WF – ćw.7 

 

 

1

Ćwiczenie 7 

Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz.  

Oznaczenie witaminy C 

 

A. Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz.

 

 
Odczynniki : 

- 3% roztwór H

2

O

2

, 

- roztwór KCN,  
- roztwór benzydyny w kwasie octowym, 
- roztwór fenolu 
- roztwór pirogallolu 
- odczynnik NADI (przygotować

 bezpośrednio przed Użyciem, mieszając p-fenyleno-diaminę 

   z 

α-naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml), 

- bufor fosforanowy o pH 7,4, 
- roztwór pirokatechiny 

UWAGA!!! KCN jest silna trucizną !!! 

!!!Wylewać tylko do specjalnie oznaczonego pojemnika !!! 

 

S

PORZĄDZANIE WYCIĄGU ZIEMNIACZANEGO

 

 

Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę  włożyć do złożonej potrójnie gazy i zanurzyć w zlewce 

zawierającej 200 cm

3

 wody destylowanej. Zawartość zlewki łagodnie mieszać przez kilka minut.  Otrzymuje się 

wodny wyciąg z ziemniaka, zawierający enzymy oraz wypłukana skrobię. Po pewnym czasie, gdy skrobia opadnie 

na dno zlewki, płyn należy zdekantować znad osadu i przesączyć. Część nadsączu (około 50 cm

3

) wlać do zlewki i 

zagotować. 

 

1. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY 

 

Katalazy, obecne we wszystkich organizmach tlenowych, są metaloproteinami zawierającymi w swojej 

cząsteczce żelazo. Katalizują rozkład H

2

O

2

. do wody i tlenu cząsteczkowego. Jest to szczególny przypadek reakcji 

hydroperoksydazowej, w której H

2

O

2

 jest jednocześnie donorem i akceptorem wodoru.  

2H

2

O

2

 → 2H

2

O + O

2

 

Zasada wykrywania katalazy 

Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H

2

O

2

 katalizowanej przez katalazę wydzielając się z 

roztworu powoduje jego silne pienienie. 

WF – ćw.7 

 

 

2

Wykonanie 

Do trzech probówek napipetować po około 2 ml :  

a - ekstraktu z ziemniaka ,  
b - zagotowanego ekstraktu z ziemniaka  
c - ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu KCN. 
 

Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się pęcherzyki 

tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji. 

2.  W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZ

 

Peroksydazy katalizują reakcję utleniania niektórych związków organicznych np. fenoli z równoczesną redukcją 

nadtlenku wodoru 

H

2

O

2

 + fenole → 2H

2

O + chinony 

Enzymy tej grupy są odporne na temperaturę. Nie denaturują w temperaturze 70°C, inaktywują się 

dopiero po ogrzaniu we wrzącej łaźni wodnej. Bogatym ich źródłem jest sok chrzanowy, a w tkankach 

zwierzęcych wątroba i leukocyty. 

 

Zasada wykrywania peroksydazy 

Benzydyna w obecności H

2

O

2

 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego, zgodnie z 

poniższym równaniem reakcji 

 

Wykonanie 

Do 5 probówek odmierzyć podaną w tabeli objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H

2

O

2

, KCN i H

2

O. Do 

probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min. w temperaturze 

pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki. 

Próba  

nr 

Wyciąg  

(ml) 

Woda  

(ml) 

Benzydyna 

(ml) 

KCN 

H

2

O

2

  

(ml) 

1 2,5  0 

0,1  0 0,1 

2 2,5  0,1 

0  0 0,1 

3 2,5  0 

0,1 

2 

krople 

0,1 

4 2,5  0 

0,1  0 0,1 

5 2,5  0,1  0,1  0 0 

 

WF – ćw.7 

 

 

3

3. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ

 

Oksydaza cytochromowa jest enzymem występującym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, stanowi końcowy 

element  łańcucha oddechowego w komórce. Jej podstawowym zadaniem jest przeniesienie elektronów na tlen w 

celu jego aktywacji. Enzym ten jest hemoproteiną zawierającą również atomy miedzi. 

 

 

Zasada wykrywania aktywności oksydazy cytochromowej 

Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym można wykazać w reakcji, w której wykorzystywany 

jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: 

α-naftol i p-fenylenodiamina zmieszane w stosunku 1:1. W 

wyniku nieenzymatycznej redukcji zawartego w mitochondriach cytochromu c przez 

 

p-fenylenodiaminę powstaje p-fenylenodiimina, która w obecności 

α -naftolu przechodzi w barwny, niebieski 

kompleks. 

 

Wykonanie 

Do 4 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości poszczególnych roztworów; do probówki nr 4 dodać 

zagotowany nadsącz. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Obserwować 

powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w tabeli. 

Próba  

nr 

Wyciąg  

(ml) 

Woda      

(ml) 

Bufor pH 7,4 

(ml) 

KCN 

NADI         

(ml) 

1 1  0 

1  0 0,1 

2 1  0 

1 

1 

kropla 

0,1 

3 1  0,1  1  0  0 
4 1  0 

1  0 0,1 

 

4. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ

 

Oksydazy katalizują odrywanie się elektronów od utlenianego substratu i dwu- lub czteroelektronową redukcję 

cząsteczki tlenu. Produktami reakcji katalizowanych przez te enzymy jest woda lub nadtlenek wodoru. Substratem 

w reakcjach utleniania mogą być m.in. o- i p-difenole. Powstają chinony, a w wyniku ich kondensacji tworzą się 

barwne pochodne. Oksydaza fenolowa, zwana również oksydazą polifenolową, tyrozynazą lub katecholazą, jest 

metaloproteiną i zawiera miedź, która przyjmuje elektrony od difenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. 

 

Zasada wykrywania oksydazy polifenolowej 

Oksydaza polifenolowa utlenia pirokatechinę do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne zabarwienie. 

 

WF – ćw.7 

 

 

4

Wykonanie 

Do 5 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny 

i 4% roztworu KCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zawierający termicznie denaturowane białka. Zawartość 

wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze pokojowej. W celu 

lepszego dostępu tlenu, próby od 1-4 co pewien czas wstrząsnąć. Po 20 min zanotować wyniki reakcji. 

Próba  

nr 

Wyciąg 

(ml) 

Woda 

(ml) 

Bufor pH 7,4 

(ml) 

KCN 

Pirokatechina 

(ml) 

1 1  0 

1  0 0,1 

2 1  0,1  1  0  0 
3 1  0 

1 

2 

krople 

0,1 

4 1  0 

1  0 0,1 

5 1  0 

1  0 0,1 

 

Do 2 probówek wlać po 5 cm

3

 wyciągu ziemniaczanego. Następnie do probówek wprowadzić kolejno: 

 do pierwszej  – 10 kropli 1% roztworu fenolu, 
 do drugiej – 10 kropli 1% roztworu pirogallolu. 

Zawartość probówek zmieszać i obserwować zmianę zabarwienia. 

UWAGA: Podobny efekt obserwuje się bez powyższych odczynników, np. na obranym ziemniaku, który po 

pewnym czasie sinieje, ponieważ obecne w nim związki typu o-difenoli ulegają utlenieniu. 

 

5. Wrażliwość peroksydaz i oksydaz na temperaturę 

Do trzech probówek odmierzyć po 5 cm

3

 wyciągu ziemniaczanego. Wszystkie probówki ogrzewać na łaźni wodnej 

o temperaturze 70°C przez 10 min. Następnie dodać: 

 do pierwszej probówki 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, 
 do drugiej probówki 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny i 3% roztworu nadtlenku wodoru. 

Zanotować wyniki reakcji. 

 
B. Oznaczanie witaminy C

 

 

Kwas L-askorbinowy (witamina C) jest 

związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym 

w wodzie a jego roztwory mają kwaśny smak. 

Wykazuje właściwości redukujące. Jego forma 

utleniona to kwas dehydroaskorbinowy.  

Układ oksydoredukcyjny kwas askorbinowy ↔ kwas dehydroaskorbinowy może uczestniczyć 

w regulowaniu  potencjału oksydoredukcyjnego w komórce i brać udział w transporcie elektronów. 

Ponieważ witamina C występuje w znacznych ilościach w gruczołach nadnercza, przypuszcza się,  że 

uczestniczy ona w syntezie hormonów sterydowych. Witamina C uczestniczy w produkcji kolagenu 

i podstawowych  białek w całym organizmie (kości, chrząstki,  ścięgna, więzadła). Jako jeden 

WF – ćw.7 

 

 

5

z najważniejszych przeciwutleniaczy pełni także istotną funkcję w reakcjach odtruwania i odporności 

organizmu chroniąc go przed procesami utleniania, uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu 

i kwasów żółciowych. 

Wśród metod oznaczania witaminy C można wyróżnić

 metody fizykochemiczne: chromatografia 

cieczowa, metoda spektrofotometryczna i metoda potencjometryczna oraz metody chemiczne. 

 

Odczynniki: 

-  r-r 2,6-dichlorofenolindofenolu (

2,6-DPIP)

 

- 1% 

FeCl

3

 

- 1% 

K

3

Fe(CN)

6

 

-  1% witamina C  

-  1%  i 2% kwas szczawiowy  

-  10% kwas trichlorooctowy (TCA) 

- 2% 

H

2

SO

4

 

- 10% 

NaOH 

- odczynnik 

Folina 

- 10% 

HCl 

 

1. Reakcja z żelazicyjankiem potasu 

Przygotować dwie próbówki. Do pierwszej dodać 5 kropli 1% r-ru witaminy C, a do drugiej 5 kropli 

wody. Następnie do obydwu próbówek dodać 1 kroplę 10% NaOH i 1 kroplę 1% żelazicyjanku potasu. 

Zawartość probówki wymieszać, a następnie dodać 3 krople 10% HCl i 1 kroplę 1% FeCl

3

. Obserwacje 

zanotować w zeszycie. 

2. Oznaczanie witaminy C metodą Folina 

Zasada oznaczenia  

W obecności kwasu askorbinowego kwas fosfomolibdenowy (VII) ulega redukcji do mieszaniny 

niższych tlenków molibdenu – błękitu molibdenowego. Odczynnik ten jest również specyficznie 

redukowany przez kwas askorbinowy w pH 1-7. W tym zakresie pH i poza witaminą C inne reduktory 

obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują go.  

Wykonanie 

1.  Otrzymanie homogenatu 

Każdy 1 g tkanki zalać 1 cm

3

 10% TCA, a następnie homogenizować przez 5 minut. Osad 

odwirować przy 3000 obr./min 

2.  Przygotowanie krzywej wzorcowej 

WF – ćw.7 

 

 

6

Przygotować krzywą standardową poprzez wykonanie szeregu rozcieńczeń roztworu wzorcowego 

kwasu askorbinowego o stężeniu 0,1mg / cm

3

 według tabeli : 

Stężenie kwasu 

askorbinowego 

0 

μ

g/ml 2,5 

μ

g/ml 5 

μ

g/ml 12,5 

μ

g/ml 25 

μ

g/ml 35 

μ

g/ml 

R-r wzorcowy [ml] 

0 0,05 0,1 0,25 0,5 0,7 

10% TCA [ml] 

2,0 1,95 1,9  1,75  1,5  1,3 

Do przygotowanych prób dodać po 0,2 ml odczynnika Folina i natychmiast po dodaniu energicznie 

zamieszać. 

3.  Oznaczenie witaminy C w materiale biologicznym 

Do oznaczeń pobrać 0,2-0,5 ml supernatantu. Objętość prób uzupełnić do 2 ml 10% TCA, 

a następnie dodać 0,2 ml odczynnika Folina i energicznie zamieszać  

 

Absorbancję mierzyć przy długości fali 750 nm względem próby zerowej. Obliczyć ilość witaminy C 

w badanym materiale biologicznym. Obliczyć ilość materiału biologicznego, który zaspokajałby 

dzienne zapotrzebowanie dorosłego człowieka na tę witaminę. 

Badany materiał biologiczny 

Ilość zaspokajająca dzienne zapotrzebowanie na wit. C 

dorosłego człowieka [g] 

 

 

 

 

 

 

 

3. Oznaczanie witaminy C metodą Tillmansa 

Zasada oznaczenia  

Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji barwnika 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas 

askorbinowy. Utleniony DCIP jest niebieski, zredukowany bezbarwny. Reakcja przebiega według 

równania: 

 

Oznaczanie kwasu askorbinowego polega na miareczkowaniu próby badanej w kwaśnym 

środowisku (zapobiega to samoutlenieniu kwasu askorbinowego tlenem z powietrza oraz chroni przed 

działaniem oksydaz). Barwnik jest zarazem indykatorem, po wyczerpaniu kwasu askorbinowego zabarwia 

on próbę miareczkowaną na kolor różowy. Wiadomo, że większość

  surowców roślinnych zawiera 

barwniki antocyjanowe, które nadają

  ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają 

WF – ćw.7 

 

 

7

właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczany witaminę

  C, występują  inne 

związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą

 do nich reduktony 

– związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać

  obecności 

ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich 

przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy 

sulfhydrylowe, które są

 utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi 

(pochodne cukrów, które powstają

 podczas obróbki termicznej). 

Wykonanie 

1.  Wyznaczanie miana roztworu 2,6-dichlorofenolindofenolu (2,6-DPIP) 

Pobrać 25 ml wzorcowego roztworu kwasu askorbinowego (4 mg kwasu w 100 ml 2% kwasu 

siarkowego) i zmiareczkować roztworem 2,6-dichlorofenolindofenolu do jasnoróżowego 

zabarwienia utrzymującego się przez 30 sek.  

2.  Oznaczanie zawartości witaminy C w badanych próbkach 

2-3 g jabłka, zhomogenizować z 20 ml 1% kwasu szczawiowego. Po homogenizacji roztwór 

uzupełnić do objętości 100 ml 1% kwasem szczawiowymi przesączyć. 25 ml klarownego 

przesączu miareczkować w kolbie stożkowej mianowanym roztworem 2,6-

dichlorofenoloindofenolu do uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez 30 sekund. 

 

Z równania reakcji kwasu askorbinowego z 2,6-DPIP wynika, że 1 ml roztworu barwnika odpowiada  

0,5  μmola kwasu tj, 0,088 mg. Korzystając z tej zależności oraz znając dokładne stężenie roztworu 

barwnika należy wyliczyć ilość witaminy C w badanej próbce. Wynik podać w miligramach 

przypadających na 100 g materiału roślinnego. Otrzymane dane porównać z wartościami literaturowymi.