Biotechnologiczne metody wytwarzania substancji biologicznie czynnych stosowanych w kosmetykach

Plan wykładu

Wstęp

Produkcja wybranych substancji w kulturach
bakteryjnych i roślinnych

Podstawy inŜynierii bioprocesowej

Pozyskiwanie mikroorganizmów

Czym jest biotechnologia...?

Połączenie wiedzy i umiejętności z zakresu:

biologii

chemii

fizyki

matematyki

informatyki,

umoŜliwiające wykorzystanie organizmów lub ich
metabolitów do procesów diagnostyczno-produkcyjnych

Co ma wspólnego biotechnologia
z kosmetologią...?

Niektóre składniki kosmetyków pozyskiwane są z
udziałem komórek organizmów

roślinnych

zwierzęcych

mikroorganizmów (bakterie, wirusy, grzyby)

Najczęściej stosowanymi „producentami” są
komórki bakteryjne oraz roślinne kultury
komórkowe i tkankowe

Strategie biosyntezy substancji

z wykorzystaniem roślin

Biosynteza

de novo

(kultury komórkowe

i tkankowe)

Biotransformacje

Biosynteza w

warunkach

naturalnych

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

są składnikami naturalnych olejków roślinnych

wykazują działanie antyseptyczne, rozgrzewające

zastosowanie: w aromaterapii, składniki kompozycji
zapachowych, perfum

przykłady:

mentol (zapach mięty)

citronelol (róŜany)

eugenol (goździkowy)

geraniol (bodziszkowy)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

Monoterpeny

Acykliczne

gerniol

nerol

citral

Monocykliczne

mentol

menton

pulegon

Dicykliczne

borneol

Aromatyczne

eugenol

izoeugenol

Najczęściej stosowana strategia:

biotransformacja

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

p-cymen, tymol,

p-cymen

Kultura zawiesinowa

T. vulgaris

(tymianek)

Gamma-terpin

geraniol, citronelal

neral, tlenki terpenowe

(intensywny zapach)

Kultura zawiesinowa

R. centifolia

(róŜa stulistna)

Citronelol, geraniol,

nerol

(olejek róŜany)

Produkty

Roślina

metabolizująca

Substraty

Zastosowanie:

uszczelniające naczynia krwionośne (rutyna)

antyoksydacyjne (hydrochuinon, kwas kawowy)

rozjaśniające skórę (arbutyna)

aromatyzujące (wanilina)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

Związki fenolowe

jednopierścieniowe

proste fenole,

pochodne

fenylopropanu

dwupierścieniowe

flawonoidy

wielopierścieniowe

garbniki

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

wanilina

Kultura immobilizowana

C. frutescens

Kwas felurowy

arbutyna

Kultura zawiesinowa

Datura innoxia

Bieluń indiański

Hydrochinon

Produkty

Roślina

metabolizująca

Substraty

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

Stosowana strategia:

biotransformacja

Zastosowanie:

jako substancje barwiące preparaty kosmetyczne (szikonina-
barwienie szminek do ust),

antyoksydanty (likopen, karoteny),

regenerujące naskórek (karotenoidy - prekursory wit. A)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

Barwniki

roślinne

Antocyjany

Glukozydy:

cyjanidyny
malwidyny

pelargonidyny

Flawony

apigenina

moreina

daidzeina

Karotenoidy

karoten

ksantofile

likopen

Chinony

alizaryna

szikonina

- kultura zawiesinowa
- bioregulatory zwiększają syntezę 60

razy

Licopersicon

esculentum

(pomidor)

Likopen

- kultura zawiesinowa
- bioreaktor typu air-lift
- logarytmiczna faza wzrostu
- system półciągły-wzrost syntezy 7,5

razy

Daucus carota

(marchew jadalna)

Karotenoidy

Warunki/uwagi

(biosynteza

de novo

)

Roślina

Produkt

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

- kultura zawiesinowa
- wymagają światła

Perilla frutescens

(pachnotka zwycz.)

Vitis vinifera

(winorośl)

Antocyjany

- I barwnik wytwarzany przemysłowo

in vitro (Japonia 1983 r.)

- system dwuokresowy
- zastąpienie kultury zawiesinowej

korzeniami transformowanymi:
wydzielanie barwnika do poŜywki

Lithospermum

erythrorhizon

(nawrot)

Szikonina

Warunki/uwagi

(biosynteza

de novo

)

Roślina

Produkt

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

biosynteza z udziałem mikroorganizmów jest alternatywą dla
glicerolu pozyskiwanego na drodze syntezy chemicznej,

mikroorganizmy: S. cerevisiae (warunki beztlenowe, wydajność:
30 – 40 g/L),

stosując kontrolowane natlenianie w obecności CO

wydajność

dochodzi do 230 g/L,

wady: powstawanie innych metabolitów (etanol, kwas octowy,
aldehyd octowy)

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(GLICEROL)

zastosowanie: jako środek konsystencjotwórczy (np. hydroŜele)

mikroorganizm:

Xanthomonas campestris

synteza 2-etapowa:

I biosynteza ksantanu (warunki tlenowe, glukoza lub sacharoza, składniki
mineralne, AA, NH4

, 25-34

C, mieszanie)

II wydzielanie biopolimeru (zawartość ksantanu: 10-30 g/L, wymaga
sterylizacji cieczy poreakcyjnej, oddzielenie komórek, wytrącenie
biopolimeru alkoholami)

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(Guma ksantanowa)

Podstawowy substrat: karotenoidy

Biosynteza karotenoidów z udziałem:

Rhodotorula gracialis

(20-50 mg/kg s.m.)

Chlorophycea sp.

(420-480 mg/kg s.m.)

Euglenophyceae sp.

(800 mg/kg s.m.)

Blakslea trispora

(3000 mg/L)

poŜywka:

skrobia, mąka sojowa, wyciąg kukurydziany, olej

bawełniany, witaminy, sole mineralne
biomasa jest suszona i ekstrahowana

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(WITAMINA A)

Biosynteza z udziałem:

Bacillus sphericus

IFO

PoŜywka: glicerol (2%), pepton (1%), sole mineralne

Wydajność: 200 mg/L

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(BIOTYNA)

Ciecz

pofermentacyjna

Odwirowanie

Adsorpcja

na węglu

aktywnym

Desorpcja

z węgla

EtOH/NH

3 (aq)

Odparowanie

rozpuszczalnika

Oczyszczanie

chromatograficzne

Biotechnologiczna linia produkcyjna

Przygotowanie mediów technicznych (media hodowalne,
powietrze woda, para wodna)

Etap hodowli mikroorganizmów w bioreaktorach

Procesy separacji (rozdział komórek od poŜywki,
produktów od medium hodowlanego itp.)

Procesy oczyszczania produktu (wirowanie, chromato-
grafia, elektroforeza)

Koncentracja pozyskanego produktu, pakowanie

Przygotowanie mediów

technicznych

Procesy jednostkowe

w przygotowaniu mediów technicznych

Sterylizacja

poŜywki

Sterylizacja

aparatury

Sterylizacja

powietrza

Metody sterylizacji

Sterylizacja

Beta-propiolakton

Formaldehyd

Tlenek etylenu

Sucha (termiczna)

Mikrofiltracja

Radiacyjna

Parowa

Kinetyka zabijania

drobnoustrojów

Sterylizacja jest procesem I-rzędu

= N

exp (-Dt)

lnN

Sterylizacja poŜywek

Czynniki wpływające na
efektywność sterylizacji:

• termooporność

mikroorganizmów

• początkowe „stęŜenie”

drobnoustrojów

• atenuacja (temp., UV)
• temp. w najzimniejszym

punkcie poŜywki

• czynniki środowiskowe

TEMPERATURA a CZAS:

(sterylizacja parowa)
100

200 min.

120

19 min.

121

15 min.

135

1 min.

pH a CZAS:

(spory

B. subtilis

, 100

4,4

2 min.

5,6

7 min.

6,8

11 min.

8,4

9 min.

Sterylizacja powietrza

Filtracja mechaniczna (membrany szklane,
celulozowe, nitrocelulozowe)

Wyjaławianie cieplne

Promieniowanie UV

Ultradźwięki

Sterylizacja aparatury

STERYLIZACJA

W bioreaktorze:

•

bezpośredni wtrysk

pary wodnej do cieczy

•

węŜownica

•

płaszcz grzejny między

ścianami bioreaktora

Poza bioreaktorem:

•

płytowe (UHT)

•

typu „rura w rurze”

Bioreaktory

•

urządzenia do prowadzenia procesów biosyntezy

•

wykonane najczęściej ze szkła lub stali nierdzewnej

•

najczęściej kształtu cylindrycznego

•

pojemność: od kilku do kilku milionów litrów

•

zapewniają właściwe warunki przebiegu procesu, regulację i
kontrolę wybranych parametrów

Bioreaktory

WyposaŜenie techniczne:

•

kadź

•

system mieszania poŜywki

•

system napowietrzania

•

system grzania/chłodzenia

•

urządzenia do gaszenia piany

•

urządzenia kontrolno-pomiarowe:

•

Ciśnienie: manometr

•

Obj. poŜywki: kryzy pomiarowe

•

pH: elektroda szklana

•

Potencjał redox: elektrody
platynowe

•

Przepływ powietrza: rotametr

•

StęŜenie tlenu: polarograf

•

Temperatura: termopara

•

Gęstość komórek: nefelometr,
turbidymetr

•

Ciśnienie osmotyczne: osmometr

•

StęŜenie cukrów: elektrody
enzymatyczne

Bioreaktory

(typy mieszania)

Frings, Effigas,

Vogel-Bush

mieszadło-aerator

reaktor zanurzeniowo-

strumieniowy

pompa zewnętrzna

HYDRAULICZNE

bioreaktor fluidalny,

air-lift, reaktor ICI

bełkotka

PNEUMATYCZNE

typowe konstrukcje

mieszadło turbinowe,

łopatkowe, śmigłowe,

kotwicowe

MECHANICZNE

Konstrukcje

Element

mieszający

Sposób

mieszania

Bioreaktory z mieszaniem

mechanicznym

•

konstrukcje praktyczne i
sprawdzone

•

wykorzystywane w przemyśle
mikrobiologicznym

•

modyfikacje: bioreaktor
Vogel-Busha ( z mieszadłem-
aeratorem)

•

stosowane typy mieszadeł:

kotwicowe, śmigłowe,
turbinowe, łopatkowe,
kotwicowo-ramowe, śrubowe,
śrubowo-wstęgowe

Bioreaktory z mieszaniem

pneumatycznym

•

prosta konstrukcja

•

moŜliwe duŜe rozmiary

•

brak występowania duŜych
sił ścinających

•

stosowane na skalę
laboratoryjną, pilotaŜową,
przemysłową

•

zastosowanie: produkcja
biomasy, metabolitów
wtórnych (np. produkcja
ajmalicyny przez

Catharantus roseus

)

Bioreaktory z mieszaniem

dyfuzyjnym

•

przeznaczony do hodowli kultur
protoplastów lub sferoplastów
roślinnych, komórek zwierzęcych

•

bezpęcherzykowy system
napowietrzający

•

specjalna geotkanina umoŜliwia
bezpośrednią dyfuzję tlenu do
medium hodowlanego

•

geotkanina jest odporna na adhezję
komórek

Kultura okresowa

•

jednorazowa inokulacja,
wprowadzenie poŜywki

•

proces biegnie do
wyczerpania substratów

•

4 fazy wzrostu mikrobów:
lag, log, plateau, zamierania

•

stosowane w skali
laboratoryjnej i
przemysłowej

•

nie wymagają dodatkowego
oprzyrządowania

•

wada: zmienność warunków
hodowli (ciśn. osmotyczne)

Kultura okresowo-dolewowa

•

w trakcie procesu następuje
stopniowe uzupełnianie składników
odŜywczych

•

początkowo bioreaktor jest
wypełniony w 50 %

•

moŜliwość prowadzenia hodowli
półciągłej

•

przez zdecydowaną większość
czasu kultura wzrasta w jednej z
preferowanych faz wzrostu np.
logarytmicznej przy prod. biomasy,
stacjonarnej-podczas produkcji
metabolitów wtórnych

•

jest stosowana głównie do
produkcji metabolitów wtórnych

Kultura ciągła

•

rozwój komórek
połączony z ciągłą
wymianą poŜywki

•

komórki są w stanie
nieograniczonego
wzrostu

•

zuŜyta poŜywka jest
odbierana

•

umoŜliwia uzyskanie
kultury o duŜej
gęstości

Powiększanie skali procesu

hodowli

•

problemy przenoszenia z małej na duŜą skalę,

•

powiększanie skali znacznie zmienia parametry hodowli,

•

im większy reaktor, tym większe: ciśnienie, procesy
energetyczne, mieszanie,

•

badania i pomiary dokonuje się w taki sposób, aby
ekstrapolacja i porównania doprowadziły do wnioskowania
matematycznego

Teoria podobieństwa

TEORIA PODOBIEŃSTWA:

•

układy uznaje się za podobne, jeŜeli kryteria charakteryzujące te
układy są równe

•

aby powiększyć skalę procesu hodowli, niezbędne jest zachowanie
podobieństw między poszczególnymi etapami wzrastającej skali

•

najwaŜniejsze podobieństwa:

- podobieństwo geometryczne bioreaktorów
- podobieństwo warunków mieszania cieczy
- podobieństwo warunków wymiany masy
- podobieństwo biologiczne

Wzrost

trudności

realizacji

Liczby kryterialne

Są to bezwymiarowe wielkości, które określają charakterystyczny

dla  danego  procesu  związek  między  wielkościami  fizycznymi.  Jako
minimum  przyjmuje  się określenie  podobieństwa  dla  tych  liczb
kryterialnych,  które  określają dominujące  siły  i  zjawiska  zachodzące
podczas procesu prowadzonego w reaktorze.

Za pomocą liczb kryterialnych moŜna opisać układ hydromechaniczny
bioreaktora...

Immobilizacja komórek

Komórki

Wiązanie komórek

niemodyfikowanych

Techniki immobilizacji

kom. modyfikowanych

Wiązanie

Uwięzienie

Sedymentacja

Flokulacja

Wiązanie do

nośnika

kowalencyjne

chelatowanie

adsorpcja

kapsułki

włókna

Ŝele

Wiązanie

poprzeczne

Separacja komórek od podłoŜa

hodowlanego

Między płynem hodowlanym a komórkami istnieje niewielka
róŜnica gęstości

sedymentacja zachodzi powoli

Faza

RóŜnica gęstości między fazą stałą

stała

a płynem hodowlanym [kg/m

]

Cytoplazma kom.

0-120

Bakterie

DroŜdŜe

Komórki zwierzęce

Komórki roślinne

Strzępki grzybni

Jak przyspieszyć proces

sedymentacji?

SEDYMENTACJA

V=d

(

ρρρρ

)g/18

ηηηη

Flokulacja

Pole grawitacyjne

Polikationy

chitozan

Wirówki

V=d

(

ρρρρ

ηηηη

Jak przyspieszyć proces

sedymentacji?

(

ρρρρ

)

ηηηη

Wirówki

W wirówkach

zastąpione jest przez

(przyspieszenie

odśrodkowe)

a = 4

r n

Wzór Stockes’a przyjmuje postać:

V=d

(

ρρρρ

) 2

r n

ηηηη

Typ wirówki

wartość g

Kliniczne i laboratoryjne

500-1500

Koszowe i filtracyjne

300-1500

Dekantacyjne

1500-4500

Talerzowe

4000-13000

Rurowe

10000-17000

Ultrawirówki

>100000

Wirówka filtracyjna

•

bęben wymoszczony tkaniną
o róŜnym stopniu porowatości,

•

3000-5000 obr./min

•

wydajność: 50-300 L/min.

•

efektywność maleje bo r maleje

•

działanie okresowe

•

zawiesiny: 2-5%

Wirówka dekantacyjna

ślimakowa

•

zawiesina jest podawana wałem
centralnym na ślimak

•

ślimak obraca się przeciwnie do
bębna

•

komora bębna zwęŜa się a
ślimak przesuwa osad

•

praca ciągła

•

wydajność: 20000 L/h

•

osad: 4 t/h

•

długość bębna do 10m

•

zawiesiny: 2-50%

Wirówka talerzowa (dyskowa)

•

samooczyszczająca

•

napierający osad otwiera „klapkę”

•

podstawowa wirówka w
przemyśle biotechnologicznym

•

12000 obr./min

•

średnica rotora 0,1-1m

•

wydajność: 100000 L/h

•

system ciągły

•

zawiesiny 15%

Wirówka wielokomorowa

•

zawiesina przepływa
szeregowo przez komory

•

następuje frakcjonowanie
cząsteczek pod względem
rozmiaru

•

kłopotliwe usuwanie osadu

•

4500-8500 obr./min.

•

wydajność: do 10000 L/h

•

działanie okresowe

•

dla zawiesin 4-5%

Wirówka rurowa

•

długość jest 4-8 krotnością
średnicy

•

mała wydajność: 100 L/h

•

do 50000 obr./min

•

średnica do 1 m

•

dla zawiesin do 1%

Filtracja

Siłą motoryczną filtracji jest róŜnica ciśnień po obu
stronach przegrody

RóŜnicę ciśnień moŜe być wywołana przez:

•

pompę tłoczącą zawiesinę na filtr

(filtracja ciśnieniowa)

•

pompę próŜniową zasysającą supernantant

(filtracja

próŜniowa)

•

słup cieczy nad filtrem

(filtracja grawitacyjna)

•

siłę odśrodkową wytworzoną w wirówce

Filtracja

Typy filtracji

(w zaleŜności od

rodzaju przegrody)

F. WGŁĘBNA

Filtracja zachodzi wewnątrz

przegrody

Przegrody:

warstwy ziarniste

masy porowate

F. POWIERZCHNIOWA

Separowane cząstki tworzą

warstwę „placek” na

powierzchni przegrody

Przegrody:

cząstki zawieszone

F. MEMBRANOWA

W wyniku przepływu wzdłuŜ

przegrody filtracyjnej nie

tworzy się warstwa osadu

Przegrody:

membrany z polipropylenu,
estrów celulozy, poliamidu,

ceramiczne

Filtracja

Typy filtracji

(mechanizm działania

przegrody)

SZLAMOWA

Warstwa osadu tworzy

właściwą przegrodę

filtracyjną

(kadź filtracyjna w browarze,

filtracja w droŜdŜowniach)

Wskazania: mała lepkość,

gęsta zawiesina

Z BLOKOWANIEM

PRZEGRODY

Wielkość filtrowanych cząstek

jest większa od otworów w

przegrodzie, następuje

blokada kapilar przegrody

(klarowanie soków owocowych)

Wskazania: duŜa lepkość,

rzadka zawiesina

MIESZANA

Jest kombinacją obu typów

filtracji

Filtracja styczna

(mikrofiltracja)

•

membrana charakteryzuje się duŜym oporem przepływu,

•

mała przepuszczalność rekompensowana przez rozwiniętą
powierzchnię,

•

brak „placka” filtracyjnego podczas filtracji

•

konieczność stosowania nadciśnienia po stronie nadawa-permeat

•

średnica porów przegrody: 0,05-10

•

zastosowanie: wstępne oczyszczanie cieczy w przemyśle
botechnologicznym, farmaceutycznym, spoŜywczym

•

retencja bakterii i grzybów

Nadawa

Retentat

Permeat

Oddzielanie i oczyszczanie

produktów

Produkty:

•

witaminy

•

antybiotyki

•

białka i polipeptydy

•

metabolity mikroorganizmów

•

polisacharydy bakteryjne

•

alkohole

Odznaczają się róŜnymi właściwościami fozykochemicznymi oraz mogą być
wydzielane wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowo wymaga to odrębnego,
specyficznego postępowania podczas oczyszczania produktu

Oddzielanie i oczyszczanie

produktów

Gdzie jest produkt?

Roztwór pohodowlany

Komórki bakteryjne

Procesy:

- ekstrakcji

- nano/ultrafiltracja

- precypitacja

- ultrawirowanie

Dezintegracja komórek

Odwirowanie ścian

komórkowych

Pozyskiwanie drobnoustrojów

Środowisko naturalne

– jako niewyczerpany rezerwuar szczepów

przydatnych do bioprodukcji metabolitów. Izolacja interesującego
nas szczepu wymaga przeprowadzenia odpowiednich procedur

screeningowych

II.

Kolekcje placówek naukowych, firm biotechnologicznych, kolekcje
centralne np.:

ctinomycetes

ulture

ollection

, ACC, UK

merican

ype

ulture

ollection

(ATCC) Rockwill, USA

orld

ata

enter of

icroorganism

(WDCM), 566 kolekcji,

obejmuje:

- kolekcje międzynarodowe
- kolekcje narodowe
- kolekcje uniwersyteckie
- kolekcje przemysłowe

Collection Nationale des Cultures de Microorganismes

, Instytut

Pasteura

Instytut Biotechnologii i Przemysłu SpoŜywczego w Warszawie