Temat: Badanie składników kwasów nukleinowych
Cel Ćwiczenia:
Ćwiczenia ma na celu poznanie niektórych reakcji barwnych charakterystycznych dla kwasów dezoksyrybonukleinowych, w których składzie obecne są pentoza - deoksyryboza, oraz tymina, jak również na wykonanie reakcji na obecność otrofosforanów.
Zasada metody
1. Hydrolizę chemiczną wykonuje się najczęściej traktując frakcję kwasów nukleinowych zasadami lub kwasami, np. 0,3-molowym NaOH w temp. 37oC, 6-molowym HCl w temp. 100oC lub 12-molowym HCl4 w temp. 100oC. Oba kwasy nukleinowe zachowują się różnie pod wpływem tych związków.
Reakcja na wykrywanie tyminy:
Odróżniono oba typy kwasów polega na wytworzeniu przez tę zasadę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwonobrunatnej.
Reakcja na obecność fosforanów:
Polega na łączeniu się molibdenianu amonowego z jonem fosforanowym, tworzącym wówczas kompleksu
o barwie żółtej.
2. Składniki kwasów nukleinowych można też badać za pomocą reakcji barwnych w preparatach nie hydrolizujących. Nie hydrolizujące kwasy nukleinowe wykazują wspólną reakcję na obecność pentozy (reakcja Biala). Natomiast reakcją odróżniającą RNA od DNA w formie nie hydrolizującej jest reakcja Dishego na obecność deoksyrybozy.
Odczynniki:
1. roztwór kwasów nukleinowych
2. 0,1-molowy NaOH
3. 60% kwas nadchlorowy
4. odczynnik Biala
5. 1% roztwór difenyloaminy
6. roztwór molibdenianu amonowego
7. 5-moplowy NaOH
8. 1,1% roztwór węglanu sodowego
9. odczynnik diazowy
10. 3-molowy NaOH
11. 20% roztwór hydroksyloaminy
12. 96% alkohol etylowy
Wykonanie:
1. Hydroliza Kwasu Dezoksyrybonukleinowego
Do probówki zawierającej 2 ml kwasu nukleinowego w 0,1-molowym NaOH dodano 2ml kwasu nadchlorowego. Równolegle wykonywano próbę kontrolną, w której kwas nukleinowy zastąpiono 2 ml NaOH. Obie probówki (z kwasem i z NaOH)umieszczono w łaźni wodnej w temp. 100 C na 60 minut.
Po upływie tego czasu odmierzono do jednej probówki 2ml hydrolizatu, a do drugiej
probówki 2 ml próby kontrolnej. Zobojętniono obie próby dodając 1,5ml 5-molowego NaOH, tak żeby roztwór miał pH 7-8 (pH sprawdzano za pomocą papierka lakmusowego, dodając roztwory NaOH, aż otrzymano odpowiednie pH). Roztwór został użyty do wykonania reakcji na obecność tyminy.
Pozostałe nie zobojętnione 2ml hydrolizatu i 2ml próby kontrolnej rozcieńczono dodając do każdej po 4 ml wody i zastosowano do wykrycia kwasu ortofosforowego.
2. Reakcja na obecność tyminy
Do dwóch probówek odmierzono po 2,5 ml roztworu węglanu sodowego i po 1 ml odczynnika diazowego. Do jednej probówki dodano 0,5ml zobojętnionego hydrolizatu kwasu nukleinowego, do drugiej 0,5ml zobojętnionego roztworu próby kontrolnej. Po 5 min. do obu probówek dodano po 1ml 3-molowego NaOH i 2-3 krople hydroksyloaminy. Po 5 min zaobserwowano zmianę barwy, w probówce z kwasem nukleinowym powstał kompleks barwy czerwonej.
3. Reakcja na wykrycie kwasu ortofosforowego
Do jednej probówki odmierzono 1 ml kwaśnego hydrolizatu kwasu nukleinowego, do drugiej 1 ml roztworu próby kontrolnej. Do obrywu probówek dodano po 2 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zaobserwowano wytworzenie się kompleksu barwy żółtej w probówce z kwaśnym hydrolizatem kwasu nukleinowego.
Do 1ml kwasu nukleinowego w 0,1-molowym NaOH dodano 8 ml i wymieszano. Tak przyrządzony roztwór użyto do reakcji Biala i Dishego
4. Reakcja Biala
Do dwóch probówek odmierzono po 5 ml odczynnika Biala i wstawiono do łaźni wodnej na 5 min (temp 100C). Następnie do jednej probówki dodano 1ml rozcieńczonego roztworu kwasu nukleinowego, do drugiej 1ml 0,1-molowego NaOH (próba kontrolna). wymieszano i ogrzewano w łaźni wodnej przez 15 minut. Po upływie wyznaczonego czasu zaobserwowano zmianę barwy pierwszej probówki na lekko zieloną względem próby kontrolnej.
5. Reakcja Dishego
Do jednej probówki odmierzono 1ml rozcieńczonego roztworu kwasu nukleinowego, do drugiej 1ml 0,1-molowego NaOH (próba kontrolna). Do obu probówek wlano po 2 ml roztworu difenyloaminy i wstawiono do wrzącej łaźni na 5 min. Po upływie wyznaczonego czasu zaobserwowano zmianę barwy pierwszej probówki na lekko niebieską względem próby kontrolnej.
Podsumowanie:
Kwasy nukleinowe można rozpoznać za pomocą różnych reakcji barwnych. Reakcja na obecność otrofosforanu umożliwiła udowodnienie, że w probówce znajduje się kwas nukleinowy, ponieważ reakcja z DNA lub RNA tworzy wraz z roztworem molibdenianu amonowego kompleks barwy żółtej. Reakcja na obecność tyminy wytwarza czerwony kompleks w probówce zawierającą roztwór z tą zasadę. Reakcja ta umożliwia określenie konkretnego kwasu nukleinowego znajdującego się w probówce - DNA. Za pomocą reakcji Biala wykryto pentozę znajdującą się w roztworze, a dzięki reakcji Dishego określono, konkretną pentozę znajdującą się w próbce - deoksyrybozę, na podstawie której scharakteryzowano kwas nukleinowy jako DNA.