Ćwiczenie 10

Mapa koniugacyjna chromosomu Escherichia coli

Mapowaniem genów nazywamy ustalanie ich kolejności i odległości między nimi. Koniugacja jest jednym ze sposobów mapowania genów bakteryjnych. Komórki dawcy oznaczone Hfr, zawierające zintegrowany z chromosomem plazmid F (rys. 2), przekazują swój materiał genetyczny do komórek biorcy (rys. 3, 4). Dzięki przerywaniu koniugacji po określonym czasie można wpłynąć na to  jak duża część chromosomu zostanie pobrana do komórek biorcy (rys. 5). Położenie genów na chromosomie określa się w minutach, a odległości między genami można ustalić z dokładnością do 1 minuty. Kolejność genów na chromosomie (w stosunku do miejsca integracji) ustala się na podstawie częstości ich przekazywania. Im bliżej początku transferu (origin of transfer) leży gen, tym wydajniej jest przekazywany do biorcy.

Dołączone materiały:

1. Schematy koniugacji bakteryjnej (rys. 1, 3, 4, 5).

2. Etapy powstawania mutantów Hfr oraz F' (rys. 2).

3. Kolista mapa genetyczna Escherichia coli (rys. 6).

Plan ćwiczenia:
Po zmieszaniu hodowli dawcy Hfr i biorcy F^- oraz koniugacji trwającej określony czas, mieszaninę koniugacyjną należy wysiać na odpowiednie podłoża (selekcja rekombinantów). Nabycie przez biorcę odpowiednich cech fenotypowych świadczy o koniugacyjnym przeniesieniu genów kodujących te cechy, z dawcy do biorcy. Ilość kolonii na odpowiednich podłożach selekcyjnych świadczy o wydajności procesu, a to z kolei wskazuje na odległość danego genu od początku transferu.

Materiały:

1. Szczepy:
   - E. coli Hfr H str ^s - dawca;
   - E. coli Hfr 2 str ^s - dawca;
   - E. coli AB1157 F^- thr^- leu^- pro^- his^- arg^- str^r- biorca.

2. Podłoża do hodowli i selekcji po koniugacji:
   - podłoże LB płynne i stałe;
   - podłoże M9A stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml argininy, proliny i histydyny;
   - podłoże M9B stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml argininy, treoniny, leucyny i histydyny;
   - podłoże M9C stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml argininy, treoniny, leucyny i proliny;
   - podłoże M9D stałe: M9 uzupełnione 0,5% glukozy, 250 μg/ml streptomycyny i po 20 μg/ml treoniny, leucyny, proliny i histydyny.

3. Probówki i pipety.

Wykonanie:

• całonocne hodowle dawcy i biorcy w podłożu LB odmłodzić przez 10-krotne rozcieńczenie w świeżym podłożu LB i hodować przez 2 godziny w 37°C;

• zmieszać 1 ml hodowli dawcy i 1 ml hodowli biorcy i inkubować w 37°C bez wytrząsania;

• po 10 minutach inkubacji pobrać 0,1 ml mieszaniny koniugacyjnej, rozcieńczyć 10 razy w podłożu LB, wytrząsnąć energicznie i wysiewać  po 0,1 ml na podłoża selekcyjne:
  M9A -selekcja rekombinantów thr⁺leu⁺
  M9B - selekcja rekombinantów pro⁺
  M9C - selekcja rekombinantów his⁺
  M9D - selekcja rekombinantów arg⁺;
  Streptomycyna w podłożach selekcyjnych eliminuje dawcę i chroni przed ponownym tworzeniem się par koniugacyjnych na płytkach.

• wysiewy mieszaniny koniugacyjnej na podłoża selekcyjne powtórzyć po 30 i 60 minutach;

• płytki inkubować w 37°C przez 48 h;

• wysiać po 0,1 ml hodowli biorcy i dawcy (przed zmieszaniem) na wszystkie podłoża selekcyjne jako kontrolę powstawania rewertantów.

• hodowlę dawcy rozcieńczyć 10-4, 10-5 i 10-6 w podłożu LB i wysiać po 0,1 ml na stałe podłoże LB jako kontrolę miana dawcy.

Zadania:

1. Policzyć kolonie na płytkach kontrolnych i selekcyjnych.

2. Wykreślić krzywą zależności ilości rekombinantów danego typu od czasu trwania koniugacji.

3. Określić czas przekazywania badanych genów do biorcy.

4. Ustalić kolejność przekazywania badanych genów przez szczepy dawców E. coli Hfr H i E. coli Hfr 2.

 

rys. 1

 

rys. 2

 

rys. 3

 

rys. 4

 

rys. 5

 

rys. 6