Ćwiczenie 09

Konstytutywna i indukowana synteza β-galaktozydazy. Represja kataboliczna.

β-galaktozydaza jest enzymem katalizującym rozpad laktozy na glukozę i galaktozę, które są bezpośrednio wykorzystywane w glikolizie. Enzym ten jest syntetyzowany indukcyjnie, gdy w podłożu znajduje się laktoza. Indukcja genów operonu lac może być również spowodowana syntetycznymi β-galaktozydami, np.: izopropylotiogalaktozydem (IPTG), czy tiometylogalaktozydem (TMG). Substratem dla β-galaktozydazy w reakcji barwnej jest o-nitrofenylogalaktozyd, który jest rozkładany na galaktozę i ortonitrofenol (ONP). ONP nie jest dalej rozkładany przez bakterie i w roztworze o wysokim pH przybiera żółtą barwę. Intensywność zabarwienia w przeliczeniu na jednostkę czasu określa aktywność β-galaktozydazy.

Dołączone materiały:

1. Budowa operonu laktozowego u Escherichia coli (rys. 1).

2. Negatywna kontrola ekspresji operonu laktozowego (rys. 2, 3).

3. Represja kataboliczna operonu laktozowego (rys. 4).

4. Synteza enzymów operonu lac w merozygotach i⁺/i^- oraz o^c/o⁺ (rys.5, 6).

Materiały:

1. szczepy bakteryjne:
   E. coli lac⁺ (i⁺z⁺y⁺)
   E. coli lac^- (i⁺z^-y⁺)
   E. coli lac^- (i⁺z⁺y^-)
   E. coli lac⁺ (i^-z⁺y⁺)

2. probówki z płynnym podłożem M9 uzupełnionym 0,5% glicerolu

3. 3 ml glukozy (0,1 mol/l)

4. 3 ml laktozy (0,1 mol/l)

5. 3 ml ONPG w stężeniu 4 mg/ml [rozpuścić 0,1 g ONPG w 25 ml buforu Na₃PO₄ (0,25 mol/l), pH 7,0 zawierającego MgSO₄ (0,001 mol/l), MnSO₄ (0,0002 mol/l) i β-merkaptoetanol (0,1 mol/l). Lekko ogrzać do rozpuszczenia, ostudzić i przechowywać w lodówce]

6. 10 ml Na₂CO₃ (1 mol/l)

7. 15 ml buforu Z  [Na₂HPO₄ x 7H₂O (60 mM), NaH₂PO₄ x 7H₂O (40 mM), KCl (10mM), MgSO₄ x 7H₂O (1 mM), β-merkaptoetanol (50 mM), pH 7,0]

8. toluen

9. probówki zwykłe i aglutynacyjne, pipety, łaźnie wodne o temperaturze 28°C i 37°C, spektrofotometr.

Wykonanie:

1. Przygotowanie hodowli bakterii:

• pobrać 5 ml podłoża płynnego M9 z glicerolem do probówki 15 ml;

• zaszczepić jałowo jednym lub dwoma oczkami ezy danego szczepu bakteryjnego;

• hodować w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez 18 godzin;

• dodać 0,05 ml całonocnej hodowli bakterii każdego ze szczepów do trzech probówek z podłożem M9;

• inkubować z wytrząsaniem 3-4 godziny w 37°C.

2. Indukcja enzymu:

• probówki zawierające odmłodzone hodowle danego szczepu uzupełnić odpowiednio:
  1-0,5 ml H₂O dest.
  2-0,5 ml glukozy
  3-0,5 ml laktozy;

• inkubować z wytrząsaniem 30 minut w temperaturze 37°C.

3. Oznaczanie aktywności enzymu:

• przygotować 12 probówek aglutynacyjnych (po 3 na każdy szczep) dodając do każdej kroplę toluenu

• do każdej probówki z toluenem dodać 1 ml odpowiedniej hodowli, wytrząsnąć i wstawić je do łaźni wodnej o temp. 37°C na około 30 minut

• przenieść probówki do łaźni wodnej o temp. 28°C i dodawać kroplami 0,2 ml ONPG

• po 15 minutach zatrzymać reakcję przez dodanie 0,5 ml Na₂CO₃ do wszystkich probówek (zapisać czas trwania reakcji)

• zmierzyć gęstość optyczną w każdej probówce przy długości fali 420, 550 i 600 nm (probówka nr 1 stanowi kontrolę)

4. Opracowanie wyników:

•     dla każdego szczepu policzyć aktywność β-galaktozydazy ze wzoru:

t- czas trwania reakcji (min)
v- objętość hodowli pobrana do oznaczenia (ml).

1 U β-galaktozydazy = 1 nmol substratu / 1 min. / 1 mg białka

Zadania:
Porównać aktywność β-galaktozydazy w różnych mutantach rosnących na podłożu z laktozą i glukozą.

 

rys. 1. Model operonu laktozowego u E. coli

 

rys. 2. Represja operonu laktozowego. Źródło: R. F. Weaver, 1999

 

rys. 3. Indukcja operonu laktozowego. Źródło: R. F. Weaver, 1999

 

 

rys. 5. Indukcyjna synteza enzymów operonu lac w merozygotach i⁺/i^-

 

rys. 6. Konstytutywna synteza enzymów operonu lac w merozygotach o^c/o⁺

---