plik

Aseptyka

1.Wiadomości ogólne

W wielu dziedzinach życia i działalności człowieka (medycyna, weterynaria,

przemysł farmaceutyczny, spożywczy, kosmetyczny, elektroniczny i inne.)

niezbędne jest przeprowadzanie zabiegów mających na celu usuwanie

drobnoustrojów z różnych środowisk lub obniżanie ich liczby do bezpiecznego

poziomu. W tym celu stosuje się następujące metody:



wyjaławianie (sterylizacja) - proces niszczenia wszystkich form życia

drobnoustrojów (form wegetatywnych i przetrwalnych)



dezynfekcja (odkażanie) - proces zmierzający do maksymalnego

zmniejszenia liczby drobnoustrojów lecz nie zawsze przetrwalników; proces

zmierzający do usuwania drobnoustrojów za pomocą środków chemicznych

ze skóry, błon śluzowych i ran to antyseptyka



sanityzacja - zmniejszanie liczby drobnoustrojów za pomocą środków

myjących i czyszczących na przedmiotach i w środowisku



konserwowanie - hamowanie wzrostu i rozmnażania drobnoustrojów za

pomocą schładzania i/lub środków konserwujących oraz podwyższonego

ciśnienia osmotycznego

 aseptyka - postępowanie mające na celu zapobieganie zakażeniom i

skażeniom drobnoustrojami

W profilaktyce i zwalczaniu zakażeń szpitalnych dezynfekcja i sterylizacja

zmniejszają ryzyko przeniesienia drobnoustrojów ze źródła lub chronią wrażliwy

organizm.

2.Dezynfekcja

Dezynfekcja jest procesem, w wyniku którego następuje zabicie

drobnoustrojów (z wyjątkiem spór bakterii) znajdujących się na przedmiotach,

powierzchniach lub rękach. Jest to proces złożony, którego przebieg zależy od:



właściwości czynnika dezynfekcyjnego - rodzaj czynnika (w zależności od

rodzaju środki dezynfekcyjne wykazują różną aktywność bójczą: od

podstawowego zakresu bakteriobójczego, po szeroki prątkobójczy,

grzybobójczy i wirusobójczy); zastosowane parametry



czynnika biologicznego: rodzaju drobnoustrojów, ich wrażliwości na czynniki

dezynfekcyjne i ich liczby (prawdopodobieństwo skutecznej dezynfekcji

jest tym większe, im mniejsza liczba drobnoustrojów znajduje się na

odkażanym przedmiocie)



warunków środowiska: temperatury i pH, które mogą oddziaływać

zarówno na komórki, jak i na właściwości środka dezynfekcyjnego oraz

obecności substancji organicznych lub innych zanieczyszczeń, które mogą

zmniejszać stężenie środka w roztworze albo uniemożliwiać dotarcie

czynnika dezynfekującego do komórki drobnoustroju.

Duże znaczenie ma również „czynnik ludzki", ponieważ to personel musi

wybrać odpowiednią metodę i prawidłowo przeprowadzić dezynfekcję. Zmiana

parametrów, np. obniżenie stężenia, temperatury, skrócenie czasu dezynfekcji,

niekorzystnie wpływa na końcowy efekt procesu.

Czynnikami dezynfekcyjnymi są środki chemiczne, ciepło, promieniowanie

nadfioletowe. Dezynfekcję chemiczną przeprowadza się przy użyciu związków

wykazujących działanie przeciwdrobnousfrojowe. Aktywność preparatów

chemicznych zależy od składu: rodzaju substancji aktywnych i wspomagających.

Główne substancje aktywne to: związki zawierające aktywny chlor,

czwartorzędowe sole amonowe, alkohole, aldehydy, związki nadtlenowe oraz

pochodne fenolowe. Środki, które znalazły zastosowanie w środowisku

nieożywionym noszą nazwę dezynfekcyjnych. Te, które stosuje się na żywe

powierzchnie to antyseptyki.

Skuteczność środków odkażających ocenia się mikrobiologicznymi

metodami laboratoryjnymi in vitro. Dodatkowo w badaniach antyseptyków stosuje się

również metody in vivo.

Badania in vitro wykonywane są na wzorcowych szczepach drobnoustrojów o

znanej wrażliwości na związki przeciwdrobnoustrojowe. Są to przedstawiciele

bakterii Gram-dodatnich (np. S. aureus), Gram-ujemnych <np. E. coli, Ps.

aeruginosa), grzybów (np. Candida albicans). W zależności od specyfiki

zastosowania preparatu lista szczepów może być rozszerzona o przedstawicieli

innych gatunków (np. Mycobacterium). Poza tym określa się działanie sporobójcze

(np. przetrwalniki B. subtili), wirusobójcze. Badania in vitro mają na celu ustalenie

efektywnych stężeń lub oczekiwanego stopnia redukcji liczby drobnoustrojów w

określonym czasie kontaktu preparatu z drobnoustrojem.

W niektórych, uzasadnionych przypadkach wykonuje się również badanie

łatwości wytwarzania form opornych (czwartorzędowe związki amoniowe) oraz

trwałości środków odkażających.

Ogólne zasady i metody oceny środków odkażających są regulowane zarówno

przepisami w poszczególnych krajach, jak i w instytucjach międzynarodowych np. w

obrębie Unii Europejskiej. W Polsce jednostką regulującą kryteria oceny preparatów

dezynfekcyjne jest Państwowy Zakład Higieny (PZH). Wg materiałów

metodycznych PZH ocenę chemicznych środków dezynfekcyjnych przeprowadza się

poprzez określenie:



aktywności bakteriostatycznej - granicznego stężenia preparatu

dezynfekcyjnego, które hamuje wzrost drobnoustrojów testowych w podłożu.



aktywności bakteriobójczej metodą zawiesinową - najniższego stężenia

preparatu działającego bakteriobójczo w środowisku wodnym na zawiesinę

drobnoustrojów testowych.



aktywności bakteriobójczej metodą nośnikową - wartości stężenia roztworu

preparatu dezynfekcyjnego działającego bakteriobójczo w oznaczonym

czasie na drobnoustroje testowe naniesione na nośniki (stężenie

użytkowe).



zmiany oporności bakterii na działanie chemicznych preparatów

dezynfekcyjnych – drobnoustroje pasażuje się w podłożu płynnym,

zawierającym preparat dezynfekcyjny w stopniowo podwyższanych

stężeniach; metoda pozwala na stwierdzenie, czy bakterie mają zdolność

nabywania oporności na działanie preparatu oraz na ustalenie, wobec jak

wysokich stężeń preparatu bakterie mogą przeżywać i rozmnażać się.



trwałości bakteriobójczego działania roztworów użytkowych - badanie

utrzymywania się aktywności bakteriobójczej preparatów dezynfekcyjnych w

roztworach o stężeniu użytkowym, przechowywanych w warunkach zbliżonych

do warunków praktycznych.

Ocenę preparatów dezynfekcyjnych według norm Europejskiego Komitetu

Normalizacji - CEN (normy obowiązujące w krajach Unii Europejskiej)

przeprowadza się w kilku fazach:



faza 1

- testy zawiesinowe dotyczące podstawowej aktywności



faza 2 etap 1

- testy zawiesinowe przeprowadzane w warunkach

odpowiadających ich praktycznemu stosowaniu np. ocena aktywności

przeciwprątkowej



faza 2 etap 2

- inne testy laboratoryjne np. badanie działanie antyseptyków

na drobnoustroje sztucznie naniesione na opuszki palców



faza 3

- testy przeprowadzane w warunkach praktycznych

Wg powyższych norm preparaty dezynfekcyjne ocenia się na podstawie

wielkości wyznaczonego w badaniach współczynnika redukcji liczby komórek

drobnoustrojów. Oceniany w fazie 1 związek odkażający powinien spowodować w

warunkach przeprowadzonego doświadczenia redukcję inoculum bakteryjnego w

99,999%, co równa się redukcji log 5 (np. przy inoculum 10

/ml liczba komórek

bakteryjnych powinna obniżyć się co najmniej do 10

/ml)

Metody termiczne



Dezynfekcja parą wodną w temperaturze 105 - 110°C, nadciśnienie-* 0,45

- 0,50 atm. - stosowana do dezynfekcji sprzętu poddanego wcześniej

czyszczeniu oraz do odkażania bielizny, odzieży, pościeli i inne., a także

do unieszkodliwiania odpadów medycznych; para wodna pod normalnym

ciśnieniem stosowana jest do dezynfekcji wyposażenia sanitarnego

 Dezynfekcja gorącą wodą - głównie stosowana w urządzeniach myjąco-

dezynfekujących

Dezynfekcja chemiczno-termiczna - skojarzone działanie ciepła (do 60°C) i

środków chemicznych; stosowana do dezynfekcji sprzętu wrażliwego na działanie

wysokich temperatur.

Dezynfekcja promieniami nadfioletowymi - promieniowanie UV o długości 256

nm redukuje liczbę drobnoustrojów na czystych powierzchniach lub w powietrzu.

Mała zdolność penetracji ogranicza zastosowanie tego czynnika do dezynfekcji.

3. Sterylizacja

Sterylizacja jest procesem mającym na celu zabicie wszystkich form

drobnoustrojów, w tym także spór bakterii. Wyjaławianiu można poddawać ciała

stałe, płynne i gazowe. W zależności od właściwości materiałów stosuje się różne

sposoby wyjaławiania.

Jest wiadomym, że żadna metoda nie zapewnia całkowitej jałowości. Wynika

to z faktu, że niezależnie od wielkości dawki jałowiącej, zawsze istnieje

określona wartość prawdopodobieństwa przeżycia drobnoustrojów w danej

populacji. Z tego powodu przyjęto, że za jałowy w praktyce uznaje się materiał, dla

którego prawdopodobieństwo przeżycia pojedynczych mikroorganizmów jest

mniejsze niż umowna wartość 10"

, co znaczy, iż przy milionie jałowionych jednostek

jedna może być nie jałowa.

Gwarancję sterylności materiałów uzyskuje się przez: zachowanie właściwego

toku postępowania z materiałem przed sterylizacją (czyszczenie i dezynfekcja,

pakowanie), prawidłowo przeprowadzony proces sterylizacji i suszenia, prawidłowo

przeprowadzoną kontrolę °procesu 6 - 0,50 0 oraz właściwe postępowanie z

materiałem po sterylizacji (transport, przechowywanie, otwieranie). Niezbędnym

warunkiem prawidłowego przebiegu sterylizacji jest gruntowne oczyszczenie

przedmiotu. Liczba drobnoustrojów znajdująca się na przedmiocie przed sterylizacją

stanowi punkt wyjścia do określenia wyniku sterylizacji. Pewność uzyskania

jałowego produktu jest definiowana za pomocą stopnia redukcji liczby

drobnoustrojów, który powinien być nie mniejszy niż 99,9999%.

Sterylizacja osiąga pełny efekt jeżeli czynnik sterylizujący oddziałuje na

cały sterylizowany materiał (wszystkie powierzchnie) przez ściśle określony czas.

Sterylizację możemy prowadzić metodami fizycznymi i chemicznymi. Każda ze

znanych metod ma swoje zalety i ograniczenia i każda może być metodą z wyboru

dla jałowienia określonego materiału. Przy wyborze metody sterylizacji należy

taką, której zalety przewyższają wady i jest odpowiednia dla sterylizowanego

sprzętu. W sterylizacji obowiązuje zasada, że dla materiału, który można

wyjaławiać parą wodną pod ciśnieniem nie należy stosować innej metody

sterylizacji.

W sterylizacji parowej czynnikiem sterylizującym jest nasycona para wodna

w temperaturze 121°C (nadciśnienie 1 atm.) lub w temperaturze 134°C

(nadciśnienie 2 atm.).

Proces sterylizacji można podzielić na trzy fazy: 1) odpowietrzanie komory

(aparaty przelotowe) i przeznaczonego do sterylizacji materiały lub wytworzenie

próżni w komorze (aparaty próżniowe); 2) właściwa sterylizacja - ekspozycja; 3)

obróbka końcowa - suszenie. Czas sterylizacji ulega zmianie w zależności od

temperatury i rodzaju opakowania.

Czas sterylizacji składa się z: 110°Czas sterylizacji = a + b + c

czasu wyrównania temperatur - zależy od rodzaju opakowania, ciężaru, stopnia

załadowania i wielkości sterylizatora, jest on ustalany przez producenta i osobę

odpowiedzialną za sterylizację; w trudniejszych przypadkach można go

wyznaczyć doświadczalnie na podstawie pomiaru temperatur termosondą;

czas zabicia - (jest on określony dla poszczególnych szczepów

drobnoustrojów) wyznacza się doświadczalnie dla różnych bakterii i ich spor;

c) zapas bezpieczeństwa - ustalany jest przez producenta i osobę

odpowiedzialną za sterylizację

Drugim termicznym czynnikiem sterylizującym jest suche gorące powietrze o

temperaturze 160-180°C. Z innych czynników fizycznych w procesie sterylizacji

wykorzystywane jest promieniowanie jonizują

(promieniowanie gamma i strumień elektronów o dawce 2,5-5 Mrad) głównie na

skalę przemysłową (np. do jałowienia sprzętu jednorazowego użytku,

przeszczepów kostnych, kosmetyków).

Sterylizację gazową można przeprowadzać tlenkiem etylenu lub

formaldehydem. Sterylizacje można przeprowadzać również za pomocą

roztworów preparatów chemicznych takich jak: aldehyd glutarowy, aldehyd

mrówkowy, nadtlenek wodoru, kwas nadoctowy. W związku z nowymi

technologiami stosowanymi w medycynie nastąpiła intensyfikacja badań w celu

znalezienia nowych metod niskotemperaturowych.

Metoda filtracji stosowana jest do wyjaławiania płynów oraz powietrza i innych

gazów.

Jedną z metod ostatnio wprowadzonych do stosowania jest sterylizacja

plazmowa. Plazma jest czwartym stanem skupienia materii. Cząsteczki gazu w

próżni wzbudzane energią w polu elektromagnetycznym przechodzą w stan

plazmy. Obecnie istnieją dwa systemy sterylizacji plazmowej. W pierwszym plazma

wytwarzana jest bezpośrednio w komorze sterylizatora. W drugim plazma

wytworzona poza komorą sterylizatora wprowadzana jest do komory.

Do uzyskania plazmy wykorzystywany jest np. nadtlenek wodoru. Po

wytworzeniu próżni w komorze sterylizatora następuje wtrysk H

, jego parowanie

1 dyfuzja. Cząsteczki H

osiadają na wyjaławianym materiale. Jest to pierwsza

faza biobójcza. Następnie włączane jest źródło energii o wysokiej częstotliwości i z

wytwarzana jest plazma - druga faza biobójcza (trwa ona 10-15 min w temp.

max. 44°C). na koniec następuje faza wentylacji i wyrównania ciśnień. Cały cykl

trwa ok. 75 min w temperaturze ok. 40°C. Sterylizowany materiał nie wymaga

degazacji, a po procesie powstają H

O i O

związki przyjazne dla środowiska.

Metodą tą nie można sterylizować materiałów zawierających celulozę, materiałów

porowatych oraz płynów. Materiał przygotowany do sterylizacji powinien być

idealnie suchy. Nie można sterylizować sprzętu o zamkniętych przewodach. Sprzęt

o średnicy poniżej 3 mm i długości powyżej 30 cm wymaga zastosowania

dodatkowego ładunku H

. Należy stosować specjalny materiał opakowaniowy.

Metody kontroli procesu sterylizacji

Kontrolę procesu sterylizacji przeprowadza się za pomocą wskaźników

fizycznych, chemicznych i biologicznych

Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki wilgotności,

mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do urządzenia

sterylizującego informują o stanie technicznym sterylizatora. Mierzą punktowo dany

parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych przyrządów coraz częściej stosuje się

system rejestracji podstawowych parametrów fizycznych w postaci wydruków,

wykresów lub raportów.

Wskaźniki chemiczne, w których substancja chemiczna poddana procesom

fizycznym i chemicznym wystarczającym do zabicia spór w procesie sterylizacji

trwale, wyraźnie i jednoznacznie zmienia swoje właściwości fizyczne (np. barwę).

Wskaźniki chemiczne informują jedynie czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte

warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji materiał został

wyjałowiony

Wskaźniki chemiczne można podzielić na:



sprawdziany sterylizacji - przeznaczone głównie do użycia zewnętrznego,

które wykazują jedynie, że materiał został poddany procesowi sterylizacji;

zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia jednego z parametrów

sterylizacji np. temperatury (nie wykazują jak długo ta temperatura się

utrzymywała); pozwalają na wizualne odróżnienie materiału, który był poddany

sterylizacji od sprzętu nie wyjałowionego (np. taśmy kontrolne samoprzylepne)



wskaźniki wieloparametrowe - wkładane do wnętrza pakietu, wykazują, że

wewnątrz ładunku zostały osiągnięte wartości wszystkich lub kilku

(przynajmniej dwóch) 9999%.krytycznych parametrów procesu sterylizacji;

informują o prawidłowości przebiegu procesu (np. Zintegrowany Test TST,

Rurka Brown'a typ 5)

Wskaźniki biologiczne -zawierają określone liczby żywych, zdolnych do przejścia

w formy wegetatywne, opornych na dany rodzaj czynnika wyjaławiającego

przetrwalników bakteryjnych:

 Bacillus subtilis - suche gorące powietrze, tlenek etylenu

 Bacillus stearothermophilus - gorąca nasycona para wodna pod ciśnieniem

 Bacillus pumilis - promieniowanie jonizujące;

informują o fakcie zabicia drobnoustrojów (spór wyselekcjonowanych szczepów

bakterii wysoce opornych na dany czynnik sterylizacyjny). Wskaźniki biologiczne

dają gwarancję jałowości - jeżeli użyte w teście przetrwalniki zostały zabite oznacza

to, iż zostały zabite wszystkie bardziej wrażliwe drobnoustroje zanieczyszczające

sterylizowany materiał.

Dla uzyskania pełnej informacji niezbędne jest monitorowanie procesu sterylizacji

za pomocą wszystkich trzech metod. Wskaźniki fizyczne określają bowiem stan

techniczny-urządzenia, chemiczne - warunki procesu informując o jego

nieprawidłowościach, pozwalając na ich korygowanie zanim uzyska się wyniki

kontroli przy użyciu testów biologicznych. Jedynie wskaźniki biologiczne informują

o bójczym działaniu procesu i dają pełną gwarancję jałowości.

Skuteczność sterylizacji powinna być kontrolowana:

 okresowo - przy użyciu wskaźników biologicznych



kontrola zewnętrzna - wykonywana przez stacje sanitarno-epidemiologiczną -

każdy sterylizator raz na kwartał



kontrola wewnętrzna - prowadzona przez użytkownika - co najmniej raz na

miesiąc, w miarę potrzeb i możliwości częściej



na bieżąco - przy użyciu wskaźników chemicznych - użytkownik ma

obowiązek kontroli każdego procesu sterylizacji

Kontrola aparatów do filtracji - testy integralności filtrów

a) Metody fizyczne

 Metoda pęcherzykowa



Metoda pęcherzykowa (tzw. bubble point) polega na pomiarze ciśnienia,

przy którym ciśnienie kapilarne cieczy znajdującej się we wnętrzu sączka

zostanie pokonane.

 Metoda szybkości dyfuzji



Metoda pomiaru szybkości dyfuzji polega na ocenie czasu przepływu

gazu przez mokry sączek pod wpływem określonego ciśnienia.

b) Metoda biologiczna

Polegają na sączeniu zawiesiny kultur bakteryjnych o wielkości komórek do 0,3

μm, o odpowiedniej gęstości inoculum i ocenie jałowości przesączu. Zazwyczaj

stosuje się inoculum szczepu Pseudomonas diminuta o gęstości 10

komórek

na każdy centymetr kwadratowy sączka. W badaniu testowym stosuje się sączki

o deklarowanej wielkości porów 0,22 μm.

4. Antyseptyka skóry rąk

Zwykłe mycie rąk (socjalne) to zabieg polegający głównie na zmyciu z

powierzchni skóry rąk

zanieczyszczeń organicznych i brudu oraz na częściowej eliminacji ze skóry rąk

flory przejściowej i stałej.

W celu przeprowadzenia higienicznego mycia rąk, nanosi się na dłonie

odpowiednią ilość mydła. Czas mycia powinien wynosić nie mniej niż 30 sek.

Po dokładnym umyciu ręce spłukuje się i osusza jednorazowym ręcznikiem.

Przy myciu można stosować rutynową technikę mycia rąk wg Ayliffe

Kiedy należy myć ręce?

 przed rozpoczęciem dnia pracy i po dłuższych przerwach w pracy

 po wyjściu z toalety

 po wykonanych pracach porządkowych i

czystościowych.

Najczęściej popełniane błędy podczas mycia rąk:

 zbyt krótki czas mycia

 niedokładne mycie rąk

 pozostawienie na dłoniach biżuterii czy zegarka

 używanie "wspólnego" mydła w kostce lub mydła w płynie zanieczyszczonego

mikrobiologicznie

 wytarcie rąk po umyciu ręcznikiem wspólnego i wielokrotnego użycia



używanie zbyt gorącej wody, zbyt częste mycie rąk, zaraz po

przeprowadzonej dezynfekcji rąk preparatem alkoholowym (takie

postępowanie obniża poziom wrażliwości skóry na środki myjące i powoduje

jej wysuszanie i uszkodzenia).

Dezynfekcja higieniczna składa się z mycia zwykłego (etap I - brudny) i dezynfekcji

(etap II - czysty) Dezynfekcję higieniczną przeprowadza się stosując antyseptyk na

czystą, pozbawioną zanieczyszczeń organicznych i brudu skórę rąk (aktywność

Kiedy należy przeprowadzać dezynfekcje rąk?

 przed i po każdym zabiegu leczniczym, badaniu, pielęgnacji

 po zdjęciu rękawic ochronnych



po każdym kontakcie z pacjentem, z zanieczyszczonymi przedmiotami, z

materiałem zakaźnym, wydalinami, wydzielinami i płynami ustrojowymi

Najczęściej popełniane błędy podczas dezynfekcji rąk to:



zbyt krótko przeprowadzany zabieg dezynfekcji

 stosowanie zbyt małej objętości preparatu

 niedokładne przeprowadzenie dezynfekcji

 pozostawienie na rękach biżuterii i zegarka



stosowanie alkoholowych preparatów dezynfekcyjnych na mokrą skórę i/lub

znacznie obciążoną tkanką organiczną i innymi zanieczyszczeniami

Celem dezynfekcja chirurgicznej rąk jest jak najdalej idąca eliminacja

drobnoustrojów flory przejściowej i stałej.

Etap I - chirurgiczne mycie rak

Przed myciem rąk należy zdjąć biżuteńę i zegarek. Wstępnie umyć ręce

(mycie zwykłe). Następnie przeprowadzić mycie chirurgiczne. Do mycia należy

używać bieżącej ciepłej wody i mydeł w płynie dozowanych ze specjalnych

dozowników ściennych wyposażonych w dźwignię do dozowania mydła za

pomocą łokcia lub pedału nożnego. Dokładne umycie całej powierzchni rąk

zapewnia stosowanie techniki mycia np. wg Ayliffe.

W celu przeprowadzenia chirurgicznego mycia rąk nanosi się na dłonie

odpowiednią ilość mydła. Czas mycia powinien wynosić ok. 2-5 min. Bardzo

dokładnemu myciu poddaje się dłonie i przedramię. Po umyciu ręce dokładnie

spłukuje się wodą i osusza jałowym ręcznikiem.

Etap II - dezynfekcja chirurgiczna

Dezynfekcję chirurgiczną przeprowadza się po uprzednim dokładnym chirurgicznym

umyciu rąk. Ręce muszą być dokładnie wytarte suchym, jałowym ręcznikiem.

Na ręce nanosi się przeważnie 5ml środka antyseptycznego i dokładnie wciera

preparat w skórę rąk i przedramienia, aż do momentu całkowitego wyschnięcia

preparatu, tj. ok. 2,5 minuty. Czynność należy powtórzyć dwukrotnie zwracając

szczególną uwagę na czubki palców i obrąbek naskórkowy paznokcia.

ANEKS
Ocena aktywności bakteriobójczej preparatów dezynfekcyjnych metodą
zawiesinową (MBC)

Zasada metody: określenie najniższego stężenia preparatu działającego

bakteriobójczo w środowisku

wodnym na zawiesinę drobnoustrojów testowych.

W badaniu używa się standardowe szczepy wzorcowe drobnoustrojów z kolekcji

międzynarodowych.

Wykonanie badania

W kolbach miarowych przygotować wyjściowe roztwory badanego preparatu oraz

preparatu wzorcowego. Z roztworu wyjściowego przygotować serię roztworów do

badań w kolbach lub bezpośrednio w probówkach (średn. 35 mm, wys. 100 mm).

Każda probówka powinna zawierać 5 ml roztworu, wszystkie probówki z

roztworami oraz bulionową hodowlą drobnoustrojów testowych umieścić w łaźni

wodnej w temp. 20°C. Po upływie 15 min do każdego roztworu dodawać po 0,5

ml zawiesiny drobnoustrojów, uważając, aby nie dotknąć powierzchni roztworu i

nie nanieść zawiesiny na ścianę probówki (nie dotknąć pipetą i nie rozpryskać

zawiesiny). Następnie zawartość probówek wymieszać, obracając probówkę ruchem

wirowym i ponownie umieścić w łaźni wodnej.

Zawiesinę należy dodawać do kolejnych roztworów (zaczynając od

najwyższego stężenia) w takich odstępach czasu (np. 30 sek.), aby następnie

mieć możność wykonania posiewów do podłoża płynnego z każdego rozcieńczenia

dokładnie po 5,10 i 15 min ekspozycji. Przed.każdym posiewem zawartość

probówki wymieszać obracając ją ruchem wirowym. Posiewy wykonać ezą do

bulionu (lub bulionu z inaktywatorem) znajdującego się w probówkach. Inkubować

w temperaturze 37°C. Wyniki odczytać po 48 godzinach.

Wstępne badania wykonywać w szerokim zakresie stężeń, następnie
przeprowadzać oznaczenia w wąskich zakresach stężeń w granicach określonych w
badaniu wstępnym.

Interpretacja wyników

Na podstawie uzyskanych wyników oblicza się współczynnik aktywności

bakteriobójczej badanego preparatu w odniesieniu do aktywności preparatu

wzorcowego. Współczynnik aktywności jest liczbą, którą otrzymuje się przez

podzielenie najniższego stężenia preparatu wzorcowego, zabijającego

drobnoustroje w czasie 10 min, lecz nie zabijającego drobnoustroje w czasie 5

min przez najniższe stężenie badanego preparatu dające ten sam efekt.

Współczynnik aktywności wskazuje w jakim stosunku pozostaje do siebie

aktywność obu preparatów w danym układzie badań.

Określanie stężenia użytkowego preparatów dezynfekcyjnych metodą
zawiesinową wg PZH

Zasada metody: określenie wartości stężenia roztworu preparatu dezynfekcyjnego

działającego biobójczo w odpowiednim czasie na drobnoustroje testowe

umieszczone na nośnikach

Wykonanie badania Do jednego badania używano:

 13 cylinderków

 11 probówek zawierających po 10 ml badango preparatu

 11 probówek zawierających po 10 ml inaktywatora

 12 probówek zawierających po 10 ml podłoża

Statywy z probówkami umieszczano w łaźni wodnej o temp. 20°C.

Jeden jałowy nośnik przeniesiono do jałowej probówki. Do pozostałych 12 dodano

12 ml zawiesiny drobnoustrojów testowych. Po 15 min. kontaktu nośniki

przenoszono do płytki Petriego wyłożonej podwójną warstwą bibuły filtracyjnej

ustawiając je w pozycji pionowej. Nośniki suszono w temp. 37°C w lekko uchylonej

płytce przez 50-60 min. Suche nośniki przenoszono pojedynczo w 60-

sekundowych odstępach do uprzednio przygotowanych probówek z preparatem

dezynfekcyjnym, wstrząsając trzykrotnie ruchem wirowym. Po 15 min. nośniki

przenoszono do roztworu inaktywatora zachowując tę samą kolejność i ten sam

odstęp czasu jak poprzednio. Następnie cylinderki przenoszono (zachowując te

same warunki) do 10 probówek z podłożem wzrostowym. Dodatkowo, przy

każdym badaniu wykonano dwie kontrole: a} kontrola wzrostu: 1 nośnik

zanieczyszczony zawiesiną szczepów testowych lecz nie poddany działaniu

preparatu i inaktywatora umieszczano w probówce z podłożem wzrostowym, b) 0

kontrola działania bakteriostatycznego preparatu w podłożu: w tym celu 1

nośnik eksponowany w roztworze preparatu i inaktywatora (warunki ekspozycji

jak poprzednio) umieszczano w probówce z podłożem. W tej samej probówce 7°

Ocena aktywności bakteriobójczej preparatów dezynfekcyjnych metodą zawiesinwą wg

norm Europejskiego Komitetu Standaryzacji(CEN) EN 1040 -faza 1

Zasada metody: określenie wielkości redukcji liczby drobnoustrojów za pomocą

badanego preparatu

dezynfekcyjnego w określonym stężeniu i czasie - wyznaczenie współczynnika redukcji

Wymagania: preparat powinien obniżać o co najmniej 10

liczbę żywych komórek szczepów

testowych

bakterii - Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus.

Wykonanie

Przygotować zawiesinę drobnoustrojów testowych (N) o gęstości 1,5 x 10

do 5,0 x 10

Liczenie bakterii

wykonać metodą rozcieńczeniową. Do obliczeń brać płytki zawierające mniej niż 300 kolonii.

Zęby wynik był

wiarygodny przynajmniej jedna płytka ma zawierać 15 lub więcej kolonii; liczba komórek

powinna być

oznaczona przy użyciu przynajmniej jednej pary płytek, z których jedna lub obie zawierają

więcej niż 15

kolonii, a obie płytki zawierają mniej niż 300 kolonii. Jeśli płytki z dwóch rozcieńczeń

spełniają te kryteria

wyraź liczbę cfu/ml jako średnią ważoną, jeśli tylko z jednego rozcieńczenia -jako średnią

arytmetyczną.

gdzie:

V - objętość próby

C - suma kolonii z wszystkich płytek branych pod uwagę
n

- liczba płytek branych pod uwagę odpowiednio przy pierwszym i drugim rozcieńczeniu

d - współczynnik pierwszego branego do obliczeń rozcieńczenia
Przygotować rozcieńczenia preparatu w wodzie w stężeniu 1,25 krotnie wyższym od
wyznaczonego do badań. Do probówki zawierającej 8,0 ml rozcieńczenia preparatu
i 1,0 ml wody dodać 1,0 zawiesiny bakterii o gęstości 1,5 x 10

do 5,0 x 10

, włączyć

stoper, wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temp 20°C. Tuż przed upływem
wyznaczonego czasu kontaktu zawartość probówki wymieszać, a następnie w wyznaczonym
czasie przenieść 1,0 ml do probówki zawierającej 8,0 ml inaktywatora i 1,0 ml wody. Włączyć
stoper, wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temp 20 C. Po 5 minutach inaktywacji i
dokładnym wymieszaniu pobrać dwie próbki o objętości 1,0 ml, przenieść do płytek Petriego i
zalać 15 ml płynnego schłodzonego podłoża TSA. Próby inkubować 24 h w temp 37°C. Po
inkubacji zliczyć wyrosłe kolonie drobnoustrojów i obliczyć liczbę przeżyłych komórek wg
wzoru:

V n

0,1 n

V n

0,1 n

d - w tej metodzie wynosi 10

-1

Jeżeli liczba kolonii na wszystkich liczonych płytkach jes mniejsza niż 15, zapisz, że

liczba żywych komórek w mieszaninie jest mniejsza niż 1,5 x 10

cfu/ml, natomiast jeżeli

wynosi > 300, to zapisz, że liczba żywych komórek w mieszaninie jest większa niż 3 x

cfu/ml. Dla każdego drobnoustroju testowego oblicz współczynnik redukcji (RF) wg wzoru:

W celu uwiarygodnienia metody przed każdym badaniem należy wykonać testy

walidacyjne, które pozwalają na stwierdzenie czy: 10 w badaniach użyto zawiesinę o

odpowiedniej liczbie żywych komórek; 2) użyty w badaniach inaktywator skutecznie

inaktywował badany preparat - walidacja rozcieńczania-inaktywacji; 3) czy inaktywator

nie wykazywał działania toksycznego na badane

N x 10