowiednie interakcje mię-

dzytkankowe i wykształcenie zębów. W wa-

runkach eksperymentalnych, po przeszczepie-

niu do embrionu kurczęcia mysich komórek

grzebienia nerwowego (prekursorów składni-

ka epitelialnego zawiązka zęba) składnik me-

zenchymatyczny, wywodzący się z kurczęcia,

odpowiada na stymulację przez mysi składnik

epitelialny skutkując wykształceniem struktur

zębopodobnych [16].

W przeciwieństwie do człowieka, u wielu

kręgowców zębotwórczy składnik epitelialny

jest dostępny także po wykształceniu się dojrza-

łych zębów. I tak, siekacz gryzoni cechuje stały

wzrost. Jest to możliwe dzięki podziałom ko-

mórek epitelialnych w strukturze zwanej pętlą

wierzchołkową (ang. cervical loop). Znajdują

się w niej komórki macierzyste, które, dzieląc

się asymetrycznie, odtwarzają komórkę macie-

rzystą i komórkę ukierunkowaną na różnicowa-

nie do ameloblastów. Ta ostatnia przemieszcza

się ku brzegowi siecznemu zęba, gdzie prze-

kształca się w czynną komórkę szkliwotwór-

czą [31]. Jak wspomniano wyżej, bierze się pod

uwagę tworzenie konstruktów-chimer, które za-

wierać będą obok komórek ludzkich, odpowia-

dających składnikowi mezenchymatycznemu,

komórki pętli wierzchołkowej siekaczy gryzo-

ni. Obecność stale odnawiającego się składnika

epitelialnego, zawierającego epitelialne komór-

ki macierzyste, umożliwia również wielokrotną

wymian zębów u ryb – wykazano to m.in. na

przykładzie zębów gatunku Danio pręgowa-

ne (ang. Zebraﬁsh). Stwierdzono znaczne po-

dobieństwa między rozwojem zęba następcze-

go a odnową krypt jelitowych i morfogenezą

mieszka włosowego. Interesujące jest również,

że wzorzec ekspresji genów dla zębów pierw-

szej generacji jest inny, aniżeli dla kolejnych

generacji [9].

Kwestie do rozwiązania. Perspektywy

Bioinżynieria zębów w porównaniu do bio-

inżynierii innych narządów uczyniła bardzo

duży postęp w stosunkowo krótkim czasie.

Wykazano bezsprzecznie, że: po pierwsze,

można wytworzyć struktury korony zęba sto-

sując komórki zawiązka zęba i rusztowania,

po drugie, można odtworzyć koronę zęba bez

użycia rusztowania, wykorzystując embrional-

ny nabłonek jamy ustnej i macierzyste komór-

ki mezenchymatyczne szpiku, po trzecie, me-

zenchymatyczne komórki macierzyste szpi-

ku mogą różnicować się w kierunku komórek

odontogennych, po czwarte, komórki ze zdy-

socjowanych tkanek zawiązka zęba zawieszo-

ne w kolagenie mogą rozwinąć się w prawidło-

wy zawiązek zęba, ukształtować prawidłową

koronę i korzeń po wszczepieniu ortotopowym

u dorosłego biorcy [28, 35].

Wykonane doświadczenia pozwoliły także

zidentyﬁkować ograniczenia, z którymi na-

uka i biotechnologia muszą się zmierzyć: za-

wodność metod tradycyjnej inżynierii tkanko-

wej, brak zadawalającego substytutu embrio-

nalnych komórek epitelialnych, niezbędnych

do rozwoju zęba, fragmentaryczna znajomość

mechanizmów molekularnych towarzyszących

wykształcaniu sie zęba, odrzucanie przeszcze-

pu (jeśli z różnych względów stosowany w ho-

dowlii materiał komórkowy będzie allo– bądź

ksenogeniczny), trudności w kontrolowaniu

kształtu, wielkości i koloru wytwarzanych zę-

bów. Poza tym, do rozwiązania pozostają kwe-

stie: asymilacji zęba uzyskanego in vitro ze

747

2010, 63, 12

Ząb z próbówki

środowiskiem, skrócenia czasu rozwoju zęba

do postaci dojrzałej (miesiące zamiast lat), in-

dukcji wyrzynania się zęba zastępczego, uzy-

skiwania komórek zdolnych do różnicowania

i efektywnego namnażania od pacjentów w

starszym wieku [28, 35].

Podsumowanie

W świetle powyższego, prognozy przewi-

dujące wypracowanie skutecznej metodolo-

gii uzyskiwania biologicznych zębów zastęp-

czych w ciągu najbliższych lat mogą okazać

się nadmiernie optymistyczne.

Piśmiennictwo

1. Chai Y, Slavkin HC: Prospects for tooth re-

generation in the 21st century: a perspective.

Microsc Res Tech 2003, 60 (5): 469-79.

2. Cima L G, Vacanti J P, Vacanti C, Inqber D,

Mooney D, Langer R: Tissue engineering by

cell transplantation using degradable poly-

mer substrates. J Biomech Eng 1991, 113 (2):

143-151.

3. Duailibi M T, Duailibi S E, Young C S, Barlett

J D, Vacanti I P, Yelick P C: Bioengineered

teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent

Res 2004, 83: 523-528.

4. Duailibi S E, Duailibi M T, Zhang W, Asrican

R, Vacant I P, Yelick P: Bioengineered dental

tissues grown in the rat jaw. J Dent Res 2008,

87: 745-750.

5. Glasstone-Hughes S: The development of

tooth germs in vitro. J Anat 1936, 70: 260-

-266.

6. Glasstone-Hughes S: The development of

halved tooth germs; a study in experimental

morphology. J Anat 1952, 86: 12-25.

7. Honda MJ, Tsuchiya S, Sumita Y, Sagara H,

Ueda M:The sequential seeding of epithelial

and mesenchymal cells for tissueengineered

tooth regeneration. Biomaterials 2007, 28:

680-689.

8. Hu B, Nadiri A, Kuchler-Bopp S, Perrin-

Schmitt F, Peters H, Lesot H: Dental epithe-

lial histomorphogenesis in vitro. J Dent Res

2005, 84: 521-525.

9. Huysseune A: Formation of a succession-

al dental lamina in the zebraﬁsh (Danio re-

rio): support for a local control of replace-

ment tooth initiation. Int J Dev Biol 2006, 50

(7):637-643.

10. Koch W E: Tissue interaction during in vitro

odontogenesis. W: Slavkin H C, Bavetta L A

red. Developmental Aspects of Oral Biology.

Academic Press Inc. New York 1972, 126-

-149.

11. Kollar E J, Baird G: The inﬂuence of the den-

tal papilla on the development of tooth shape

in embryonic mouse germs. J Embryo Exp

Morph 1969, 21: 131-148.

12. Li ZY, Chen L, Liu L, Lin YF, Li SW, Tian WD:

Odontogenic potential of bone marrow me-

senchymal stem cells. J Oral Maxillofac Surg

2007, 65 (3): 494-500.

13. Lin Y, Yelick P: Dental tissue engineering.

W: Atala A, Lanza R editors: Principles in

Regenerative Medicin. Elsevier 2008.

14. Luukko K, Moe K, Sijaona A, Furmanek T,

Hals Kvinnsland I, Midtbø M, Kettunen P:

Secondary induction and the development of

tooth nerve supply. Ann Anat 2008, 190 (2):

178-187.

15. Main JH: Retention of potential to differen-

tiate in long-term cultures of tooth germs.

Science 1966, 152: 778–780.

16. Mitsiadis TA, Caton J, Cobourne M: Waking-

up the sleeping beauty: recovery of the ances-

tral bird odontogenic program. J Exp Zool B

Mol Dev Evol 2006, 306 (3): 227-233.

17. Modino SA, Sharpe PT: Tissue engineering

of teeth using adult stem cells. Arch Oral Biol

2005, 50 (2): 255-258.

18. Nait Lechguer A, Küchler-Bopp S, Hu B,

Haïkel Y, Lesot H:Vascularization of engi-

neered teeth. J Dent Res 2008, 87 (12):1138-

-1143.

19. Nakahara T, Yoshiaki I: Tooth regeneration:

748

E. Olender i in.

Czas. Stomatol.,

Implications for the use of bioengineered or-

gans in ﬁrst-wave organ replacement. Human

Cell 2007, 20: 63-70.

20. Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y,

Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T: The

development of a bioengineered organ germ

method. Nat Methods 2007, 4 (3):227-30.

21. Ohazama A, Modino S A, Miletich I, Sharpe P

T: Stem-cell-based tissue engineering of mu-

rine teeth. J Dent Res 2004, 83 (7): 518-522.

22. Olender E, Kamiński A, Ubrynowska-

Tyszkiewicz I, Wanyura H: Aspekty histolo-

giczne i molekularne mechanizmy kontro-

li naturalnego rozwoju zęba. Czas Stomatol

2010, 63, 9: 543-550.

23. Olender E, Kamiński A, Ubrynowska-

Tyszkiewicz I, Wanyura H: Komórki macie-

rzyste tkanek zęba i możliwości odtwarzania

struktur zęba – przegląd pismiennictwa. Czas

Stomatol 2010, 63, 11: 682-692.

24. Ring ME: A thousand years of dental im-

plants: a deﬁnitive history. Comp Cont Edu

Dent 1995, 16: 1060-1069.

25. Robey PG: Post-natal stem cells for dental and

craniofacial repair. Oral Biosci Med 2005, 2:

83-90.

26. Sartaj R, Sharpe P: Biological tooth replace-

ment. J Anat 2006, 209: 503-509.

27. Slavkin H C, Beierle J, Bvetta L A:

Odontogenesis: cel-cell interaction in vitro.

Nature 1968, 217: 269-217.

28. Snead M L: Whole-tooth regeneration: it takes

a village of scientists, clinicians, and patients.

J Dent Educ 2008, 72 (8): 903-911.

29. Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo

BM, Zhang C, Liu H, Gronthos S, Wang CY:

Mesenchymal stem cell-mediated functional

tooth regeneration in swine. PLoS One 2006,

20, 1: e79.

30. Szarski W: Anatomia porównawcza kręgow-

ców. Państwowe Wydawnictwo Naukowe,

Warszawa 1987, 514-529.

31. Tummers M, Thesleff I: Root or crown: a de-

velopmental choice orchestrated by the dif-

ferential regulation of the epithelial stem

cell niche in the tooth of two rodent species.

Development 2003, 130 (6): 1049-1057.

32. Wang S, Shi S: Mesenchymal stem cell-me-

diated functional tooth regeneration in swine.

PLoS 2006, 20, 1:e79.

33. Weiss P, Taylor AC: Reconstitution of com-

plete organs from single-cell suspensions

of chick embryos in advanced stages of dif-

ferentiation. Proc Natl Acad Sci USA 1960,

46:1177-1185.

34. Yen A, Sharpe P: Stem cells and tooth tissue

engineering. Cell Tissue Res 2008 331: 359-

-372.

35. Yu J, Shi J, Jin Y: Current approaches and

challenges in making a bio-tooth. Tissue Eng

Part B Rev 2008, 14 (3): 307-319.

36. Zhang Y, Chen Z, Song Y, Liu C, Chen Y:

Making a tooth: growth factors, transcription

factors, and stem cells. Cell Research 2005,

15 (5): 301-316.

Adress: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5

Tel./Fax: 22 6217543

e-mail: ewa.olender@wum.edu.pl

Paper received 5 July 2010

Accepted 11 January 2011