Ćwiczenia laboratoryjne z przedmiotu „Biopolimery” dla makrokierunku Bioinformatyka

Ćwiczenia laboratoryjne z przedmiotu „Biopolimery” dla

makrokierunku Bioinformatyka

Przygotował: mgr Michał Dobkowski

I. Wyodrębnianie RNA z drożdży. Elektroforeza agarozowa kwasów

nukleinowych.

RNA obecne w drożdżach można wyekstrahować ze zhomogenizowanych komórek za

pomocą 2% roztworu soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS). Tak otrzymany ekstrakt zawiera
niewielkie ilości DNA (<0,5%) i białka (<2,0%). Charakterystykę jakościową otrzymanego RNA
można wykonać przy pomocy elektroforezy żelowej.

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:



Świeże drożdże



2% roztwór SDS (soli sodowej siarczanu dodecylu)



95% etanol



Roztwór octanu potasu (200 g/

, pH 5,0)



Bufor TBE (Tris/kwas borowy/EDTA) – roztwór podstawowy 10-krotnie stężony o składzie:

108 g Tris, 55 g kwasu borowego oraz 3,7 g EDTA w 1000 m

wodnego roztworu



Bufor ładujący: 50% roztwór gliceryny w buforze TBE z dodatkiem błękitu

bromofenylowego



Wirówka



Łaźnia wodna



Kolby płaskodenne i okrągłodenne



Cylindry miarowe



Zlewki



Agaroza



Bromek etydyny



Aparat do elektroforezy agarozowej



Transluminator lub zwykła lampa UV

Wykonanie ćwiczenia
1. Izolacja RNA



W kolbie płaskodennej doprowadzić do wrzenia 10 m

2% roztworu SDS. Do wrzącego

roztworu dodać 2 g rozdrobnionych świeżych drożdży, zawartość ogrzewać przez 3 minuty.



Kolbę schłodzić strumieniem zimnej wody z kranu, przenieść jej zawartość do probówki

wirówkowej i odwirować przez 10 min przy 6000 RPM.



Supernatant przenieść do kolbki płaskodennej, dodać 1 m

roztworu octanu potasu

oraz 22 m

etanolu.



Mieszaninę z wytrąconym RNA wsadzić do zamrażalnika na 0,5 godziny, a następnie

odwirować przez 6 min przy 6000 RPM.



Roztwór znad osadu zdekantować, zaś otrzymany osad RNA rozpuścić w 1 m

wody.

!!!

Roztwory otrzymane w wyniku izolacji RNA z drożdży należy przechowywać w temperaturze

0°C, aż do momentu ich analizy.

2. Przygotowanie żelu



Przygotować 2

rozcieńczonego buforu TBE biorąc 1 część stężonego roztworu i 9 części

wody.



Następnie naważyć 0,8 g agarozy i dodać ją do 100 m

uprzednio przygotowanego buforu

w kolbie płaskodennej. Całość doprowadzić do wrzenia i odczekać, aż cały roztwór będzie
klarowny.



Odczekać 2-3 minuty a następnie dodać 5 μ

bromku etydyny

. Po rozpuszczeniu bromku

etydyny całość starannie wymieszać.

* Ostrożnie, substancja kancerogenna, należy pracować tylko w rękawiczkach!



Zmontować pod wyciągiem zestaw do wylewania żelu agarozowego i do poprawnie

zamontowanego zestawu (uwaga: sprawdzić szczelność!) wylać roztwór agarozy. Należy
pamiętać, aby w zestawie znajdował się grzebień do tworzenia studzienek w żelu.



Po 20 minutach żel przenieść do aparatu do elektroforezy agarozowej, zalać uprzednio

przygotowanym rozcieńczonym buforem TBE i ostrożnie wyjąć grzebień z żelu.

3. Nanoszenie próbki na żel



W probówkach Eppendorfa umieścić kolejno 20, 40, 60 i 100 μ

otrzymanego w wyniku

izolacji roztworu RNA i do każdej z nich dodać odpowiednio takie same objętości buforu
ładującego.



Zachowując ostrożność delikatnie nanieść próbkę do studzienki za pomocą pipety

automatycznej.

Należy pamiętać o tym, że podczas pracy z RNA lub DNA, trzeba pracować w rękawiczkach
jednorazowych, a szkło powinno być czyste (najlepiej przemyte bezpośrednio przed użyciem
etanolem i wysuszone).

Zakres materiału: budowa i funkcje kwasów nukleinowych, metoda elektroforezy żelowej

Literatura:
Stryer L. Biochemia; PWN
Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN, 1999
Murray R. K. Biochemia Harpera; PZWL

II. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforda

Białka należą do podstawowych biopolimerów wchodzących w skład komórki. Zmiany

stężenia białek kontrolują procesy metaboliczne komórki. Ponadto oznaczenie stężenia białka
umożliwia określenie wartości energetycznej spożywczych produktów białkowych.

Do określenia stężenia białka używana jest metoda Melanii M. Bradford. Wykorzystuje

zjawisko tworzenia się kompleksu pomiędzy barwnikiem (Coomassie Brilliant Blue) a białkami.
(Cząsteczka barwnika CBB oddziałuje poprzez grupy -SO

-3

z dodatnio naładowanymi resztami

aminokwasowymi). Kompleks białko-barwnik powoduje przesunięcie długości fali odpowiadającej
maksimum absorpcji barwnika CBB* z 465 nm do 595 nm. Wartość absorbancji jest proporcjonalna
do stężenia białka. Jako wzorzec białka stosuje się albuminę bydlęcą. Liniowa zależność absorbancji
od stężenia leży w zakresie stężenia białka 0,1-1,4 mg/ml

*Błękit brylantowy Coomassie G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z
białkiem zmienia się na błękitne. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze.

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:



Próbki białka o nieznanym stężeniu (np. mleko)



Roztwór wzorcowy białka o stężeniu 1 mg/m



Odczynnik Bradford



1% roztwór kwasu octowego



Probówki zwykłe szklane oraz wirówkowe



Pipety miarowe automatyczne: 20-200 µl oraz 200-3000 µl



Wirówka



Kuwety pomiarowe plastikowe



Spektrofotometr UV-Vis

Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie próbki białka do pomiarów



Do probówki wirówkowej z 10 m

lekko ogrzanego mleka dodać powoli, mieszając, 4 m

1% kwasu octowego.



Wytrącony osad kazeiny odwirować przy 5000 RPM przez 5 min.



Supernatant wykorzystać do ilościowego oznaczenia sumarycznej zawartości globulin

i albumin w mleku.



Roztwór wzorcowy białka o znanym stężeniu początkowym (1 mg/m

) rozcieńczyć wodą

destylowaną w taki sposób, aby otrzymać po 0,1 m

rozcieńczonych roztworów wzorca

o stężeniach pokazanych w tabeli poniżej.

Nr probówki

Objętość odczynnika

Bradford [mL]

Objętość roztworu białka

]

Stężenie roztworu

białka [mg/mL]

0,1 (woda destylowana)

0,1 (roztwór wzorca)

0,25

0,1 (roztwór wzorca)

0,50

0,1 (roztwór wzorca)

0,75

0,1 (roztwór wzorca)

1,00

0,1

(nieznana próbka)



W 6 suchych probówkach umieścić po 2 m

odczynnika Bradford i jak najszybciej dodać po

0,1 m

roztworu białka zgodnie z opisem w tabeli powyżej. Delikatnie wymieszać zawartość

każdej probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.



Po inkubacji, przy pomocy spektrofotometru UV-Vis, zmierzyć w kuwecie plastikowej

absorbancję próbek przy λ=595 nm. Kompleks białko-barwnik jest trwały przez 60 minut.
Absorbancja poszczególnych próbek powinna być zmierzona w jak najkrótszych odstępach
czasu. Kuwety między pomiarami można płukać metanolem. Kuwety myje się zanurzając je
na kilka godzin w 0,1 M roztworze HCl.

2. Opracowanie wyników



Na podstawie uzyskanych wyników, wykreślić krzywą wzorcową. Od wartości absorbancji

dla każdej próbki należy odjąć wartość absorbancji probówki nr 1 (tylko odczynnik
Bradford).



Z krzywej odczytać stężenie białka w nieznanej próbce (probówka nr 6). Określić

sumaryczną zawartość globulin i albumin w mleku.

Zakres materiału: Metody oznaczania stężenia białek, budowa I-IV rzędowa i funkcje białek,

wiązanie peptydowe.

Literatura:
Stryer L. Biochemia; PWN
Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN, 1999
Murray R. K. Biochemia Harpera; PZWL
Jakubke H., Jeschkeit H. Aminokwasy, peptydy, białka; PWN

III. Synteza dipeptydu

Synteza peptydów metodą klasyczną, inaczej zwana syntezą w roztworze, jest dużo bardziej

praco-  i  czasochłonna  od  metody  syntezy  na  nośniku  stałym.  Jednak  w  niektórych  sytuacjach,  jak
łączenie  ze  sobą  długich  polipeptydów,  jest  w  dalszym  ciągu  powszechnie  stosowana.
Obecność  reaktywnych  grup  funkcyjnych w  aminokwasach powoduje konieczność ich blokowania
w trakcie syntezy. Do syntezy wiązania peptydowego stosowane są związki chemiczne powodujące
kondensację grupy aminowej i karboksylowej, takie jak dicykloheksylokarbodiimid  (DCC). Zwykle
najtrudniejszym  i  najbardziej  czasochłonnym  elementem  każdego  etapu  syntezy  jest  proces
oczyszczania zsyntezowanego peptydu.

Stosowane skróty:
ACN - acetonitryl
Boc – t-butyloksykarbonyl
DCC – N,N’-dicykloheksylokarbodiimid
DCM – dichlorometan
DIC − N,N’-diizopropylokarbodiimid
DMF - dimetyloformamid
TEA – trietyloamina
HCl*Gly-OMe – chlorowodorek estru metylowego glicyny

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:



HCl*Gly-OMe

0,4 mmola (M.cz. = 125,6)



Boc-Leu-OH

0,4 mmola (M.cz. = 231,3)



DCC

0,4 mmola (M.cz. = 206,3)



DCM

10 m



TEA

0,4 mmola (M.cz. = 101,19; d = 0,726 g/m

)



octan etylu

80 ml



5% HCl

40 ml



NaHCO

3(nas.)

40 ml



CaSO

(bezwodny)



acetonitryl



ninhydryna



kolba okrągłodenna 50 ml z korkiem



kolba okragłodenna 250 ml z korkiem



kolba płaskodenna 250ml z korkiem



rozdzielacz 250 ml



sączki bibułowe



płytki TLC bez indykatora fluorescencyjnego



lejki szklane x 4



mieszadło magnetyczne



myszki do mieszania



cylinder miarowy 250 ml

Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie odczynników i szkła laboratoryjnego:



Aminokwasy rozpuścić osobno w 2-3 m

DCM w kolbkach stożkowych. Jeżeli występują

trudności w rozpuszczeniu dodać kilka kropel DMF.

2. Synteza peptydu.



Do kolby okrągłodennej o obojętości 50 m

dodać w kolejności:



10 m

DCM



0,4 mmola roztworu HCl*Gly-OMe



0,4 mmola TEA



0,4 mmola roztworu Boc-Leu



0,4 mmola roztworu DCC

Kolbę zamknąć korkiem.



Mieszaninę mieszać na mieszadle magnetycznym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej

(wykonać analizę TLC zgodnie z zaleceniami w p. 3 instrukcji).



Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńczyć 80 m

octanu etylu.



Wytrącony osad dicykloheksylomocznika odsączyć na sączku bibułowym. Warstwę

organiczną (przesącz) przemyć: 5% HCl oraz nasyconym roztworem NaHCO

Wysuszyć

nad CaSO



Po usunięciu środka suszącego oddestylować rozpuszczalnik na wyparce próżniowej.

Pozostałość rozpuścić w 1 m

ACN.



Przy pomocy spektrofotometru wykonać analizę spektrofotometryczną tego roztworu

w zakresie 200-250 nm. Zidentyfikować pasmo wiązania peptydowego.

3. Kontrola przebiegu syntezy dipeptydu.



Przeprowadzić analizę TLC mieszaniny reakcji po czasie: 0, 30, 60, 120 min od rozpoczęcia

reakcji w układzie rozwijającym: octan etylu.

Na każdą płytkę chromatograficzną nanosimy wzorce stosowanych do syntezy aminokwasów!

Zakres materiału: właściwości fizykochemiczne aminokwasów, wiązanie peptydowe, budowa
peptydów, synteza peptydów: metodą klasyczną w roztworze i na nośniku stałym, chromatografia
cienkowarstwowa (TLC)

Literatura:
Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN, 1999
Stryer L. Biochemia; PWN
Murray R. K. Biochemia Harpera; PZWL
Jakubke H., Jeschkeit H. Aminokwasy, peptydy, białka; PWN