POLITECHNIKA KOSZALIŃSKA 

WYDZIAŁ MECHANICZNY 

KATEDRA BIOCHEMII I BIOTECHNOLOGII 

 

 

Instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku TŻiŻCz 

TECHNOLOGIE ENZYMATYCZNE 

 
 
 
 
 
 
 

Ćwiczenie 3 

HYDROLIZA SACHAROZY – 

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA 

DLA INWERTAZY DROŻDŻOWEJ 

 
 

 
 

Prowadząca: 

mgr inż. Małgorzata Smuga 

 

 
 
 

 

 
 
 
 

ĆWICZENIE 3 

 

HYDROLIZA SACHAROZY - WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA 

DLA INWERTAZY DROŻDŻOWEJ 

Wprowadzenie: 

Inwertaza  (E.C.  3.2.1.26)  jest  enzymem  katalizującym  reakcję  hydrolizy  sacharozy 

do fruktozy  i  glukozy.  Inwertaza  jest  wytwarzana  przez  komórki  drożdży,  pozwala  rozłożyć 

sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, 

podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito 

cienkie.  Inwertaza  występuje  też  w  ślinie  pszczół  i  bierze  udział  w  przetwarzaniu  cukru  z  nektaru 

kwiatowego do cukrów prostych. 

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek 

nadziewanych  półpłynnym  nadzieniem.  Podczas  produkcji  nadzienie  w  postaci  stałej  (głównym 

składnikiem  jest  sacharoza)  pokrywane  jest  czekoladą,  a  następnie  w  ciągu  kilkutygodniowego 

„dojrzewania"  czekoladek  w  wyniku  działania  inwertazy  dodanej  w  procesie  produkcji,  sacharoza 

rozkładana  jest  do  fruktozy  i  glukozy,  które  chłonąc  wilgoć  ze  środowiska  powodują  w  efekcie 

upłynnienie nadzienia. 

Celem ćwiczenia jest poznanie właściwości hydrolitycznych inwertazy z drożdży. 

Wykonanie ćwiczenia: 

Zadanie 1. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży 

2  g  drożdży  rozetrzeć  w  moździerzu  z  piaskiem,  dodać  ok.  10  cm  wody  i  ponownie  dokładnie 

rozetrzeć i odwirować. Supernatant wlać do 5-krotnej objętości acetonu. Wytrącony osad rozpuścić 

w 10  cm  wody  i  przesączyć.  Przesącz  zawierający  enzym  można  przechowywać  w  lodówce  kilka 

tygodni. 

Zadanie 2. Oznaczanie aktywności inwertazy 

1  g  drożdży  rozprowadzić  w  6  ml  ciepłej  wody  (do  40°C).  Przygotować  2%  roztwór  sacharozy 

(stężenie  substratu  ustalić  z  prowadzącym).  Do  probówki  wprowadzić  2  ml  roztworu  substratu,

  

a  następnie  dodać

  1

  ml

  roztworu

  enzymu.

  Pobierać

  próbkę  co

  1  -  5

  min 

(w  zależności 

od otrzymywanych  wyników  -  czas  ustalać  z  prowadzącym)  i  sprawdzać  stężenie  glukozy  przy 

pomocy  paska  diagnostycznego,  nanosząc  na  niego  bagietką  kroplę  badanego  roztworu  i  po  30  s 

porównując barwę ze wzorcem. Reakcję prowadzić, w zależności od wyników, przez 5 - 1 5  min. 

Badanie powtórzyć dla innego stężenia substratu. 

Narysować wykres oraz wyznaczyć rząd reakcji, stałą szybkości reakcji k i szybkość początkową dla 

każdego  stężenia  substratu.  W  przypadku  oznaczeń  dla  kilku  stężeń  substratu  wyznaczyć  Km  oraz 

V

max 

Zadanie 3. Do probówki wprowadzić inny substrat (np. rozcieńczone mleko) oraz enzym w ilościach 

j.w.  i  zbadać  stężenie  glukozy  po  czasie  odpowiadającym  maksymalnemu  stężeniu  glukozy  

w poprzedniej części ćwiczenia. 

Zadanie  4.  Powtórzyć  doświadczenie  2,  dodając  do  enzymu  NaCl  w  takiej  ilości,  by  otrzymać 

ostateczne stężenie w próbie 5%. 

Zadanie  5.  Wyniki  zestawić  w  tabeli/tabelach  oraz  przedstawić  na  wykresie/wykresach  (zależność 

stężenia produktu od czasu, stężenia substratu od czasu, wykres Michaełisa- Menten i Lineweavera-

Burka). Określić działanie NaCl na przebieg reakcji enzymatycznej. 

Zadanie 6. Oznaczyć stężenie enzymu w roztworze metodą biuretową. Oznaczanie stężenia białka 

metodą  biuretową:  Do  kolbek  odmierzyć  po  1  cm  kolejnych  prób  (do  próby  ślepej  użyć  wody 

destylowanej),  dodać  po  4  cm

J

  odczynnika  miedziowego,  do  drugiego  zestawu  dodać  po  4  cm

3

 

odczynnika zmętnieniowego. Wszystkie próby wykonywać w 3 powtórzeniach. Po 30 min odczytać 

absorbancję  przy  długości  fali  540  nm.  Zawartość  białka  odczytać  z  krzywej  wzorcowej  

(po uwzględnieniu zmętnienia), zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie. 

Zagadnienia do przygotowania: 

1.  Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych. 

2.  Inwertaza i oksydaza glukozowa. 

3.  Izolacja i oczyszczanie enzymów. 

 

 

Literatura: 

1.  Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii", PWN Warszawa - Poznań 

1982. 

2.  Stryer L.: „Biochemia", PWN Warszawa 1986. 

3.  Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)", Wydawnictwo 

UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000. 

4.  Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników 

żywności", Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005