BIOCHEMIA KLINICZNA

Wykład 1

WODA I ELEKTROLITY

bilans wodny

Woda pobrana (l)	Woda wydalana (l)
Napoje 0,5-2,5 (1,5)	Mocz 0,6-2,6 (1,5)
Żywność 0,7	Pot 0,5
Metabolizm 0,3	Płuca 0,4
	Kał 0,1

Pobór dzienny = wydalanie = ok. 2,5 litra

W komórkach znajduje się około 42 litrów wody a hormon ADH odpowiada za zwrotne wchłanianie wody.

Podział wody:

• woda całkowita: mężczyźni 60% m.c, kobiety 55%

• woda wewnątrznaczyniowa -70% (40%masy ciała)

- zewnątrznaczyniowa - 68%

- wewnątrznaczyniowa- 2%- erytrocyty, płytki, leukocyty

• woda zewnątrzkomórkowa 30% (20%masy ciała)

- zewnątrznaczyniowa (transcelularna) 23%- płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn komory oka, otrzewnowy, opłucnowy

- wewnątrznaczyniowa( osocze) 7%

krew >7% masy ciała : ok.5L

woda w tkankach: całkowita ilość wody zależy od wieku

tłuszcz 10-155 wody niemowlę 77%

kości 20% wody dzieci 65%

osocze 93% wody dorośli 60%

większość tkanek 70-80% wody starzy ludzie 55%

definicja mEq

Ekwiwalent jest jednostką miary stężeń używaną w chemii i naukach biologicznych

jest miarą zdolności substancji do łączenia się z innymi substancjami.

	mmol/l	mEq/l
Na^+	140	140
Ca^2+	2,5	5

153 mEq/l =kationy=aniony - diagram Gambla- wyraża elektroobojętność płynów ustrojowych

		osocze	komórka	Płyn pozakomórkowy pozanaczyniowy		Kationy ogólna wartość	Aniony ogólna wartość
kationy	Na^+	140	12	142
	K^+	40	140	4,5	osocze	151mEq/l	151mEq/l
		Ca^2+	5	-	2,5
		Mg^2+	2	-	2	komórka	190mEq/l	190mEq/l
aniony	Cl^-	102	4	113
	HCO^-3	24	12	27	płyn	150mEq/l	150mEq/l
		białko	17	65	4
		pozostałe	8	109	7

Obecność białka zmniejsza przestrzeń w jakiej może być rozpuszczony jon np. sód , dlatego stężenie elektrolitów powinno być oznaczane we frakcji wodnej.

Na⁺=Na_s/Fw_f Na=stężenie sodu we frakcji wodnej,

Na_s= stężenie ogólne sodu , Fw_f= wielkość frakcji wodnej (u zdrowego człowieka =0,93)

Równowaga Donnana

Obecność białka w osoczu wymusza specyficzny rozkład jonów pomiędzy osoczem a płynem pozanaczyniowym pozakomórkowym, praktycznie pozbawiony tego białka.

Białko (B^-) powoduje, że powstaje nadmiar jonów „-”,

więc w przestrzeni obniża się stężenie jonów „-”, a podwyższa jonów „+”

B^-

↓Cl^- ↑Na^+

Stężenie elektrolitów w płynie pozanaczyniowym

Na⁺=(Na_s/Fw_s) * 0,95=Na⁺ _* 0,95 Cl^-=Cl^-_s/Fw_s *1,05 = Cl^- *1,05

Luka anionowa →jest to różnica pomiędzy sumą anionów nieoznaczanych i sumą kationów resztkowych

LA=8-16 mEq/l

aniony nieoznaczane: kationy resztkowe

-białka- 17mEq/l wapń-5 mEq/l

-kwasy organiczne- 3mEq/l potas 4 mEq/l

-fosforany 2mEq/l magnez 2mEq/l

-siarczany 1mEq/l Σ 11

Σ 23

LA= Na^--(Cl^-+HCO^-₃)=8≡16mEq/l≈12 mEq/l

(różnica między stężeniem sodu, a sumą stężeń Cl^- i HCO^-₃₎

Zjawisko osmozy

Osmolalność

• osmolalność płynu wewnątrzkomórkowego jest taka jak płynu zewnątrzkmórkowego te dwie komponenty zawierają izotoniczne roztwory

• woda przemieszcza się pomiędzy przestrzenią wewnątrz i zewnątrznaczyniową i utrzymuje te same ciśnienie osmotyczne pomimo tego, że może powodować obkurcz lub pęcznienie komórek

osmotycznie czynna substancja redukuje liczbę cząsteczek wolnej wody

Osmolarność →mol substancji w 1 litrze roztworu

Osmolalność →mol substancji w 1 kilogramie rozpuszczalnika

osmolarność osocza

• pomiar przy użyciu osmometru

osmolarność = 2(Na) + glukoza + mocznik ; norma 2(140)+5+5=290 (270≡300mM)

Luka osmotyczna

osmolalność zmierzona (o_z) - osmolalność obliczona (o_o) = luka osmolalna (L_o)

Lo pojawia się wtedy gdy osmolalność zmierzona przekracza osmolalność obliczoną o więcej niż 10 mOsm. W przypadku wzrostu luki należy przeprowadzić specyficzne badania w celu ustalenia przyczyny.

Najczęstsze przyczyny wzrostu luki osmotycznej:

• etanol

• alkohol izopropylowy

• metanol

• glikol etylenowy

• mannitol

• luka osmotyczna narasta także u osób dializowanych

Klirens wolnej wody

• klirens wolnej wody opiera się na badaniu osmolalności i pozwala ocenić ilość wody wchłoniętej lub wydalanej w procesie rozcieńczania lub zagęszczania moczu

• objętość moczu niezbędna do wydalania wszystkich rozpuszczonych w nim substancji osmotycznie czynnych w stężeniu izoosmotycznym w stosunku do osocza nazywa się klirensem osmotycznym (Cosm)

Cosm=V osm /P osm *V

Cosm- klirens osmotyczny,

Vosm-osmolalność moczu,

Posm- osmolalność osocza,

V-diureza minutowa (ml/min)

C_h2o= V - C osm

Klirens wolnej wody jest to różnica pomiędzy diurezą minutową a klirensem osmotycznym. Jeżeli mocz jest hipertoniczny to C_h2o ma wartość dodatnią, informuje więc o aktywność hormonu antydiuretycznego (ADH)

Sód 135-147 mEq/l

znaczenie kliniczne

- odpowiada za objętość wody pozakomórkowej

oznaczanie stężenie sodu

- starsza metoda oparta jest na fotometrii płomieniowej

- nowsza przy użyciu jonoselektywnych elektrod dla Na

za stężenie sodu odpowiada aldosteron, decyduje on o zwrotnym wchłanianiu

mechanizm Golblata -[ Na⁺] → ↓ ciśnienia krwi → ↑ wydzielania reniny →↑ angiotensyny I →↑ angiotensyny II→↑ wydzielania aldosteronu i RR

Potas 4,7-5,3 mEq/l

Znaczenie kliniczne

- jest odpowiedzialny za objętość wody wewnątrzkomórkowej , odpowiada za polaryzację błon i dynamikę skurczu mięśni ( zaburzenia pracy serca i mięśni szkieletowych)

- w EKG widoczna jest hiperkaliemia przy prawidłowym stężeniu potasu EKG prawidłowe, 1. wzrost załamka T - potas ok.6-7 mEq/l 2. załamek T węższy i wyższy - potas ok 7-8 mEq/l 3. amplituda załamków zmniejszona , odcinek PR wydłużony, QRS poszerzony- potas > 8mEq/l 4. załamek P znika a QRS staje się sinusoidą - potas >10 mEq/l

-hiperkaliemia- zaburzenia akcji serca, brak manifestacji na mięśniach szkieletowych

-hipokaliemia- silne zaburzenia w EKG, osłabienie mięśni szkieletowych, pojawia się załamek U związany z ↓ załamka ST-T, obniżenie ST jest lepiej widoczne, osłabienie pracy mięśnia sercowego, zaparcia

Oznaczanie stężenia potasu

-kiedyś fotometria płomieniowa,

-obecnie za pomocą elektrody jonoselektywnej (JSE)

Artefakty

- pseudohipokaliemia - występuje w przebiegu białaczki szpikowej z leukocytozą ↑ 100 tysięcy/μl

- pseudohiperkaliemia- występuje w przypadku hemolizy szczególnie w wyniku nieprawidłowego pobrania krwi lub opóźnionego oddzielenia krwinek od surowicy i rozpadu płytek krwi w trakcie wykrzepiania.

Wykład 2

WAPŃ 4,5-5,5 mEq/l

Znacznie kliniczne:

• mineralizacja kości (krzywica, osteoporoza)

• pobudliwość nerwowo-mięśniowa (tężyczka) → w płytce motorycznej impuls przenoszony jest na mięśnie w wyniku czego następuje ich skurcz, gdy wapnia jest zbyt mało występuje seria impulsów i mięśnie często się kurczą →tężyczka ( niedobór wapnia zjonizowanego)

• IV czynnik krzepnięcia

• uszczelnianie śródbłonka

• hamowanie reakcji alergicznych

Homeostaza wapnia:

- źródłem wapnia jest wchłanianie w przewodzie pokarmowym i dynamiczny metabolizm kostny

- przebudowa kości jest procesem stałym- kość jest stale tworzona i reabsorbowana

- homeostaza wapnia zależy od trzech systemów (kości, nerki, przewód pokarmowy) i trzech hormonów (parathmormon, kalcytonina, witamina D₃ )

Wapń w osoczu

wapń

dializujący niedializujący

zjonizowany związany związany z białkami

40-50% 5% 30-50%

wapń aktywny (1,1-1,3 mmol/l)

Wpływ zaburzeń równowagi kwasowo-zasadowej na stężenie wapnia zjonizowanego:

• kwasica nasila jonizację wapnia i ↑ stężenia jonów H⁺, które wiążą się z albuminami

utrudniając wiązanie jonów wapnia

• alkaloza hamuje jonizację wapnia i ↓ stężenia jonów H⁺, które uwalniają miejsca wiążące wapń na albuminach. W alkalozie stężenia wapnia zjonizowanego ↓- co wywołuje tężyczkę

• albuminy posiadają ładunek ujemny i wiążą jony wapnia i H⁺

• zaburzenia RKZ zmieniają stężenie wapnia zjonizowanego poprzez zmiany frakcji wapnia związanej z albuminami

Co możemy oznaczać w zakresie gospodarki wapniowo- fosforanowej:

• wapń całkowity w surowicy (4,5-5,5 mEq/l) ← pakiet badań

• wapń zjonizowany w surowicy (1,1-1,3 mmol/l)

• fosforany w surowicy

• 
  
  wapń w moczu wydalanie dobowe 0,6-1,2 g/doba

• fosforany w moczu

• parathormon w surowicy

• kalcytonina w surowicy

• witamina D₃

FOSFORANY 2,5-4,8 mg/dl

Znaczenie kliniczne:

• mineralizacja kości

• główny składnik buforu fosforanowego

• składnik fosfolipidów i białek

• składnik związków wysokoenergetycznych (pn. ATP)

MAGNEZ 0,8-1,0 mmol/l

Znaczenie kliniczne:

• wpływa wraz z wapniem na pobudliwość nerwowo- mięśniową

• jest kofaktorem około 300 enzymów

JON CHLORKOWY 95-108 mmol/l

Znaczenie kliniczne :

• elektroobojętość płynów pozakomórkowych

• produkcja HCL w żołądku

WODOROWĘGLANY → główny składnik (anion) buforu wodorowęglanowego

PIERWIASTKI ŚALDOWE

• żelazo - składnik hemoglobiny i mioglobiny (transport tlenu)

• miedź- niezbędna do aktywności wielu enzymów (ceruloplazmina)

• cynk- składnik karboksypeptydazy

• kobalt- składnik witaminy B₁₂

• jod- składnik hormonów tarczycy

• fluor- składnik zębów i kości

• mangan- w wątrobie i nerkach

ŻELAZO dzienne zapotrzebowanie 20 mg/doba

• 75%- we krwi , 20% -kości i wątroba , -5% mioglobina

Znaczenie kliniczne i diagnostyczne:

• główny składnik hemu

• niedobór prowadzi do niedokrwistości i niedotlenienia

• w surowicy transportowane jest przez transferynę oznaczaną bezpośrednio (360 mg/ml) lub pośrednio jako zdolność wiązania żelaza przez transferyną (TIBC- 360 μg/l). Prawidłowo transferyna jest w około 30%wysycona żelazem (120 μg/l - prawidłowe stężenie żelaza)

• osoczowa ferrytyna jest najlepszym miernikiem zapasów żelaza (norma powyżej 15μg/l)

• osoczowy rozpuszczalny receptor transferyny (sTrR) jest najlepszym miernikiem oceny gospodarki żelazowej

• najnowszym wskaźnikiem gospodarki żelazem jest stężenie hemoglobiny w retikulocytach

MIEDŹ 25μmol /doba wchłanianie 25%

- wątroba 10% -mięśnie , nerki, mózg, serce 70% inne 10% wydalana z moczem

CYNK 150 μmol/doba wchłanianie 30%

• mięśnie 60% kości 30% wydalany z moczem

Absorbcyjna spektrometria atomowa AAS (ASA)

-metoda oznaczania pierwiastków w ilościach śladowych

Zasada działania ASA opiera się na tym że, atomy w stanie gazowym mogą absorbować promieniowanie o ściśle określonej częstotliwości. Poprzez potraktowanie próbki energią cieplną atomizerze, pierwiastek, którego stężenie chcemy oznaczyć przeprowadzany jest w stan wolnych atomów na podstawowym poziomie energetycznym. W wyniku absorpcji określonego kwantu promieniowania atomy są przeprowadzane ze stanu podstawowego do wzbudzonego.

Przejście atomu ze stanu podstawowego do wzbudzonego i ich powrót do stanu podstawowego nazywa się przemianami rezonansowymi. Pomiar intensywności energii emitowany podczas przemian rezonansowych mierzy się w AAS (ASA)

Metoda ta polega na tym, że badaną substancję przeprowadza się w stan gazowy (rozpylając roztwór w płomieniu lub dokonując rozkładu w wysokiej temperaturze np.: w specjalnej kuwecie grafitowej- jest to tzw. bezpłomieniowa metoda) podaje się ją działaniu promieniowania wysyłanego przez lampę z katodą wnękową wykonaną z oznaczanego pierwiastka (metalu)

w widmie promieniowania emitowanego przez tę lampę występują jedynie linie metalu z którego jest zbudowana. Po przejściu promieniowania przez płomień lub kuwetę ulega ono osłabieniu, ponieważ część została zużyta na wzbudzenie atomów metalu znajdującego się w płomieniu w stanie podstawowym. Absorpcja promieniowania jest proporcjonalna do stężenia metalu.

Schemat budowy ASA

źródło promieniowania atomizer monochromator detektor

np.: lampa z katodą np.: palnik

wnękową

gaz palny

gaz nośny rozpylacz rejestrator

próbka

Rodzaje źródeł promieniowania

• źródła emitujące promieniowanie ciągłe- lampa wodorowa, deuterowa

• lampa z katodą wnękową (HCL)- jony gazu szlachetnego bombardują katodę (zbudowaną z analizowanego pierwiastka lub walca aluminiowego pokrytego analizowanym pierwiastkiem). Wybijają z niej atomy analizowanego pierwiastka które następnie ulegają wzbudzeniu na skutek zderzeń z rozpędzonymi jonami. Super HCL -wielokrotnie większe stężenie światła większa monochromatyczność

• lampy wyładowcze- wypełnione metalami i gazami szlachetnymi

• lampa bezelektrodowa (EDL)

Atomizery

• płomieniowe (próbka w areozolu mg/l-ppm, μg/l-ppb) - rozpylacz + komora mieszania (z kulką rozpryskową i/lub przegrodą łopatkową) + palnik. Mała wydajność atomizacji i niestabilność pracy, interferencje fizyczne i chemiczne ( do badania potrzeba 1,5 ml próbki)

• bezpłomieniowe (potrzeb 0,2 ml próbki)

Metoda elektrotermiczna (kuweta grafitowa, bezpłomieniowa)

Etapy:

• suszenie 100-150 ⁰C- temperatura wzrasta stopniowo

• rozkład termiczny (piroliza, spopielanie) temperatura ok. 800-900⁰C

• atomizacja szybki wzrost temperatury powyżej 2500 ⁰Cczyszczenie

• chłodzenie

Suszenie- próbka umieszczana w piecu ogrzewana do jak najwyższej temperatury pozwalającej na całkowite odparowanie rozpuszczalnika. Temperatura zazwyczaj ok. 100-120 ⁰ C. korzystne stosowanie stałego wzrostu temperatury.

Rozkład termiczny- celem jest selektywne odparowanie nieorganicznych i organicznych składników roztworu w jak najwyższej temperaturze, ale w takiej w jakiej nie dochodzi do odparowania analitu.

Chłodzenie- jest to etap polegający na obniżeniu temperatury bezpośrednio przed atomizacją. Proces ten jest korzystny, a jego celem jest wzrost szybkości nagrzewania pieca i zwiększenie czułości sygnału.

Atomizacja- celem jest wytworzenie chmury wolnych atomów oznaczanego pierwiastka, zdolnych do absorpcji promieniowania charakterystycznego. Dobór tempa zależy od właściwości analitu. Czas osiągania maksymalnej temperatury powinien być jak najkrótszy. Temperatura ustalana jest na takim poziomie aby następowała dysocjacja odparowywanych cząsteczek przy możliwie najdłuższym czasie przebywania atomów oznaczanego pierwiastka w kuwecie.

Czyszczenie i chłodzenie- po zakończeniu pomiarów piec wygrzewa się przez kilka seund w wyższych temperaturach przy maksymalnym przepływie gazu obojętnego (argonu), żeby usunąć resztki analitu. Później należy doprowadzić piec do temperatury pokojowej.

Kalibrowanie wskazań spektrometu

• kalibrowanie standardowe (metoda krzywej kalibracyjnej)

- bez dopasowania matrycy ( roztworami kalibracyjnymi prostymi→ pierwiastek mierzony + rozpuszczalnik)

- z dopasowaniem matrycy (roztworami kalibracyjnymi złożonymi→ pierwiastek mierzony+ istotne składniki matrycy + rozpuszczalnik)

• kalibrowanie sposobem wzorców ograniczających- bierzemy pod uwagę jedynie odcinek krzywej kalibracyjnej

• kalibrowanie sposobem dodatków do roztworu próbki ( gdy mamy silny wpływ matrycy)

• kalibrowanie sposobem dodatków i kolejnych rozcieńczeń

Efekty zakłócające

• interferencje fizyczne- różnica we właściwościach fizycznych roztworów mierzonych( lepkość, napięcie powierzchniowe, lotność, temperatura) -wpływ na natężenie przepływu roztworu do rozpylacza , efektywność rozpylania i transportu areozolu do płomienia

• interferencje chemiczne- niecałkowite zatomizowanie lub reakcje w fazie gazowej z innymi atomami, rodnikami i cząsteczkami. W razie obecności interferencji tworzy się związek o innej temperaturze dysocjacji.

• Interferencje jonizacyjne- zachodzące w płomieniu, przechodzenie wolnych atomów w jony. Przy oznaczaniu pierwiastków o niski potencjale jonizacji Na, K, Ca. Przeciwdziałanie: dodanie nadmiaru pierwiastka łatwiej jonizującego np.: cezu.

• Interferencje widmowe- nakładanie się linii analitycznych na linie absorpcyjne innego pierwiastka obecnego w próbce np.: Zn-213 nm, 856 nm, → Fe 213 nm, 859 nm.

Pierwiastki śladowe: wartości prawidłowe

- lit w surowicy - 2,08-9,02 mg/l → metoda płomieniowa

• kobalt w surowicy - 4-7 μg/l → metoda bezpłomieniowa

• kadm- krew pełna - 0,15-2,16 μg/l

• ołów -krew pełna -0-350 μg/l

• miedź w surowicy 0,75-1,5 mg/l

• miedź w moczu 10-60 μg/D

• cynk w surowicy 0,7-1,2 mg/l

• cynk w moczu 300-600 μg/D

• selen w surowicy 70-140 μg/l

• selen w moczu 50-200 μg/D

Osmolalność

• bezpośrednią metodą oceny osmolalności jest pomiar tzw: efektów koligatywnych, czyli efektów wywieranych przez substancje rozpuszczone na własności rozpuszczalnika

Efekty koligatywne związane z rozpuszczeniem w wodzie 1 mola substancji osmotycznie czynnej

• obniżenie temperatury zamarzania o 1,86 ⁰C

• podwyższenie temperatury wrzenia o 0,52 ⁰C

• obniżenie prężności pary rozpuszczalnika o 0,3 mmHG

• wzrost ciśnienia osmotycznego o 17000 mmHg

Metoda krioskopowa

• metoda ta wykorzystuje zależność polegającą na spadku punktu zamarzania roztworu o 1,86 ⁰C w wyniku rozpuszczenia 1 mola substancji na kilogram wody. Próbka po podaniu zostaje przechłodzona do -7⁰C, następnie w wyniku krystalizacji zostaje wydzielone ciepło które powoduje wzrost temperatury i osmometr pokazuje faktyczną temperaturę krzepnięcia badanego roztworu. Przyrząd automatycznie przelicza temperaturę krzepnięcia na wskazania w mOsm/ kg wody.

Ebuloskopia

• metoda ta wykorzystuje zależność polegającą na wzroście temperatury wrzenia roztworu o 0,52⁰C w wyniku rozpuszczenia 1 mola substancji/kg wody. Metoda ta jest nie przydatna w diagnostyce ponieważ:

a) niektóre roztwory w temperaturze bliskiej 100⁰C stają się lotne i niestabilne

b) zależność temperatury wrzenia od ciśnienia atmosferycznego (wzrost ciśnienia o 2 kPa powoduje wzrost temperatury wrzenia o 0,52 ⁰C)

Luka osmotyczna

• >10 mOsm/kg wody- może świadczyć o kwasicy mleczanowej i alkoholowej, kwasicy ketonowej

• luka osmotyczna stale utrzymująca się > 20 mOsm/kg wody występuje u chorych z niewydolnością wielonarządową. Wzrost ten jest proporcjonalny do liczby niewydolnych narządów.

• Do 10 mOsm/kg wody -norma

• podwyższona luka osmotyczna występuje u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (stopień zaawansowania choroby w zasadniczy sposób zależy od wzrostu poziomu drobno i średniocząsteczkowych toksyn mocznicowych : mocznika i kreatyniny.

Prawidłowa osmolalność osocza 275-295 mOsm/kg wody a moczu 50-1200 mOsm/kg wody. Na osmolalność wpływa K, Na, Cl, glukoza, mocznik.

1. osmolalność <250 mOsm/kg wody świadczy o niedoborze Na -hiponatremia

2. osmolalność >350mOsm/kg wody świadczy o hiperglikemii, ↑ stężenia mocznika, obecności etanolu, interakcji wszystkich wymienionych czynników

Równoczesne podwyższenie osmolalności i luki osmotycznej to oznaka odwodnienia.

Badania osmolalności moczu:

• osmolalność moczu warunkowana jest przede wszystkim obecnością mocznika i chlorku sodowego. Badania osmolalności moczu pozwala na wstępną ocenę czynności nerek

• osmolalność <150 mOsm/kg wody- wzmożona diureza wodna

• osmolalność >1000 mOsm/kg wody- może sugerować bezmocz przednerkowy

stosunek osmolalności moczu do osmolalności surowicy pozwala określić parametry funkcji wydzielniczej nerek i ich zdolności koncentracji moczu.

Osmolalność moczu/osmolalność surowicy

0,2-0,7 - moczówka prosta

<3 - niewydolność śródmiąższowa

3-4,7 - zdrowy człowiek na diecie z ograniczoną podażą płynów

Zastosowanie badań osmolalności w medycynie:

a) oddziały OIOM

• przy zatruciach alkoholem - na obecność etanolu w surowicy

• przy poparzeniach- szybka ocena stanu nawodnienia

• śpiączka cukrzycowa

b) diagnostyczne

• ocena osmolalności przy podawaniu diuretyków, ADH, insuliny

• bilans wolnej wody

• ocena hiper i hiponatremii

• różnicowanie przyczyn niewydolności nerek

• moczówka prosta

100. monitorowanie pacjentów

• pooperacyjne - pomiar osmolalności osocza dla określenia równowagi elektrolitów

• przy diurezach

• w chirurgii i kardiologii

• w terapii insulinowej

Elektrolity

Sód - w surowicy 135-137 mEq/l

- w moczu 4,28-4,98 g/D (dobę)

Metody oznaczania:

• ISE- czujnik sodu jest półogniwem współpracującym z zewnętrznym czujnikiem odniesienia i tworzącym z nim kompletne ogniwo elektrochemiczne. Czujnik wyposażony jest w elektrodę chlorosrebrową, zanurzoną w roztworze elektrolitu o stałej zawartości jonów Na⁼ i Cl^-. Membrana jest (szklana kapilarka o specjalnej budowie) wybiórczo przepuszczalna dla jonów Na⁺ i rozdziela roztwór elektrolitu od próbki. Gdy próbka wchodzi w kontakt z membraną czujnika wymiana jonów Na⁺ przez membranę powoduje powstanie potencjału elektrycznego. Potencjał powstaje w poprzek membrany porównywany jest ze stałym potencjałem czujnika odniesienia. Ostatecznie mierzone napięcie jest proporcjonalne do stężenia Na⁺ w próbce.

• Metoda kolorymetryczna- z octanem uracylu i octanem magnezu. Sód jest wytrącany jako octan sodowo- magnezowo- uracylowy. Przy nadmiarze uranu reaguje on z żelazocyjankiem dając zabarwienie, którego absorpcja jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia sodu.

• Metoda enzymatyczna - oznaczanie sodu oparte na aktywacji β-galaktozydazy przez sód. Rezultatem jest enzymatyczna konwersja o-NPG do galaktozy i o-nitrofenolu (λ -405 nm)

• -NPG, Na⁺, β-galaktozydaza → o-nitrofenol + galaktoza

• -nitrofenylogalaktozyd

• fotometria płomieniowa

• ASA (AAS)

Potas w surowicy 3,7-5,3 mEq/l

w moczu 2,5-3,0 g/D

Metody oznaczania:

• ISE- czujnik potasu jest półogniwem współpracującym z zewnętrznym czujnikiem odniesienia i tworzącym z nim kompletne ogniwo elektrochemiczne. Czujnik zawiera elektrodę chlorosrebrową zanurzoną w roztworze elektrolitu o stałej zawartości jonów K⁺. gdy próbka wchodzi w kontakt z membraną zachodzi wymiana jonów potasowych powstaje wtedy potencjał elektryczny. Jest on porównywany ze stałym potencjałem zewnętrznym czujnika odniesienia. Ostatecznie mierzone napięcie jest proporcjonalne do stężenia K⁺ w próbce.

• ASA

• fotometria płomieniowa

• metoda kolorymetryczna- z chlorkiem choliny- potas wytrąc się z surwicy jako azotynokobaltan sodowo-potasowy pod wpływem azotynokobaltanu sodowego. Do przemytego osadu dodaje się chlorekcholiny i w obecności żelazocyjanku sodowego, powstaje zielone zabarwienie.

• Metoda enzymatyczna- oznaczanie stężenia K⁺ bazujące na aktywacji kinazy pirogronianowej przez potas.

Fosfoenolopirogronian + ADP----K⁺, kinaza pirogronianowa→pirogronian + NADH + H⁺ --- dehydrogenaza mleczanowa → mleczan + NAD⁺

• chromo-Cyte- wykorzystuje osiągnięcia w dziedzinie makrocyklicznych jonoforów o selektywnych zdolnościach do wiązania kationów. Jonofor o większym powinowactwie do potasu jest związany ze zdolnym do jonizacji chromoforem. W buforze o stałym pH chromofor jest w formie protonowej i nieprotonowej będących ze sobą w równowadze. Obie formy mają inne spektrum absorpcji. Kompleksowanie K⁺ przez jonofor powoduje zmianę stosunku obu form chromofora a tym samym zmiany absorpcji.

Chlorki w surowicy 95-108 mEq/l

w moczu 2,85-7,109 g/D

Metody oznaczania:

• ISE- elektroda chlorosrebrowa zanurzona w roztworze zewnętrznym ma stałą zawartość chlorków -membrana - pochodna IV rzędowa związku amonowego w polimerowej macierzy

ostateczne mierzone napięcie jest proporcjonalne do stężenia jonów K⁺ w probówce

• ASA

• fotometria płomieniowa

• metoda z rodankiem rtęci

Hg(SCN)₂ + 2Cl^- → HgCl₂ +2SCN^- λ =500nm

3SCN^- + Fe³⁺ → Fe(SCN)₃

czerwone zabarwienie kompleksów, zabarwienie jest proporcjonalne do stężenia chlorków w probówce

• metody enzymatyczne - pomiar oparty na określeniu aktywności α-amylazy zależnej od chlorków.

EDTA-Ca²⁺ + α-amylaza (nieaktywna) -----Cl^- →EDTA + Ca²⁺ + α-amylaza (aktywna)

CNP-β-G₊---Ca²⁺ + α-amylaza (aktywna)

Żelazo w surowicy M 60-160 μg/dl

K 40-140 μg/dl

TIBC 300-400 μg/dl

250-350 μg/dl

UIBC 200-300 μg/dl

150-250 μg/dl

metody oznaczania

• metoda spektrofotometryczna z FERENE- w teście wykorzystywane są środki kwaśne, aby uwodnić jony żelazowe z połączenia z transferyną. Jony żelazowe przekształcają się w żelazawe pod wpływem chlorowodorku hydroksylaminy. Uwodnione jony reagują z …...

• Ferentest- środki kwaśne w obecności guanidyny,Fe³⁺ uwolnione z połączenia FE- transferyna. Witamina C redukuje Fe²⁺ które daje barwny związek z ferenem S.

• metoda z FerroZine - środowisko kwaśne w obecności guanidyny Fe³⁺ redukowane jest za pomocą hydroksylaminy. Fe²⁺ daje barwny kompleks z odczynnikiem FerroZine

• metoda z Nitro-PAPS- środowisko kwaśne, Fe³⁺ redukowane przez hydroksylaminę i tiomocznik. Jony żelaza reagują z Nitro-PAPS tworząc kompleks absorbujący światło.

• Żelazo- chromazurol- jony żelazowe reagują z chromazurolem B i bromkiem acetylotrimetyloamonowym tworząc barwny kompleks.

• Metoda z ferrozyną- żelazo uwalniane z kompleksu w środowisku kwaśnym i redukowane do jonów żelazawych. Jony Fe²⁺ reagują z ferrozyną tworząc fiołkowy kompleks. Absorpcja przy λ- 560 nm, jest proporcjonalna do stężenia żelaza

TIBC- całkowita zdolność wiązania żelaza. Żelazo w surowicy krwi tworzy kompleks z transferyną. Zasada oznaczania TIBC opiera się na dodawaniu do surowicy znanej ilości jonów Fe²⁺ w alkalicznym środowisku. Jony te wiążą się z transferyną w niewysyconych miejscach wiązania. Nadmiar niezwiązanych jonów żelazowych oznaczany jest w reakcji z ferrozyną. Różnica pomiędzy ilością dodanych a niezwiązanych jonów stanowi UIBC.

TIBC (mg/dl)= całkowita zawartość żelaza + UIBC

Wapń całkowity w surowicy 4,5-5,5 mEq/l

w moczu 100-300 mg/D

zjonizowany w surowicy 1,1-1,3 mmol/l

metody oznaczania:

• z Arsenazo III- w roztworze kwaśnym wapń reaguje z Arsenazo III, powstaje barwny niebiesko-purpurowy kompleks. Mierzona absorbancja, jest proporcjonalna do stężenia wapnia w próbce. Λ=660 nm

• z 0-krezyloftaleiną- metoda opiera się na reakcji jonów wapnia z kompleksem o-krezyloftaleiny w środowisku alkalicznym. Powstaje barwny kompleks którego mierzy się absorbancję.

• Z kwasem chloranilowym- jony Ca²⁺ tworzą z kwasem chloranilowym trudno rozpuszczalny osad chloraminian wapnia. Podany EDTA wiąże Ca²⁺, wytrąca się kwas chloraminowy, mierzymy absorbancję.

• ASA

• fotometria płomieniowa

wapń zjonizowany- podczas pomiaru stężenia wapnia zjonizowanego należy mierzyć pH (bo jony H⁺ współzawodniczą z Ca²⁺ o miejsce wiążące wapń →zmiana pH próbki ma bezpośredni wpływ na poziom wapnia)

pH 7,4 → ok 45% wapnia całkowitego występuje w formie zjonizowanej

pH gwałtownie rośnie→ pula wapnia zjonizowanego ↓, obniża się.

Spowodowane jest to tworzeniem kompleksów wapnia z białczanami i innym anionami. Kwasica obniża wiązanie wapnia z albuminami a zwiększa stężenie wapnia zjonizowanego

• ISE- elektroda chlorosrebrowa, membrana- jonofor osadzony w macierzy z PCV

Magnez 0,8-1,0 mmol/l

metody oznaczania:

• z arsenazo- barwnik arsenazo ma wysokie powinowactwo do jonów Mg²⁺. Wartość absorbancji kompleksów arsenazo-magnez jest proporcjonalna do stężenia Mg²⁺. Należy dodać substancji chelatujących- zapobiegają interferencji ze strony Ca²⁺.

• Z kalmagitem- metalochromowy barwnik kalmagit daje z jonami Mg²⁺ czerwony kompleks . Należy dalej dodać EDTA żeby zablokować interferencje Ca²⁺

• fotometria płomieniowa

• ASA

Fosfor w surowicy 2,5-4,8 mg/dl

w moczu 0,6-1,2 g/D

metody oznaczania:

• z molibdenianem amonu- w środowisku kwaśnym jony fosforanu tworzą z molibdenianem amonowym kompleks którego absorbancję się mierzy.

RÓWNOWAGA KWASOWO- ZASADOWA

pH krwi niższe niż 6,8 i wyższe niż 7,8 to śmierć.

7,35-7,45 - wartość prawidłowa

6,8-7,35 - kwasica

7,45-7,8 - zasadowica

7,40 - idealny stan zdrowia

organizm lepiej znosi kwasicę niż alkalozę ( wysiłek fizyczny wprowadza w kwasicę, noworodki po urodzeniu mają kwasicę)

wpływ pH na aktywność enzymów. Enzymy mają wąski zakres pH przy którym są aktywne.

Produkcja wydalanie

H⁺ H⁺

CO₂ CO₂

pH

CO₂- komponent oddechowy ( za jego stężenie odpowiadają płuca)

HCO₃- komponent metaboliczny (za jego stężenie odpowiadają nerki)

produkcja jonów H⁺ kwasy metaboliczne

• produkcja H⁺ dorośli 1 mmol H⁺/ kg m.c/24h

niemowlęta 2 mmol H⁺/kg m.c /24h

• kwasy metaboliczne - siarkowy

- fosforowy

- mlekowy

-β-hydroksymasłowy

- acetooctowy

pH= - log [H⁺]

pH - ocenia różnicę potencjałów na elektrodzie

pH= 0 →1[H⁺] pH=7 → 10^-7 [H⁺]

produkcja dwutlenku węgla (kwas oddechowy)

CO₂ + H₂O H₂CO₃

20 moli CO₂/24h produkowane jest w mitochondriach w cyklu Krebsa (ok. 450 l/24h)

Definicja buforu - roztwór zawierający substancje, które mają zdolność minimalizowania zmian pH wywoływanych dodaniem kwasu lub zasady

• bufor jest roztworem słabego kwasu i jego mocnej soli

HA ↔ H⁺ + A^- H₂CO₃ + NaHCO₃ ← bufor wodorowęglanowy

pH = pK + log [A^-]/[HA^-]

• bufor 2 soli jednego kwasu, ale różniących się stopniem dysocjacji, gdzie jeden …...

bufor fosforanowy NaH₂PO₄ ← jako kwas

Na₂HPO₄← jako zasada

Buforowanie

• nie usuwa jonów H⁺ z organizmu

• jest krótkoterminowym rozwiązaniem problemu nadmiaru jonów H⁺

HCl →H⁺ + Cl^- H⁺ + A^-→ HA

Mechanizmy odpowiedzialne za stałość pH:

• buforowanie zewnątrzkomórkowe

• buforowanie wewnątrzkomórkowe

1. tkankowo niespecyficzne

a) wymiana H⁺ na Na⁺ lub K⁺

b) zmiana torów metabolicznych

2. tkankowo specyficzne

a) erytrocyty

b) płuca

c) nerki

• buforowanie krwi

Bufory krwi:

• 
  
  bufor wodorowęglanowy NaHCO₃/ H₂CO₃ - 53%

• bufor fosforanowy Na₂HPO₄/ NaH₂PO₄ -5% udział buforów w całkowitej

• 
  bufor białczanowy B^-/HB - 7% pojemności buforowej krwi

• 
  bufor hemoglobinowy (erytrocyty) Hb^-/HHb -35%

Równowaga Hendersona- Hasselbalcha

HA↔H⁺ + [A^-] według Bronstada - zasada- akceptor jonów H⁺

kwas- donor jonów H⁺

[H⁺] * [A^-] = K ← stała dysocjacji

HA

[H⁺] = {[HA]/[A^-]} *K pH = - log {K* [HA]/[A^-]} pH= -logK - log {[HA]/[A^-]}

pH = pK - log {[HA]/[A^-]}

pH = pK + log {[A^-]/ [HA]}

bufor wodorowęglanowy NaHCO₃/H₂CO₃

pH=pK + log {[HCO^-₃]/[H₂CO₃]}

pH ~ [HCO^-₃]/ (α * pCO₂) [H₂CO₃]=pCO₂

pH ~ [HCo^-₃] / pCO₂

α= 0,03 ←const.

α- współczynnik do wyliczania stężenia kwasu węglowego

pK H₂CO₃= 6,1 - (-logK) ← const.

Żołądek

erytrocyty anhydraza węglanowa tylko tu powoduje dysocjację H₂CO₃ i tylko tu HCO₃

nerki pochodzi z H₂CO₃

H₂CO₃ =α *pCO₂ 1,2 = 0,03 *40 mmHg

[HCO^-₃] = 24 20:1 → gwarantuje prawidłowe pH krwi

H²CO₃ = 1,2 ↑

zaburzenie tego stosunku= zaburzenie pH

pH _krwi ~ [HCO^-₃]+[Hb^-]+[B^-]+.....+[HPO^2-₄] ←zasady buforujące

α* pCO₂

pH _krwi ~ [BB]/(α*pCO₂) BB=2B= zasady buforujące

Do rozpoznania zaburzeń wystarczy określić r. H-H dla buforu wodorowęglowego

do leczenia bierzemy pod uwagę wszystkie 2B

parametry RKZ:

• pH 7,35-7,45

• pCO₂ (komponenta oddechowa) 35-45 mmHg

• 
  
  tCO₂ 22-28 mmol/l (całkowity) komponenta metaboliczna

• HCO₃ akt. 21-27 mmol/l (aktualne)

• HCO₃ st. 21-25 mmol/l (standardowe)

• NBB 41,7 mmol/l

• BB

• BE/BD = BB- NBB 0 ⁺/_- 2 kompensacja

• CB

tCO₂ = st. CO₂ (2HCO^-₃) + st.CO₂ (2H₂CO₃)

tCO₂= 1,2 + 24= 25,2 (22-28)

HCO^-₃ akt → aktualne stężenie HCO^-₃ w osoczu badanego pacjenta

HCO^-₃ st.→ HCO^-₃ mierzone w standardowych warunkach :

pCO₂= 40 mmHg

pO₂ = 100mmHg

temp = 37⁰C

Zasady buforowe BB

BB plasma(osocze)

BB plasma = (HCO^-₃) + (HPO^2-₄) + (białczanowy^-)

BB blood(krew)

BB blood = (HCO^-₃) + ( HPO^2-₄) + ( białczany^-) + (Hb^-)

NBB- normalne zasady buforowe

NBBp = 41,7mmol/l

NBBb = 47,7 mmol/l + (stęż. Hb^-)

Nadmiar/niedobór zasad (BE)=(BD) BE/BD

BE_b = Bb_b - NBB_b BE - u zdrowego człowieka powinna wynosić 0

Be_p = Bb_p - NBB_p

Be_p = Be_b

CB→ BE po kompensacji własnej organizmu

CB = BE - (pCO₂ - 40)/ 2 BE * 0,3 * waga = mmol NaHCO₃ które trzeba było przetoczyć

(kiedyś)

teraz → CB * 0,3 * waga pacjenta

Interpretacja wyników badań RKZ

pH HCO^-₃ pCO₂ przyczyny:

kwasica metaboliczna dostanie się do organizmu

niewyrównana ↓↓ ↓↓ n kwasów, kw. mlekowego w

częściowo wyrównana ↓ ↓↓ ↓ przemęczeniu , kw. W

wyrównana n ↓↓ ↓↓ przebiegu cukrzycy

kwasica oddechowa

niewyrównana ↓↓ n ↑↑ wysokie stężenie H₂CO₃

częściowo wyrównana ↓ ↑ ↑↑ (zaburzenia wymiany gazowej,

wyrównana n ↑↑ ↑↑ np.: zapalenie płuc)

alkaloza metaboliczna

niewyrównana ↑↑ ↑↑ n wzrost stężenia jonów HCO₃

częściowo wyrównana ↑ ↑↑ ↑

wyrównana n ↑↑ ↑↑

alkaloza oddechowa

niewyrównana ↑↑ n ↓↓ niskie stężenie CO₂,

częściowo wyrównana ↑ ↓ ↓↓ uszkodzenie mózgu, OUN

wyrównana n ↓↓ ↓↓

Okres wyrównania (kompensacji) :

• oddechowa - bardzo szybka, płuca potrzebują kilku minut na rozpoczęcie i dokonanie kompensacji

• metaboliczna, nerkowa - 48-72h na wyrównanie ( sekrecja H⁺ i reabsorpcja HCO₃)

przyczyny:

- kwasicy

a) kłopoty z wydalaniem H⁺

b) nadmierna produkcja H⁺ lub napicie się kwasu

c) utrata HCO^-₃

- alkalozy

a) utrata H⁺ ( np.: z wymiotami)

b) napicie się roztworu alkalicznego

c) niedobór potasu

Kwasica metaboliczna: ↓ pH ~ ↓[HCO^-₃]/pCO₂

• utrata wodorowęglanów przez : przewód pokarmowy, przetoki jelitowe, biegunkę, przez nerki: kwasica kanalikowa- typ 1(dystalny) i typ2 (proksymalny)

• kwasica metaboliczna z prawidłową luką anionową, podwyższonym stężeniem Cl^- - kwasica hiperchloremiczna

• kwasica metaboliczna z podwyższoną luką anionową : wysoka endogenna produkcja kwasów( cukrzyca, kwasica ketonowa), retencja jonów H⁺ (choroby nerek), przedawkowanie niektórych leków, zatrucia

Przyczyny wzrostu luki anionowej w przebiegu kwasicy metabolicznej:

anion przyczyna

kwas β-hydroksymasłowy kwasica ketonowa

kwas acetooctowy hiperglikemia w cukrzycy, upojenie etylenem

fosforany, siarczany mocznica

salicylany zatrucia salicylanami

mleczany kwasica mleczanowa → na skutek wstrząsu, sepsa,

lewokomorowa niewydolność mięśnia sercowego

mrówczany, mleczany zatrucie metanolem

szczawiany, mrówczany, glyoxalaty zatrucie glikolem

Alkaloza metaboliczna ↑pH ~ ↑[HCO^-₃]/pCO₂

• występuje w przypadku nadmiaru wodorowęglanów

• może mieć miejsce gdy istnieje utrata Hcl przez przewód pokarmowy (wymioty)

• utrata H⁺ - wymioty, - zaburzenia hormonalne (hiperaldosteronizm- utrata z moczem), - niedobór potasu (wymiana na jon wodorowy), - leki alkalizujące,

kwasica oddechowa : zaburzenia oddechowe, zaburzenia w pracy serca prowadzą do niewydolności serca, zapalenie płuc

alkaloza oddechowa: oddech histeryczny, histeryczny płacz u dzieci, wzrost ciśnienia śródczaszkowego, uszkodzenia mózgu, mechaniczna hiperwentylacja

Kwasica oddechowa ↓pH ~ [HCO^-₃]/↑pCO₂

• hiperwentylacja manifestuje się ↑pCO₂ we krwi:

• choroby centralnego układu nerwowego

• leki sedatywne

• odma opłucnowa

• choroby płuc (zapalenie płuc)

• choroby serca (niewydolność)

• choroby mięśni ( myastemia gravis, Polio)

Alkaloza oddechowa ↑pH~ [HCO^-₃]/ ↓pCO₂

• hiperwentylacja (histeryczna, mechaniczna, hipertermia) , zaburzenia zazwyczaj ostre z brakiem kompensacji nerkowej

Mieszane zaburzenia RKZ

pH-7,23 pCO₂ - 47mmHg ↓↓ pH ~ ↓BE/↑ pCO₂ ← kwasica metaboliczna i oddechowa

BE - 8 mmol/l (cukrzyk z kwasicą metaboliczną i zapaleniem płuc- kwasica oddechowa)

pH- 7,46 pCO₂- 30mmHg ↑↑ pH~ ↑BE/↓pCO₂ ← alkaloza metaboliczna i oddechowa

BE + 10 mmol/l

Laboratoryjna ocena zaburzeń RKZ

• parametry podstawowe:

pH, pCO_2, HCO^-₃, BB, BE

• badania komplementarne:

krew: pO₂, HbO₂, SO₂

surowica: Na, K, Cl, LA

mocz: pH, NH⁺₄, kwaśność miareczkowa

• badania dodatkowe:

inne: mleczany, glukoza, mocznik

badania: określające wyd. oddechową (gazometria) i badania określające funkcję nerek (np.: kreatynina)

krew pobierana anerobowo

• strzykawka lub kapilara bez pęcherzyków powietrza

• strzykawka lub kapilara po pobraniu dostarczana do laboratorium w 30 minut (inaczej może uciec CO₂ →↑pH)

Materiał użyty do gazometrii i RKZ

gazometria → pomiar ciśnień parcjalnych gazów pCO₂, i pO₂

RKZ → pomiar pH i pCO₂

• pCO₂ i pO₂ mierzone we krwi tętniczej (gazometria)

• pH i pCO₂ mogą być mierzone we krwi żylnej (rkz)

• krew pobierana na heparynę litową (5-10 u/ml)

Krew kapilarną można użyć na gazometrię arterializowaną (podgrzać) gdy nakłucie tętnicy jest niemożliwa

pobieranie krwi kapilarnej:

• arterializować gorącym wacikiem ok. 3 minuty

• nie wyciskać krwi

• na końce kapilar po pobraniu założyć gumowe korki

• materiał wysłać natychmiast do badania

• badanie wykonywać natychmiast po otrzymaniu krwi (krew kapilarna 15-30 minut, tętnicza do 1 godziny)

• odnotować temperaturę pacjenta ( w tym czasie może powstać kwas mlekowy →↑ pH)

Rola nerek:

nerki mogą:

I. wydalać jon H⁺ →¹ wydalają jako kwaśność miareczkową jako fosforany

↓

mocz miareczkuję się środkiem alkalizującym do pH

krwi. Ilość środka zużytego przelicza się na zawartość

jonów H⁺ wydalanych z fosforanami.

→² jon H⁺ łączy się z amoniakiem tworząc NH⁺₄ (jon amonowy) i są razem wydalane

wyd. [H⁺]nerki = (kw. Miareczkowa + NH⁺₄) - [HCO^-₃] wydalane przez nerki

II. Wchłanianie zwrotne HCO^-₃

produkowanie HCO^-₃ z H₂CO₃ (dzięki anhydrazie węglowej)

zatrzymywanie HCO^-₃

Zmiana pH moczu jest szybkim i prostym wskaźnikiem zaburzeń RKZ

pH 4,6-8,0

wydalanie H⁺ 30-80 mmol/24h

NH⁺₄ 30-50 mmol/24h

kwaśność miareczkowa 10-30 mmol/24h

HCO^-₃ < 1 mmol/ 24h

POTENCJOMETRIA

metody potencjometryczne wykorzystują zależność między stężeniem oznaczanego jonu w roztworze i potencjałem elektrycznym odpowiedniej elektrody.

Wykonuje się pomiar siły elektromotorycznej SEM ogniwa którego, jednym półogniwem jest elektroda wskaźnikowa, a drugim elektroda porównawcza (której potencjał ma wartość stałą)

potencjał elektrody ze wzoru Nernsta

E=E_o +(RT/nF)* ln(f*c)

E_o - potencjał wzorcowy

n- liczna elektronów związanych z reakcją

F - stała Faradaya

T - temperatura absolutna

c - stężenie jonu

f - współczynnik aktywności

R- stała gazowa

Rodzaje elektrod

Podział ze względu na mechanizm działania:

• elektrody I rodzaju = elektrody odwracalne w stosunku do kationu, składające się z metalu lub gazu w równowadze z roztworem zawierającym jony tego metalu np.: elektroda wodorowa

• elektrody II rodzaju = elektrody odwracalne w stosunku do anionu tworzącego z metalem elektrody trudno rozpuszczalny związek np.: elektrody kalomelowe, chlorosrebrowe.

• Elektrody III rodzaju = elektrody te tworzą metale w równowadze z roztworem nasyconym dwoma trudno rozpuszczalnymi elektrolitami o tym samym anionie. Kation jednego z elektrolitów jest kationem metalu elektrody, drugi kation znajduje się w roztworze w nadmiarze.

• Elektrody utleniająco-redukujące = w elektrodach tych obojętny chemicznie metal (Pt, Au) jest zanurzony w roztworze zawierającym substancje zarówno w formie utlenionej i zredukowanej.

Osobną grupę stanowią elektrody jonoselektywne (ISE) zwane membranowymi. Wspólną ich cechą jest to że:

• elektrodowo czynną częścią elektrody jest membrana

• różnica potencjałów na granicy faz membrana/roztwór spowodowana jest reakcją wymiany jonowej między jonami roztworu i jonami z membrany.

Elektrody wskaźnikowe : są to takie półogniwa , których pH zależy od stężenia oznaczanego jonu. Jako elektrody wskaźnikowe używane są: elektrody I,II,II rodzaju, elektrody jonoselektywne i utleniająco-redukujące.

Potencjał elektrody pomiarowej zależy od:

• aktywności jonu głównego

• selektywności elektrody

Elektrody porównawcze: kalomelowa i chlorosrebrowa

Czujnik pH jest zbudowany w oparciu o technologię ISE. Jest półogniwem tworzącym pełne ogniwo elektrochemiczne, po połączeniu z zewnętrznym czujnikiem odniesienia. Zbudowana z elektrody chlorosrebrowej zanurzonej w roztworze buforu. Szklana membrana swoista dla jonów chlorowych oddziela próbkę od roztworu. Gdy próbka kontaktuje się z membraną > powstaje potencjał membrany wynikający z przepływu jonów wodorowych przez membranę. Wewnętrzna elektroda chlorosrebrowa przewodzi napięcie do woltomierza, gdzie jest ono porównywane ze stałym napięciem z czujnika odniesienia. Mierzone napięcie odzwierciedla stężenie jonów wodorowych >pH

Czujnik pO₂ pełne ogniwo, wykorzystuję amperometrię. Czujnik złożony z platynowej katody i srebrnej anody, roztworu elektrolitu oraz membrany przepuszczalnej dla gazu. Między katodą a anodą utrzymuje się stałe napięcie tzw. napięcie polaryzujące. Rozpuszczony tlen z próbki przechodzi do roztworu elektrolitu i ulega redukcji na katodzie

O₂ + 2H₂O + 4e^- → 4OH^-

obwód zamyka się na anodzie, gdzie utlenia się srebro

4Ag → 4Ag⁺ + 4e^-

Ilość zredukowanego tlenu jest proporcjonalna do liczby elektronów uwolnionych przy katodzie. Pomiar zmian natężenia prądu (przepływ elektronów) między anodą a katodą pozwala określić ilość tlenu w roztworze elektrolitu.

Czujnik pCO₂ jest pełnym ogniwem, składającym się z elektrody pomiarowej i wewnętrznej elektrody odniesienia. Elektroda pomiarowa → elektroda pH zanurzona w roztworze chlorowo-dwuwęglanowym. Membrana przepuszczalna dla gazowego CO₂ oddziela roztwór od próbki. Wewnętrzna elektroda odniesienia składa się z elektrody chlorosrebrowej zanurzonej w roztworze chlorowo-dwuwęglanowym, zapewnia stały potencjał. Gdy próbka dochodzi do membrany, CO₂ dyfunduje do roztworu chlorowo-dwuwęglanowego, co powoduje zmianę aktywności jonu H⁺.

CO₂ + H₂O → HCO₃ + H⁺

wewnętrzna elektroda pH wykrywa zmiany stężenia wodoru zachodzące w roztworze chlorowo-dwuwęglanowym i generuje potencjał półogniwa. Potencjał ten porównany ze stałym potencjałem elektrody odniesienia daje wynik zmiany pH w roztworze. Zmiana pH zależy od logarytmu ciśnienia parcjalnego CO₂.

RKZ

pH krwi tętniczej 7,37-7,43

pH krwi kapilarnej 7,36-7,42

pH krwi żylnej 7,32-7,38

wartość graniczna 6,8-7,8

pCO₂ krew tętnicza 36-44 mmHg pO₂ krew tętnicza 74-108 mmHg

krew kapilarna 35-45 krew kapilarna 65-95

krew żylna 42-50 krew żylna ok. 40

Parametry wyliczane :

→ stężenie wodorowęglanów (HCO^-₃)

+aktualne - obliczone bezpośrednio ze zmierzonej ilości pH i pCO₂ , wyliczone z równania H-H

krew tętnicza 22-26 mmol/l

krew kapilarna 24-27 mmol/l

krew żylna 23-27 mmol/l

+ standardowe- obliczone dla krwi całkowicie utlenowanej, dla której pCO₂ = 40 mmHg 21-25 mmol/l

→ stężenie całkowite CO₂ (ctCO₂) - suma stężeń w surowicy rozpuszczonego CO₂ oraz HCO₃

→ niedobór zasad (BE)- pozwala określić ilość kwasu lub zasady koniecznej do zmiareczkowania 1 litra krwi o pH 7,4 -BE> niedobór zasad , +BE> nadmiar zasadniczy

niedobór określamy:

BE(ecf) - niedobór zasad w płynie pozakomórkowym

BE (B) - niedobór zasad we krwi

→ saturacja( wysycenie) hemoglobiny tlenem (sO₂) - stosunek ilości Hb związanej z tlenem do całkowitej ilości hemoglobiny zdolnej do związania O₂. Saturacja Hb tlenem, wraz z zawartością tlenu i pojemnością tlenową jest parametrem......

sO₂ = (100*FO₂Hb)/(FO₂Hb + FHHb) F- frakcja

→ zawartość tlenu- całkowite stężenie tlenu przenoszone przez krew z uwzględnieniem tlenu związanego z hemoglobiną i rozpuszczonego w surowicy i płynie komórkowym erytrocytów.

→ zawartość tlenu w hemoglobinie (ctO₂Hb) - objętość tlenu rzeczywiście związana z hemoglobiną

→ tlenowa pojemność hemoglobiny (BO₂) - najwyższa ilość tlenu jaką może przenieść hemoglobina zawarta w danej ilości krwi

→ p50- wartość ciśnienia połowiczej saturacji hemoglobiny tlenem- oznacza parcjalne ciśnienie tlenu w momencie, gdy wysyca on 50% dostępnej hemoglobiny.

BO wskazuje na położenie na krzywej dysocjacji hemoglobiny

przy spadku wartości p50- krzywa przesunięta w lewo- wzrost powinowactwa Hb do tlenu

przy wzroście wartości p50- krzywa przesunięta w prawo - spadek powinowactwa Hb do tlenu

Wartość p50 może wskazywać na obecność nieprawidłowych hemoglobin, wpływających na mechanizm transportu tlenu. Jest użyteczna jako pośredni miernik 2,3 DPG. Świadczy o zmianach pH, temperatury, CO₂.

Oksymetria

pochodne hemoglobiny mają charakterystyczne spektra absorpcji, każda pochodna w różnym stopniu absorbuje światło

1. całkowita hemoglobina(tHb) → suma wszystkich oznaczanych frakcji hemoglobiny. Oznaczanie tHb ważne jest dla oszacowania transportu tlenu oraz dla oceny niedokrwistości. Zakres 12-18g/dl tHb = FO₂Hb + FHb + FMetHb + FCOHb

2. oksyhemoglobina (O₂Hb) → frakcja hemoglobiny, która dostarcza tlen do tkanek. Oksyhemoglonina jest odwracalnie wiązana z tlenem. Zakres 94-97% we krwi tętniczej.

FO₂Hb= cO₂Hb/ctHb *100

3. deoksyhemoglobina (Hhb) → frakcja hemoglobiny zdolna do wiązania tlenu. Zakres 0-5%.

FHHb = cHHb/ctHb*100

4. methemoglobina (MetHb) → frakcja hemoglobiny niezdolna do wiązania telnu. Atom żelaza z +2 utleniany jest na +3 stopień. Wzrost stężenia → hipoksemia i sinica, obecność MetHb spowodowana przez zaburzenia wrodzone, azotany, azotyny, barwniki anilinowe, benzokainę. Zakres 0-1,5 %

FmetHb = cCHb/ctHb *100

5. karboksyhemoglobina → hemoglobina związana z CO. Powinowactwo hemoglobiny do CO jest ponad 200 krotnie wyższe niż do tlenu. Zakres 0-1,5% . wzrost stężenia → hipoksja, sinica, zgon

FCOHb = cCOHb /ctHb *100

6. sulfhemoglobina (sulfHb) → hemoglobina połączona z siarką, niezdolna do wiązania tlenu. Zakres 0-1,5%. występuje u osób przyjmujących leki z siarką lub przy infekcjach.

Technologia pomiaru CO-oksymetru:

światło emitowane przez lampę wolframowo-halogenową przechodzi przez szereg soczewek i filtrów, a następnie jest transmitowany kablem światłowodowym. Po wyjściu z światłowodu światło przechodzi do zespołu głowicy optycznej, skąd kierowany jest do próbki. Po przejści przez prónkę światło dostaje się do polichromatora, który rozdziela wynik pomiaru próbki na składowe długości fali. Polichromator mierzy stężenie światła przy różnych długściach fali i konwertuje sygnał elektryczny na wartość cyfrową.

ROLA ERYTROCYTÓW

240 ml O₂ /min → jest dostarczana tkankom

200 ml CO₂ /min → jest produkowana

Wysycenie Hb tlenem (efekt Bora) zależy od:

- pH

- pCO₂

- 2,3-DPG → 2,3 difosfoglicerynian powstaje

tylko w erytrocytach w glikolizie, decyduje

o łączeniu Hb z tlenem. Wiąże się z Hb zamiast

tlenu. Najwięcej DPG wiąże się z Hb u ludzi

mieszkających na poziomie morza. Jest

kompensacją w przypadku kwasicy lub zasadowicy

kwasica hamuję glikolizę, a zasadowica ją nasila.

Kwasica → krzywa saturacji w prawo

zasadowica → krzywa saturacji w lewo

w zasadowicy potrzeba mniejszego ciśnienia

parcjalnego tlenu do wysycenia hemoglobiny

pO₂ - 65-95 mmHg

sO₂% - (HbO₂.....) - 92-96%

kwasica hamuje glikolizę → spada poziom 2,3-DPG (→ ta część wiązania Hb, która była związana)

a DPG może związać się z tlenem. Krzywa saturacji Hb nie jest tak mocno przesunięta w prawo (efekt kompensujący 2,3-DPG).

W zasadowicy na odwrót.

pH

w zakresie przemiany węglowodanwej:

- zasadowica

aktywuje glikolizę beztlenową

hamuje glukoneogenezę

zwalnia cykl Krebsa

hamuje transport elektronów w łańcuchu oddechowym

hamuje cykl pentozowy

- kwasica

hamuje glikolizę

aktywuje glukoneogenezę

aktywuje cykl Krebsa

aktywuje cykl pentozowy

przemiana białkowa

-kwasica

wzmożony katabolizm białek

amonogeneza ( dla eliminacji jonów H⁺)

przemiana tłuszczowa

lipolityczny efekt kwasicy

mobilizacja kwasów tłuszczowych z adipocytów i ich wzrost w surowicy

wzrost produktów niecałkowitego spalania kwasów tłuszczowych ( kwas β- Hydroksymasłowy, kwas octowy, aceton)

Gazometria

wskaźniki tlenowe

• pO₂ - ciśnienie parcjalne tlenu we krwi, ok 100mmHg (13,3 kPa)

• sO₂ - wysycenie(saturacja) Hb tlenem = (cHbO₂/ceHb)*100%, ceHb (stężenie Hb efektywnej) ctHb [1-(fr.COHb +fr.MetHb)]

• p50 O₂ - ciśnienie tlenu w którym 50% Hb jest wysycone tlenem

• pojemność tlenowa Hb = 1,34 ml O₂/1gHb

• vO₂ - zawartość tlenu we krwi = O₂ związane z Hb i O₂ rozpuszczonym w osoczu

• stężenie 2,3-DPG= 2,3- difosfoglicerynianu

• ładowanie krwi tlenem (Fsh)

Fsh = ctO₂(cB) - ctO₂(aB)/ctO₂(aB) - ct O₂(vB)

aB - krew tętnicza

cB - krew włośniczkowa

vB - krew żylna mieszana

ctO₂ - stężenie tlenu

• transport tlenu

strumień tlenu = ilość tlenu transportowanego przez krew w ciągu 1 min.

strumień tlenu = ctO₂ *CO

ctO₂ = ceHb *cO₂ + pO₂ * αO₂

ceHb - stężenie Hb efektywnej

αO₂ - współczynnik rozpuszczalności = 0,003

CO - pojemność minutowa serca (5l/min )

• ładowanie tlenem tkanek

- ciśnienie ekstrakcyjne tlenu (Px) → jest to ciśnienie cząsteczkowe tlenu potrzebne do ekstrahowania 2,3 mmol/l tlenu przez tkanki przy prawidłowym metabolizmie oraz prawidłowej pojemności minutowej serca (5l/min), wartość średnia = 5 kPa (38 mmHg)

- stężenie ekstrakcyjne tlenu (Cx) → jest to ilość tlenu dostępna do ekstrakcji z 1litra krwi przy ciśnieniu 5kPa czyli bliskiemu ciśnieniu cząsteczkowemu tlenu we krwi żylnej mieszanej. Wartość kobiety: 1,8 mmol/l mężczyźni: 2,6 mmol/l

- wskaźnik kompensacji tlenowej (Qx) → jest to stopień zwiększenia objętości minutowej serca konieczny do utrzymania prawidłowego ciśnienia cząsteczkowego tlenu we krwi żylnej mieszanej (5kPa). Stanowi on liczbę przez którą trzeba pomnożyć Cx aby uzyskać wartość prawidłową = 2,3 mmol/l Qx = 2,3/Cx

Białka osocza

funkcje białek:

• transport

• odporność humoralna

• ciśnienie onkotyczne

• enzymy

• aktywność antyproteolityczna

• funkcja odżywcza

Albuminy → powstają w hepatocytach w wątrobie ( stosowanie leków anabolicznych nasila powstawanie białek w wątrobie)

Globuliny γ₂ → powstają w plazmocytach pod wpływem antygenu (czynniki immunodepresyjne hamują syntezę globulin)

Onkoreceptory → rejestrują i kontrolują stężenie białek

w stanie zapalnym najpierw wzrasta stężenie Igα₂ i Igα₁, jeśli mamy stan przewlekły → β i γ

Proteinogram

albuminy 60-70%

α₁ globuliny 2-4%

α₂ globuliny 4-7%

β globuliny 8-13%

γ globuliny 9-22%

Całkowite stężenie białek w osoczu 60-80 g/l

Białka specyficzne

• albuminy → ciśnienie onkotyczne (80%)

• α₁- antytrypsyna → inhibitor proteaz

• β₂-mikroglobulina → podjednostka układu HLA (urwany receptor z powierzchni komórek)

• ceruloplazmina → białko wiążące miedź i enzymy

• białko C-reaktywne (CRP) → wskaźnik stanu zapalnego

• ferrytyna → białko wiążące żelazo w tkankach

• transferyna → białko transportujące żelazo

• haptoglobina → białko wiążące hemoglobinę

• SHBG → globulina wiążąca hormony płciowe → wiąże testosteron

• TBG → globulina wiążąca hormony tarczycy

• transkobalamina → wiąże witaminę B₁₂

immunoglobuliny

wzory molekularne rysunek

typ I (κ) typ II (λ) stężenie g/l

IgG γ₂ κ₂ γ₂ λ₂ 14,0

IgM μ₂ κ₂ 1,5

IgA α₂ κ₂ 3,5

IgD δ₂ κ₂ 0,03

IgE ε₂ κ₂ śladowe

IgG → odpowiada za wtórną odpowiedz immunologiczną (po 1-2 miesiącach)

IgM → odpowiada za pierwotną szybką odpowiedz immunologiczną

IgA → przewlekłe stany zapalne wraz z IgG ( np.: marskość wątroby)

Paraproteiny

• immunoglobuliny produkowane przez pojedynczy klon komórek limfatycznych → limfocytów B (np.: plazmocyty)

• zazwyczaj występują w obrębie globulin γ

• paraproteiny pojawiają się najczęściej w przebiegu szpiczaka mnogiego, plazocytomy i choroby Waldernströma (makroglobulinemia - IgM)

• elektroforeza białek osocza jest podstawą badań wykrywających paraproteiny, jednak i w tym wypadku trzeba badać mocz

• w przebiegu szpiczaka wydzielany jest nadmiar łańcuchów lekkich, które są wykrywane w moczu jako białka Bence - Jonesa

• paraproteiny w elektroforezie ujawniają się w regionie γ

• paraproteiny w szpiczaku: IgG 55%

IgA 22%

IgG 1,5%

Zmiany w szpiczaku :

↑mocznika

↑ kreatyniny

↑ β₂ mikroglobuliny

↑ stężenia wapnia

↑ OB

objawy anemii

↓ produkcji normalnych immunoglobuliny

białko Bence - Jonesa w moczu

IgG < 20g/l ← łagodna paraproteinemia ← związana

IgA < 10g/l ← bez anemii i reszty zmian

Podział zaburzeń ilościowych i jakościowych w białkach krwi:

A. zaburzenia uwarunkowane genetycznie:

• analbuminemia ( brak albumin), bisalbuminemia (zdwojenie albumin)

• wrodzony brak α₁- antytrypsyny ( u ludzi z rozedmą płuc)

• A- haptoglobulinemia

• A-β- lipoproteinemia

• A- ceruloplazminemia (prowadzi do choroby Willsona - odkładania się miedzi szczególnie w mózgu → przeszczep wątroby lub śmierć)

• A- gammaglobulinemie (osoby są podatne na zakażenia)

a) dotycząca wszystkich trzech frakcji γ

b) α-gamma_1A-globulinemia

c) agammaglobulinemia gamma 1A i 1M

• A-fibrynogemia

• hipergammaglobulinemia

B. Czynniki powodujące hipoproteinemię lub obniżenie poziomu jednej frakcji:

• niedostateczny dowóz białek pokarmowych

• zaburzenia wchłaniania białek z przewodu pokarmowego

• utrata białek z ustroju:

1. z moczem

2. przez przewód pokarmowy (np.: przetoki)

3. z krwotokami

4. do płynów przesiękowych i wysiękowych

• wzmożony katabolizm białek (choroby nowotworowe)

• uszkodzenie narządów wytwarzających białka :

1. wątroby (albuminy)

2. układu limforetikularnego (globuliny)

100. Czynniki powodujące hiperproteinemię lub zwyżkę jednej frakcji białek:

• zjawiska odpornościowe w przebiegu zapaleń bakteryjnych, wirusowych, alergicznych lub jałowych odczynów po zniszczeniu tkanek czynnikiem fizycznym lub chemicznym

• nowotworowy rozrost komórek syntetyzujących globuliny

1. szpiczak mnogi i jego objawy

2. choroba Waldenströema

3. tzw. paraproteinemie objawowe

dysproteinemia- jednoczesny spadek jednej frakcji, przy wzroście innych

D gammapatie - gdy któraś frakcja zaburzenia aminokwasowe

Białka ostrej fazy: (leżą w obrębie α i β globulin, syntetyzowane przez wątrobę, wydzielanie kontrolowane przez mediatory stanu zapalnego → IL 1,2,6, TNF)

• silnie reagujące:

1. PCT - prokalcytonina

2. CRP - białko C-reaktywne ( norma 5mg/l, najważniejsze białko, wiąże polisacharyd C otoczki pneumokoków), biochemiczny marker sepsy

• słabo reagujące: (nie są stosowane w diagnostyce stanu zapalnego)

1. kwaśna α₁-glikoproteina

2. α₁- antytrypsyna

3. ceruloplazmina

4. haptoglobina

5. składnik C3 dopełniacza

6. fibrynogen

7. ferrytyna

• negatywnie reagujące ( ich stężenie spada w ostrym stanie zapalnym)

1. transferyna

2. albumina

CRP - stosuje się do wykrywania miażdżycy metodą ultraczułą → hsCRP

norma → 5mg/l < 1mg/l - niskie ryzyko zawału

1-3 mg/l - średnie ryzyko zawału

> 5mg/l - wysokie ryzyko zawału

PCT - prohormon kalcytoniny (produkowany przez tarczycę, a w stanach zapalnych w przewodzie pokarmowym, biochemiczny marker sepsy

Klasyfikacja stanów zapalnych:

• bakteriemie (fungiremie, wiremie)

• SIRS - zespół układowej reakcji zapalnej

• sepsa (posocznica) - SIRS z dodatnim posiewem krwi lub dowodem zakażenia określonego narządu

• wstrząs septyczny - sepsa z objawami wstrząsu

• MODS - zespół niewydolności wielonarządowej

Markery zawału mięśnia sercowego:

markery prognostyczne :

• hs-CRP - wysokoczułe białko C-reaktywne

• MPO - mieloperoksydaza

• SCD-UOL - rozpuszczalny ligand antygenu CD-40

• lp-PLA₂ - fosfataza A₂ związana z lipoproteinami

markery do stabilizacji blaszki miażdżycowej:

• PAPR-A -ciążowe białko osoczowe A

markery niedokrwienia:

• IMA (ACB) - albumina modyfikowana niedokrwieniem (związanie kobaltu przez albuminy)

markery martwicy komórkowej

• mioglobina (niespecyficzny) 1,5-2 h po zawale

• H-FABP - sercowe białko wiążące kwasy tłuszczowe (w teorii) po 1,5 h po zawale, 50% zawałowców ma podwyższone stężenie po godzinie do dwóch

• CK-MB mass (pomiar ilości enzymu a nie aktywnego

• troponiny sercowe ← absolutny wskaźnik zawału!

* cTnT

*cTnI

markery niewydolności serca:

• peptyd natiuretyczny

* ANP - przedsionkowy (typA)

* BNP -mózgowy (typ B)

* NT - pro BNP

Troponiny (max po 24 h, rośnie bardzo szybko i utrzymuje się do 5 dni)

• sercowa troponina T - masa 37 tys; łączy troponinę z tropomiozyną

• sercowa troponina I - reguluje powinowactwo wapnia do troponiny C , masa 17700

• troponina C - masa 18 tys, receptor wapnia

zmiany stężenia markerów

	mioglobina	CK-MB mass	cTnI	cTnT
początek	3,3h	4h	4,5h	5h
max	6h	14h	19h	18h
powrót	20h	87h (4dni)	168h (7 dni)	172h (7 dni)

Peptydy natiuretyczne → są antagonistami układu RAA, wytwarzane przez uszkodzone serce zmniejszając objętość łożyska naczyniowego, mierniki niewydolności serca

• ANP - przedsionkowy (typA)

• BNP - komorowy (typB)

• CNP - naczyniowy (typC)

• NT- pro BNP - N-terminalny komorowy peptyd natiuretyczny (BNP =proBNP -N-pro BNP)

NT-proBNP jest uwalniany w ilościach równomolarnych do BNP. Z powodu jego dłuższego okresu półtrwania stężenie w osoczu jest wyższe i bardziej stabilne niż BNP

Białka używane do diagnostyki chorób wątroby

• albuminy → przewlekłe choroby wątroby ↓ stężenia

• γ-globulina → marskość wątroby, choroby autoimmunologiczne ↑ stężenia

• α₁- antytrypsyna → marskość wątroby ↓stężenia

• ceruloplazmina → choroba Willsona ↓ stężenia

• α-fetoproteina → pierwotne raki wątroby ↑↑ → marker nowotworowy

• transferyna → hemochromatoza ↑ stężenia

• ferrytyna → hemochromatozy ↑ stężenia

Markery filtracji kłębuszkowej (nerkowej)

• β₂ - mikroglobulina - niskocząsteczkowe białko (11,8 kDa) obecne w błonie komórkowej prawie wszystkich komórek jądrzastych (też limfocytów). Jest ona małą podjednostką antygenu zgodności tkankowej HLA. Nerka jest głównym miejscem eliminacji, gdzie filtrowana jest w kłębuszkach nerkowych i w 99,9% reabsorbowana w kanalikach proksymalnych. Nie nadaje się w przypadku białaczek (gdyż jest ich markerem).

• Cystatyna C - kationowy polipeptyd (13 kDa). Ponieważ podlega stałej i równomiernej produkcji i ulega całkowitej filtracji w kłębuszkach nerkowych. Cystatyna C jest endogennym markerem filtracji (GFR) lepszym niż β₂M (β₂-mikroglobulina) i kreatynina

• NGAL

• SHBG - oznaczanie jest potrzebne w przypadku konieczności wyjaśnienia niskiego lub wysokiego stężenia testosteronu gdy wolny (biologicznie aktywny) testosteron jest w normie- globulina wiąże hormony steroidowe

Transport (metabolizm) żelaza

• całkowite wysycenie transferyny żelazem TIBC

• transferyna 360 mg/100ml

• transferyna desjalowana (CDT)

• ferrytyna - białko wiążące żelazo zapasowe (w makrofagach) ↓stężenia 15μg/l →

• rozpuszczalny receptor transferyny (sTfR) -

Ferrytyna - ↓15 μg/l → niedobór żelaza (białko wiążące)

Transferyna i ferrytyna należą również do białek ostrej fazy. W stanach zapalnych poziom transferyny ↓↑ a ferrytyny ↓↑

sTfR - występuje na linii erytroblastycznej nie podlega rytmowi stanu zapalnego. ↑ stężenia sTfR-erytroblasty nie mają żelaza

CDT - normalan transferyna 4-6 kwasów sjalowych

, gdy mniej lub pozbawiona kwasu sjalowego, gdy wątroba uszkodzona alkoholem etylowym

B₁₂ -kobalamina

• rozpuszczalna w wodzie

• obecna tylko w produktach zwierzęcych

• organizm ma zapasy na 5 lat

• zapotrzebowanie dzienne ok. 3mg

• potrzebna jest do prawidłowej erytropoezy

Ocena niedoboru:

• oznaczenie stężenia witaminy w surowicy

• stężenie całkowite B₁₂ nie odpowiada aktualnemu biologicznemu stanowi witaminy B₁₂

• stężenie witaminy nie jest wystarczająco skorelowane z objawami klinicznymi

• szeroka „szara strefa” pomiędzy zakresem wartości prawidłowych i obniżonych

• kliniczne objawy niedoboru mogą wystąpić przy prawidłowym stężeniu całkowitym B₁₂

Przyczyny niedoboru:

• niedobory w diecie

• głodzenie

• zaburzone wchłanianie

1. choroby przewodu pokarmowego i ich leczenie

2. podłoże autoimmunologiczne

3. leki

4. bezkwasowość

Transport (metabolizm ) witaminy B₁₂ - kobalamina

• witamina B₁₂ - kobalamina (całkowita) w osoczu

• TC - transkobalamina (TC i TCII) w osoczu wiążą witaminę B₁₂

• HC - haptokoryna w osoczu wiąże 80% wit. B₁₂ która jest metabolicznie nieaktywna (brak receptora komórkowego)

• Holo-TC - holotranskobalamina (TCII) wiąże 20% kobalaminy (aktywną B₁₂) w osoczu- biodostępna przez specyficzne receptory komórkowe (transkobalamina wiążąca B₁₂)

• Holo-TC - wczesny marker niedoboru wit. B₁₂

156 pmol/l - wartość odcięcia dla wit. B₁₂

35 pmol/l - wartość odcięcia dla aktywnej wit. B₁₂

niedobór: 2% populacji

25% bezobjawowe

objawy hematologiczne

objawy neurologiczne (wcześniejsze ale nie rozpoznawane)

hiperhomocysteinemia

EULAR

przeciwciała anty-CCP- cykliczny peptyd cytrulinowy, u każdego pacjenta zgłaszającego się do reumatologa z RZS wykonuje się badania

RF i anty-CCP (wyższa czułość niż RF)

w czasie procesu zapalnego następuje cytrulizacja białek błony maziowej. Białka cytrulinowane odkładają się w błonie maziowej stawów i są przyczyną autoimmunizacji.

Miano anty-CCP - rodzina autoprzeciwciał przeciwko białkom zawierającym cytrulinę

inne nazwy:

• APF

• AKA anty-CCP o lata wyprzedzają objawy RZS

• AFA

Ograniczenia RF:

• RF dodatni u 80% pacjentów z RZS; u 10-15% osób zdrowych

• RF obecny w przebiegu innych chorób

• ujemny RF nie wyklucza RZS (wczesne stadium choroby, reemisja)

• niska swoistość

• czułość i swoistość RF ~ 80%

• czułość i swoistość anty-CCP ~ 99,9%

Metabolizm kostny

choroby kości : krzywica

ostomalacja (rozmiękanie kości)

osteoporoza (rzeszotnienie kości0

nowotwory kości (pierwotne i przerzutowe)

choroba Paget`a

Diagnostyka gospodarki wapniowo-fosforanowej

• wapń w surowicy

• wapń zjonizowany w osoczu

• fosforany w surowicy

• wydalanie wapnia z moczem (24)

• wydalanie fosforanów z moczem

• PTH (parathormon) w surowicy

• kalcytonina w surowicy

• witamina D₃ (kalcytriol) (1,25 - dihydroksycholekalcyferol) w surowicy

wpływ na metabolizm kostny → hormony tarczycy, hormon wzrostu, androgeny, estrogeny, glukokortykosteroidy

Markery tworzenia kości:

• fosfataza alkaliczna (ALP)

• izoenzym kostny fsfatazy alkalicznej (b-ALP)

• osteokalcyna (OC) = białko kostne (BGP)

• C-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (P1CP)

• N-końcowy propeptyd prokolagenu typu I (P1NP)

kolagen 95% substancji organicznej kości, decyduje o strukturze i kształcie kości

substancje nieorganiczne: hydroksyapatyt - uwodniony fosforan wapnia

• brak androgenów i estrogenów → stymuluje osteoblasty, powodują niekontrolowany wzrost

Markery resorpcji kości:

• fosfataza kwaśna winianooporna (TRACP)

• pirydynolina PYD

• deoksypirydynolina DPD

• N-końcowy telopeptyd kolagenu typu I (NTX)

• C-końcowy telopeptyd kolagenu typu I (CTX / ICT)

• makrofagowy czynnik wzrostu (M-CSF)

(osteoklast)

Czynniki odpowiedzialne za aktywację osteoklastów:

• sRANKL - rozpuszczalny ligand RANK lub OPG aktywnych osteoklastów

• osteoprotegeryna (OPG) - inhibitor aktywnych osteoklastów

• kalcytonina - inhibitor aktywnych osteoklastów

Białka osocza

Metabolizm białek osocza

2 grupy:

• białka syntetyzowane w wątrobie (75%) - albuminy (spadek ciśnienia onkotycznego= wzrost syntezy albumin)

• immunoglobuliny - syntetyzowane w limfocytach w wyniku ich aktywacji przez antygeny

• niewielka ilość białka syntetyzowana w : jelicie → lipoproteiny

jelito + szpik → transferyna gruczoły dokrewne → hormony

Synteza łańcucha białka w rybosomach wątrobowych trwa 1-2 minuty

↓

obróbka potranslacyjna (proteoliza, dołączanie części lipidowych i glikozylowanych)→ 20-40min

↓

transport przez błonę plazmatyczną 20-40 min

Ani wątroba ani inne narządy w prawidłowych warunkach nie gromadzą białek osocza. Cała ich pula znajduje się w przestrzeniach pozakomórkowych, ewentualne straty uzupełniane są na bieżąco.

Czasy półtrwania:

• białka układu krzepnięcia → kilka godzin

• albuminy → 14 dni

• immunoglobuliny → nawet 24 dni

Degradacja białek:

1. glikoproteiny → wątroba

2. albuminy → skóra

3. białka o dużej masie cząsteczkowej → komórki śródbłonka

część białek osocza (5g/doba) przesącza się do przewodu pokarmowego i ulega strawieniu. Endogenne białka soków trawiennych i złuszczone nabłonki są z powrotem wchłaniane do krążenia wrotnego.

Przesączają się również przez śródbłonek kłębuszków nerkowych do moczu pierwotnego (5g/doba). 99% z nich zostaje zreabsorbowanych i rozłożonych w komórkach kanalików nerkowych.

20-80 mg białka wydalanego/doba

30 mg → albuminy/ doba

Dystrybucja białek

pula białek osocza → 600 g w przestrzeni pozakomórkowej

-40% w naczyniach (60-80 g/l)

-60% przestrzeń pozanaczyniowa ( stężenie niższe niż w osoczu)

Wartości prawidłowe:

• stężenie białka całkowitego 60-80 g/l, zależy od równowagi między syntezą i degradacją dwóch głównych frakcji. Ciśnienie hydrostatyczne krwi determinuje dystrybucja wody między przestrzenią wewnątrz i zewnątrznaczyniową

• zmiana pozycji z leżącej na stojącą ( po 30 minutach wzrost o 10 %)

• zaciśnięcie stazy przez kilka minut ( ucieczka wody do przestrzeni pozanaczyniowej

Hipoproteinemia:

• zahamowanie syntezy białek w wątrobie (marskość, nowotwory)

• zahamowanie syntezy immunoglobulin (wrodzony, nabyty niedobór)

• zwiększona utrata białek osocza (nerki, przewód pokarmowy, krwawienia, oparzenia)

• rozcieńczenie przez nadmiar i/lub zmiany dystrybucji wody pozakomórkowej i artefaktów

Artefakty w oznaczaniu białka całkowitego:

- staza

- infuzja płynów niezawierających białka

- nawodnienie pacjenta

Krytyczny poziom białka całkowitego < 45g/l

albumin , 20 G/L

przy takich stężeniach ciśnienie onkotyczne jest niskie

↓

ucieczka wody poza naczynia

↓

obrzęki i przesieki do jam ciała

↓

hipowolemia (za mało płynów w naczyniach)

Hiperproteinemia

- jest spowodowana nadprodukcją immunoglobulin

- nie są znane fizjologiczne lub patologiczne przyczyny prawdziwej hiperalbuminemii (odwodnienie, artefakty - długie utrzymywanie stazy podczas pobierania krwi, pobieranie krwi z żyły przez którą podano preparat białkowy)

elektroforeza białek surowicy (proteinogram)

- rozdział białek w polu elektrycznym na różnego typu podłożach

- bufor elektroforetyczny ma pH zasadowe (barbituranowy, w tych warunkach większość białek jest anionami wędrującymi do anody)

- IgG pozostają w miejscu lub wędrują do katody

- używany jest żel agarozowy

5 podstawowych frakcji:

1. frakcja albuminowa

2. frakcja α₁ globulin

3. frakcja α₂ globulin

4. frakcja β globulin

5. frakcja γ globulin

Proteinogram.

Każda frakcja elektroforetyczna zawiera liczne białka indywidualne. Jednakże zmiany obrazu elektroforetycznego w patologiach mogą powstać jedynie w wyniku zmian stężenia tych białek, których normy stężeń są odpowiednio wysokie

albuminy → frakcja jednorodna

α₁ → α₁-antytrypsyna

α₁- kwaśna glikoproteina

α₁- lipoproteina (HDL)

α₂ → α₂- makroglobulina

haptoglobulina

zaczyna się IgA

β → β-lipoproteina (LDL)

transferyna

frakcja C3 dopełniacza

zaczyna się IgG, IgM

γ → Ig klasy A, G, M

ostre stany zapalne ↑ α₁

↑ α₂

↓ albuminy ( ujemne białko ostrej fazy)

↓ transferyna (z frakcji β )

przewlekłe stany zapalne

↑ α₁ ↑α₂ ↑ β ↑γ ↓ albuminy

wzrost stężenia immunoglobulin jest równoważny ze zmniejszeniem syntezy białek wątroby

Choroby nerek

1. zapalne = białka ostrej fazy (odmiedniczkowe zapalenie nerek) jak ostry stan zapalny

2. zmiany w kłębuszkach (kłębuszkowe zapalenie nerek) jak zespół nerczycowy, ↓α₁ a potem Ig, ↑α₂

Zespół nerczycowy

- utrata białek o masie cząsteczkowej < 100 tys (albuminy, transferyna, potem Ig)

- nagromadzenie α₂-makroglobulin i β-lipoprotein

- we frakcji β - ↑ lipoprotein maskowany ↓ poziomu transferyna

- zakażenia

- zaburzenia lipidowe

Marskość wątroby

- nadprodukcja Ig G i A powoduje wzrost γ z charakterystycznym zlaniem (MOST) między frakcją β i γ

- lipoalbuminemia

- niedobór α₁-antytrypsyny

Anemia hemolityczna

Przewlekła lub ostra hemoliza (najczęściej typu autoimmunizacyjnego) powoduje : ↓ frakcji α₂ wskutek zużycia haptoglobiny

Niedobór żelaza

↑ stężenia transferyny → izolowane podwyższenie frakcji β

Gammapatie monoklonalne

jeden rodzaj cząsteczek Ig jest produkowany przez patologiczny klon limfocytów B lub plazmocytów. Następstwem tego jest obecność w proteinogramie ostro odgraniczonego pasma zwanego gradientem M. Lokalizuje się w obrębie frakcji : α₂, β, γ

Identyfikacja klasy przeciwciał monoklonalnych jest możliwa za pomocą immunofiksacji

Gammapatie poliklonalne

Nadprodukcja wszystkich klas Ig. Dużo klonów limfocytów B które produkują wiele klas immunoglobulin

Szpiczak mnogi

makroglobulinemia Waldenstrema (produkcja IgM)

choroba z dużą ilością lekkich lub ciężkich łańcuchów immunoglobulin

immunofiksacja

- na żelu agarozowym

- robimy zwykły proteinogram

nakładamy przeciwciała skierowane przeciwko łańcuchom ciężkim, lekkim - musi dojść do reakcji antygenu z przeciwciałem na linii prążka γ

- dalej robimy ilościowe oznaczenie stężenia

Mocz:

- poranna porcja moczu

- najpierw oznaczamy czy białko w ogóle w moczu jest

- dalej badamy jak surowicę, tylko bez IgM (są pentamerami, w moczu nie będzie)

- jeśli nerki są sprawne: łańcuchy κ (białka Bence-Jonesa)

uszkodzone : Łańcuch ciężkie i lekkie

We frakcji γ nie powinno być ostrych pików, powinna być łagodna górka:

- jeśli 1 pik → 1 białko monoklonalne

- jeśli 2 piki → 2 białka monoklonalne

- służy do identyfikacji klasy immunoglobuliny

- różnicuje gammapatie poli - monoklonalne

Niedobór α₁-antytrypsyny → choroba dziedziczna, brak piku w α₁

Enzymatologia kliniczna

wszystko na kartkach

WYKŁAD 7 X 2009

Lipidy

metabolizm lipidów

Podział lipidów ze względu na rozmieszczenie

-tłuszcze zawarte we krwi

-tłuszcz stanowiący strukturalną część tkanek

-tłuszcz rezerwowy (zapasowy)

zespół metaboliczny- jego przyczyna jest tłuszcz brzuszny, jest szkodliwy → powoduje zapalenia (produkcja substancji zapalnych unieczynniających insulinę, łaknienie, miażdżyca). Do diagnozy służy obwód brzucha

żołądek → dyspresja tłuszczu pokarmowego (faza stała) → trzustka → NaHCO₃, lipaza z watroby → cholesterol, kwasy żółciowe → trawienie TG → DG → MG → lipaza odczepia kwasy tłuszczowe (mydła) → emulsja (jelita) faza olejowa → micele (kwasy żółciowe, fosfolipidy, mydła, cholesterol, dwu i monoglicerydy ← lipoliza w przewodzie pokarmowym

rysunek

Lipidy pierwszy raz rozdzielono przez ultrawirowanie …............ do ułożenia się w warstwy. Najnizej chylomikrony, dalej frakcja LDL, VLDL, HDL

frakcja VLDL w elektroforezie przesuwa się przed VLD ??????????????????????

elektroforeza ultrawirowanie

chylomikrony LDL → VLDL ← zamiana

LDL VLDL

IDL LDL

VLDL HDL

HDL

Lipidy

	chylomikrony	VLDL	IDL	LDL	HDL
triglicerydy	90,00%	65,00%	30,00%	10,00%	5,00%
cholesterol	5,00%	20,00%	35,00%	50,00%	15,00%
fosfolipidy	4,00%	10,00%	20,00%	20,00%	25,00%
proteiny	1,00%	5,00%	15,00%	20,00%	50-55%
apoproteiny	C,B-48, E,A	B-100, E,C	B-100, E	B-100	A, E, C

Skład białkowo-	chylomikrony	VLDL	LDL	HDL
lipidowy	TG 86-90%	TG 50%	TG 10%	TG 2-5%

Apolipoproteiny

			% w/w białka cząstki
APO-LP	Masa molowa	Stężenie w osoczu (mg/dl)	CHM				VLDL	funkcja
A I	28300	100-150	33	--		65	62	Aktywator enzymu LCAT
AII	17400	30-50	--	--	--	10	25	Białko strukturalne HDL
A IV	446000	20	14	--	--	?	?	Aktywator LPL, LCAT, zwrotny transport cholesterolu
B-100	550000	80-100	--	25	95	--	--	Białko wiązane z receptorem B/E
B-48	260000	?	5	--	--	--	--	Białko strukturalne chylomikronów
C-I	6500	60	--	--	--	--	--	Aktywator LCAT
C-II	8800	3-8	32	55	2	13	5	Aktywator LPL
C-III	8900	8-15	--	--	--	--	--	Inhibitor LPL
D	20000	1	--	15	--	2	4	Udział w katabolizmie zmodyfikowanych lipoprotein
E	34100	3-5	10	5	3	4	5	Wiązanie z receptorem B/E i LRP, transport cholesterolu i aktywacja enzymów

receptor	Wyłapuje	Występuje
LDL receptor (apo-100)	IDL, LDL	Większość komórek
Apo-E receptor	Chylomikrony, remnantyVLDL	Tylko w wątrobie
MSR-receptor	Utlenione LDL	Na makrofagach
HDL- receptor	HDL	W wątrobie (komórki produkujące steroidy)

Enzymy metabolizmu lipoprotein:

-acetylotransferaza lecytyny-cholesterol (LCAT) syntetyzowana w wątrobie, estryfikuje cholesterol na powierzchni HDL

-lipaza lipoproteinowa - enzym zewnątrzkomórkowy związany z śródbłonkiem naczyniowym

-lipaza wątrobowa- enzym wewnątrzkomórkowy

-lipaza trzustkowa- enzym przewodu pokarmowego

Bialko CETP - białko transportujące cholesterol zestryfikowany. Ułatwia transport TG do HDL i CHE do VLDL (CHE- cholesterol)

cykl egzogenny → dotyczy HDL

cykl endogenny → dotyczy LDL, przechodzące w IDL i dalej VLDL

Działanie HDL:
-zwrotny transport cholesterolu z tkanek do wątroby

Patologia lipidów:

hiperproteinemia : klasyfikacja:

-typ I → chylomikrony w elektroforezie ( same, bez innych frakcji)

-typII → dużo LDL (typIIa) TYPIIb - dużo LDL i VLDL

-typIII → szeroka frakcja β-IDL -dużo LDL

-typIV → dużo we frakcji VLDL

-typ V → chylomikrony i frakcja VLDL

typy I-V według Fredrichsona

	I	IIa	IIb	III	IV	V
surowica	śmietankowa	przejżysta	przejżysto-mętna	przejżysto-mętna	mętna-mleczna	Mleczna-śmietankowa
cholesterol	N/↑		↑↑	↑↑	N/↑	↑
Tłuszcze obojętne TG	↑↑	normalne	↑	↑↑	↑↑	↑↑
Lipoproteiny LP	chylomikrony	β- LP	Β-LP i pre-β-LP	LP nietypowe	pre-β-LP	Chylomikrony i pre-β-LP
Wiek ujawniania	dzieci	młodzież	młodzież	Dorośli	dorośli	dorośli
Czynnik ryzyka miażdżycy	mały	mały	duży	duży	duży	mały-podwyższony

Cholesterol - czynnik ryzyka miażdżycy

N/↑ → norma lub lekko podwyższony

↑ → lekko podwyższony

↑↑ → podwyższony

rysunek

wykład 14X 2009

metabolizm lipidów część II

hipercholesterolemia rodzinna → defekt genu dla receptora LDL

dysbetalipoproteinemia typu III

-genetyczny defekt w usówaniu remnantów

-otyłość, miażdżyca

wtórne hyperlipoproteinemie

	TG	HDL	LDL
otyłość	↑	↓	N	↑ syntezy TG w wątrobie, oporne na insulinę
alkoholizm	↑	↑	N	↑ syntezy TG w wątrobie, działanie przeciwmiażdżycowe
cukrzyca	↑↑	N/↓	N/↑	↑ syntezy TG
Niedoczynność tarczycy	N/↑	N	↑↑	Obniżona funkcja receptora LDL
Zespoły nerkowe	↑↑	↓	↑↑	Nadmierna produkcja β-100
Przewlekła niewydolność nerek	↑	↓	N/↑	Spadek aktywności lipazy lipoproteinowej
ciąża	↑	↑	N/↑	Wzrost estrogenów

↑- wzrost

↓-spadek

N - norma

pierwotna hipobetaproteinemia

-wrodzony, genetyczny, homo- lub heterozygotyczny defekt Apo-β-100

-cholesterol i LDL-cholesterol - stężenia obniżone

-TG i HDL-cholesterol - w normie

Pierwotna abetalipoproteinemia

-abetalipoproteinemia - bardzo rzadka, autosomalna, występująca wada genetyczna polegająca na niedoborze MTP (mikrosomalne białko transportowe TG)

-brak chylomikronów, LDL i VLDL, obniżone stężenie HDL, niskie stężenie cholesterolu, brak trójglicerydów

-chroniczna biegunka, kłopoty z wchłanianiem tłuszczy,

-problemy z chodzeniem, ataksje, problemy z utrzymaniem prawidłowej temperatury ciała, problemy z mięśniami, słabość

-anemia, problemy z krzepnięciem, akantocytoza

-ślepota nocna, katarakta

Pierwotna aalfalipoproteinemia

-choroba Tangierska -brak frakcji HDL

wtórne hipolipoproteinemie → towarzyszą

-nadczynności tarczycy

-zaburzenie wchłaniania pokarmów

-niewydolność wątroby

-nowotwory

Diagnostyka miażdżycy:

-TG → triglicerydy

-Ch → cholesterol całkowity

-HDL-Ch → HDL - cholesterol (frakcja HDL)

-LDL-Ch → LDL-cholesterol (frakcja LDL)
-Apo-A → apolipoproteina A-I (frakcja HDL)

-Apo-B → apolipoproteina B (frakcja LDL)

-Lp(α) → lipoproteina (α)

-β VLDL → lipoproteina beta VLDL

-LpX → lipoproteina X

-Hc → homocysteina

Cholesterol całkowitym

(wartość pożądana w ocenie ryzyka wystąpienia miażdżycy)

-ryzyko niski < 200 mg/dl (5,16 mmol/l)

-ryzyko umiarkowane = 200-250 mg/dl (5,16-6,45 mmol/l)

-ryzyko wysokie > 250 mg/dl (6,45 mmol/l)

Triglicerydy

-niskie ryzyko < 200 mg/dl (2,28 mmol/l)

-ryzyko umiarkowane =200-400 mg/dl (2,28-4,56 mmol/l)

-wysokie ryzyko >400 mg/dl (4,56 mmol/l)

Cholesterol HDL

-ryzyko niskie

kobiety >65 mg/dl (1,67 mmol/l)

mężczyźni > 55 mg/dl (1,42 mmol/l)

-ryzyko umiarkowane

kobiety 45-65 mg/dl (1,17-1,67 mmol/l)

mężczyźni 35-55 mg/dl (0,91-1,42 mmol/l)

-ryzyko wysokie

kobieta <45 mg/dl (1,17 mmol/l)

mężczyzna < 35 mg/dl (0,91 mmol/l)

Zasada ogólna → nie mniej niż 20% cholesterolu całkowitego!!

Cholesterol LDL

jeśli już mamy chorobę niedokrwienną serca <100 mg/dl (2,59 mmol/l)

jeśli mamy dwa czynniki ryzyka <130 mg/dl (3,37 mmol/l)

ryzyko umiarkowane 130-160 mg/dl (3,37-4,14 mmol/l)

ryzyko wysokie >160 mg/dl (4,14 mmol/l)

Czynniki ryzyka : papierosy, nadciśnienie, wiek (mężczyźni >45 r.ż, kobiety >55 r.ż), wysokie trójglicerydy, cukrzyca, otyłość, wywiad rodzinny (zawały)

Apolipoproteina A-I

-ryzyko niskie >115 mg/dl

-ryzyko umiarkowane 90-115 mg/dl

-ryzyko wysokie <90 mg/dl

Apolipoproteina β

-ryzyko niskie >115 mg/dl

-ryzyko umiarkowane 115-135 mg/dl

-ryzyko wysokie > 135 mg/dl

Lipoproteina (a)

-występuje na granicy LDL i HDL

-odrębna antygenowo od HDL i LDL

-zawiera apo-β-100 i apo-a, budowa zbliżona do plazminogenu

-jest czynnikiem wysokiego ryzyka zagrożenia miażdżycą

Lipoproteina β-VLDL

-gęstość frakcji VLDL

-elektroforetycznie frakcja beta

-kumulowana przez makrofagi przekształcające się w komórki piankowate

-wskaźnik ryzyka zagrożenia miażdzycą

Lipoproteina X

-zawiera wolny cholesterol i lecytynę

-charakterystyczna dla cholestazy

Homocysteina

-produkt rozpadu metioniny, uwalniana do osocza

-przemiana powrotna do metioniny odbywa się przez remetylację w której koenzymami są witamina B12 i kwas foliowy

-wysoki poziom homocysteiny zależy od poziomu( niedoboru) witaminy B12 i kwasu foliowego

-poziom prawidłowy <16 μmol/l

-wysoki poziom homocysteiny uszkadza tętnice zapoczątkowując procesy zapalne i rozwój zmian miażdżycowych

Pobieranie krwi

-na EDTA - plazma

-na skrzep

w 4°C próbka wytrzymuje 4 dni - nie można mrozić

Oznaczanie

-jeśli na cholesterol to bez różnicy czy przed czy po posiłku (chociaż dobrze przed)

-na TG bezwzględny zakaz jedzenia ok.14 godzin przed pobraniem

Wykład 21 X 2009

Metody oznaczania parametrów lipidowych

Zasady pobierania materiału do badań:

-większość analiz lipidów wykonujemy w surowicy, rzadziej w osoczu, gdyż w czasie wykrzepiania może się zmieniać stosunek ilościowy cholesterolu wolnego do cholesterolu estryfikowanego???????

-aby uzyskać osocze do badań lipidowych najlepiej pobrać krew na heparynę lub EDTA

-do pobierania krwi nie należy stosować szkła silikowanego, gdyż olej silikonowy rozpuszcza się w wielu rozpuszczalnikach lipidowych i może przechodzić do probówki

-nie należy pobierać krwi na szczawiany i cytrynian ponieważ odciągają wodę z erytrocytów obniżają poziom cholesterolu poprzez rozcieńczenie próbki.

-pożądane jest wirowanie w wirówce chłodzącej gdyż ciepło wydzielające się podczas wirowania podnosi temperaturę próbki aktywując niektóre enzymy np.: lipazę

-osocze lub surowica do analizy cholesterolu, trójglicerydów, FL można przechowywać w lodówce do 3 dni

-do badań elektroforetycznych konieczne jest stosowanie tylko surowica najlepiej świeża lub maksymalnie przechowywana w lodówce do 5 dni

-w temperaturze lodówki reakcje enzymatyczne są spowolnione

-mrożenie osocza powoduje denaturację białek dlatego też próbki nie nadają się do rozdziału elektroforetycznego lipoprotein

-szkło stosowane do analiz lipidowych musi być dokładnie odtłuszczone- zwykle wystarczy użyć detergentu i moczyć w rozcieńczonej chromiance a następnie dokładnie opłukać wodą.

Przygotowanie pacjenta:

-wymagana jest standaryzowana dieta izokaloryczna przez tydzień przed badaniem

-na czczo, 8-24 godziny, średnio 12 po ostatnim posiłku

-w każdej sytuacji wątpliwej (złego przygotowania pacjenta do badania) badania lipidowe należy powtórzyć odpowiednio instruując o tym pacjenta

Czynniki przeanalityczne wpływające na poziom lipidów

-dłuższy uciska na żyłę (staza) powoduje wzrost cholesterolu i TG

-palenie papierosów, picie alkoholu (przed pobraniem krwi) powoduje wzrost cholesterolu i TG

-aktywność fizyczna (zwłaszcza bezpośrednio przed badaniem) zmniejsza poziom cholesterolu i TG

-dieta bogata w węglowodany powoduje wzrost TG

-dieta niskotłuszczowa obniża poziom TG, w mniejszym stopniu cholesterolu

-leki → witamina D powoduje wzrost cholesterolu i TG

→ diuretyki, witamina C powodują spadek cholesterolu i TG

Najłatwiej zafałszować wynik badania TG ponieważ ich parametry zmieniają się nawet o 100% (po posiłku np.)

cholesterol w wyniku złego ????????

W diagnostyce zaburzeń gospodarki lipidowej można oznaczać stężenie całych lipoprotein (bardzo rzadko) lub też składników lipoprotein (najczęściej) np.: cholesterol całkowity, TG, HDL, LDL, niektóre apolipoproteiny

Metody badań lipoprotein

→ metody jakościowe lub półilościowe

-rozdział elektrforetyczny, najlepiej na żelu poliakrylamidowym, gdyż możliwa jest nawet identyfikacja HDL 2 i HDL 3

→ metody ilościowe

-ultrawirowanie (metoda referencyjna)

-metody precypitacyjne

Ultrawirowanie

-metoda referencyjna do badań lipoprotein

-metoda oparta na zasadzie separacji lipoprotein w zależności od ich różnicy gęstości (także masy) poddanych działaniu siły odśrodkowej w poruszającym się z bardzo dużą prędkością rotorze

-zakres prędkości 40-90 *10³

-rozdział dokonywany jest w specjalnych urządzeniach zwanych ultrawirówkami ( koniecznie muszą mieć układ chłodzący)

Najlepsza metoda do badania całych lipoprotein

-rozdział w metodzie ultrawirowania dokonywany jest ponadto z dodatkiem niektórych jonów np.: Kbr co ułatwia dalszą izolację otrzymanych frakcji lipoprotein

-metoda ta jest bardzo czasochłonna (czas rozdziału od kilkunastu do kilkudziesięciu godzin) nie nadaje się do badań rutynowych

-wysoki koszt ultrawirówki

Frakcje uzyskane metodą ultrawirowania

CHM -gęstość względna <0,98 g/ml

VLDL 0,98-1,006 g/ml

LDL -1,063

LDL na LDL1 (1,019) i LDL2 (1,055) - 18 godzin (czas rozdziału)

HDL na HDL2 (1,25) i HDL3 (1,210) - czas rozdziału 24 h

Metody precypitacyjne w diagnostyce

-polianiony, detergenty, obojętne polimery wraz z dwuwartościowymi kationami tworzą z lipoproteinami nierozpuszczalne kompleksy wytrącane z surowicy

-precypitacja zależy od natury anionów i kationów, stężenie odczynnika, pH roztworu, siły jonowej

-poprzez właściwy dobór warunków osiągamy selektywne strącanie klas np.: wytrącanie VLDL i IDL przez heparynę i jony manganu (MnCl₂ ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????/////)

W praktyce metody te w diagnostyce lipoprotein wykorzystywane są łącznie z ultrawirowaniem ( wzrost swoistości oznaczenia)

-częściej wykorzystywane są do oceny stężeń składowych lipoprotein ( jako etap pośredni) np.: cholesterolu w HDL lub w LDL

Podział badanych parametrów:

1.badania podstawowe (profil lipidowy):

-cholesterol całkowity

-triglicerydy

-HDL-cholesterol (metoda bezpośrednia)

-LDL-cholesterol (metoda bezpośredni) ← zawartość cholesterolu we frakcji LDL

2.badania diagnostyczno-różnicujące:

-profil lipidowy (powtórzony)

-elektroforeza lipoprotein (lipidogram) z ustaleniem typu hyperlipoproteinemii

-apolipoproteina A

-apolipoproteina B

-apolipoproteina E

-lipoproteina α -Lp(α)

W przypadku otrzymania prawidłowych wartości parametrów profilu lipidoweg (granica niskiego ryzyka miażdżycy) -kończymy nadania

W przypadku uzyskania patologicznych wartości parametrów (w granicach wysokiego lub umiarkowanego ryzyka miażdżycy) wykonujemy badania diagnostyczno-różnicujące.

Tor diagnostycznych badań lipidowych:

-profil lipidowych-parametry profilu lipidowego powinny być zlecane jako wszystkie jednoczesnie

-niewskazane jest postępowanie oszczędnościowe

-przy stwierdzeniu wzrostu profilu kolejnym etapem jest lipidogram

-należy pamiętać o zmianach wyników po posiłku

-po wykonaniu lipidogramu i ustaleniu typu hiperlipoproteinemi - konieczna jest dalsza diagnoza i oznaczanie stężeń:

*apolipoprotein : Apo A, ApoB, Apo E

*lipoprotein (α) Lp (α)

*innych apolipoprotein np.: apoCII w diagnostyce wrodzonej hiperlipoproteinemii typu I (bardzo rzadko), lub całych lipoprotein np.: metodą ultrawirowania (wykonywana najrzadziej) - w specjalnych ośrodkach

trójglicerydy jako składnik lipoproteina

-CHM → 90% chylomkirony egzogenne

-VLDL → 65% chylomikrony endogenne

-LDL → 10%

-HDL → 2%

metody oznaczania trójglicerydów:

1.metoda Carlsona

a)ekstrakcja lipidów w probówce Hagedorna za pomocą metanolu, chloroformu i roztworu NaCl

b)absorpcja FL w kwasie krzemowym (FL-fosfolipidy ????)

c)hydroliza TG za pomocą etanolowego roztworu KOH

d)oznaczanie glicerolu za pomocą kwasu chromotropowego

2.kolorymetryczna metoda F, Gallatti

a)ekstrakcja eterem izopropylenowym

b)absorpcja FL na kwasie krzemowym

c)hydroliza TG za pomocą etanolowego roztworu KOH

d)utlenienie gliceryny do formaldehydu za pomocą H₃PO₄ i KJO₄

e)oznaczanie formaldehydu za pomocą K₃Fe/CN/₆

Współcześnie postuluje się używanie do oznaczania TG tylko metod enzymatycznych

1.metoda enzymatyczna firmy Boehringer Manntein Gm,bH /zestaw Peridochrom/

-TG + 3H₂O - - - esteraza, lipaza - - - glicerol + 3KT (KT kwasy tłuszczowe)

-glicerol + NAD⁺ - - - dehydrogenaza glicerolowa - - - dihydrksyaceton + NADH + H⁺

-NADH + MTT - - - diaforeza - - - formazon + NAD⁺

MTT → wysokocząsteczkowy akceptor wodoru, barwnik monotetrazolowy

2.metoda eznymatyczno-kolorymatryczna BioMerieux

-TG - - - lipaza - - - glicerol + KT

-glicerol + ATP - - - glicerokinaza - - - glicero-3-fosforan + ATP

-glicerolo-3-fosforan + O₂ - - - oksydaza glicerolo-3-fosforanowa - - - fosforan dihydroksyacetonu + H₂O₂

-2H₂O₂ + P-chlorofenol + 4-aminoantypiryna (AAP) - - - peroksydaza - - - chinonoimina + 4 H₂O

3.metoda enzymatyczna firmy Technikon

-TG + H₂O - - - lipaza lipoproteinowa - - - glicerol + KT

-glicerol + O₂ - - - oksydaza glicerolowa - - - gliceroaldehyd + H₂O₂

-4-AAP + P-chlorofenol + H₂O₂ - - - peroksydaza - - - chinonoimina (kompleks o czerwonej barwie) + 4H₂O

4.metoda spektrofotometryczna Corming

-TG + 3H₂O - - - lipaza - - - glicerol + 3KT

-glicerol + ATP - - - glicerokinaza - - - glicero-1-fosforan + ADP

-ADP + fosfoenolopirogronian - - - kinaza pirogronianowa - - - pirogronian + ATP

-pirogronian + NADH + H⁺ - - - LDH - - - mleczan + NAD⁺

-odczyt spektrofotometryczny przy 340 nm

5.metoda enzymatyczno-kolorymatryczna Corming

-TG - - - lipaza - - - glicerol + KT

-glicerol + ATP - - - glicerokinaza - - - glicero-1-fosforan + ADP

-glicero-1-fosforan + NAD⁺ - - - dehydrogenaza glicero-1-fosforanowa - - - fosforan dihydroksyacetonu + NADH + H⁺

-NADH + INT - - - diaforeza - - - formazon + ADP + NAD⁺

INT → wysokocząsteczkowy akceptor wodoru

Interpretacja oznaczeń TG

*stężenie TG (w USA)

<200mg/dl - prawidłowe

200-400mg/dl - łagodna hipertriglicerydemia

>400 mg/dl - hipertriglicerydemia

Stężenie (wg Europejskiego Towarzystwa Miażdżycowego)

<200mg/dl - niskie ryzyko miażdżycy

200-400 mg/dl - umiarkowane ryzyko miażdżycy

> 400mg/dl - wysokie ryzyko miażdżycy

TG mg/dl *0,014 = mmol/l

<2,28 mmol/l - niskie ryzyko miażdżycy

2,28-4,56 mmol/l umiarkowane ryzyko miażdżycy

>4,56 mmol/l - wysokie ryzyko miażdżycy

TG a miażdżyca

-TG pośrednio nasilają powstawanie i narastanie zmian miażdżycowych

-przy wysokim stężeniu TG trwającym dłuższy okres obniża się poziom HDL (mechanizm nie znany)

Cholesterol jako składnik lipoprotein

LDL → 45-50%

HDL → 18%

VLDL → 13%

CHM → 5%

Transport cholesterolu przez krew

LDL - 60%

HDL - 30%

VLDL - 10%

Metody chemiczne oznaczeń cholesterolu całkowitego

*metoda Liebermanna-Burcharda

-tworzenie barwnego produktu w obecności:

+kwasu octowego

+bezwodnika kwasu octowego

+stężonego kwasu siarkowego

-metoda nieswoista dla cholesterolu- wynik fałszują inne chromogeny np.: wysoki poziom bilirubiny

*metoda Zaka

-z użyciem kwasu octowego, siarkowego i jonów Fe³⁺

-otrzymuje się czerwone zabarwienie roztworu (metoda kolorymetryczna)

-metoda czulsza od metody Liebermanna-Burcharda, ale bardziej pracochłonna.

Współcześnie postuluje się oznaczać cholesterol całkowity metodami enzymatycznymi

*metoda eznymatyczno-kolorymatryczna

-ChE + H₂O - - - esteraza cholesterolowa - - - ChW + KT

-ChW + O₂ - - - oksydaza cholesterolowa - - - cholestanon + H₂O₂

ChE- cholesterol estryfikowany ChW- cholesterol wolny

Metody oznaczania H₂O₂ wykorzystywane w metodach enzymatycznych oznaczania cholesterolu całkowitego

1.metoda peroksydazowa (najpopularniejsza)

H₂O₂ + $AAP + P-chlorofenol - - - peroksydaza - - - chinonoimina + H₂O

2.katalazowa

H₂O₂ + metanol - - - katalaza - - - formaldehyd + H₂O

formaldehyd + acetylooctan - - - barwny produkt (oznaczanie kolorymetryczne)

3.oksydazowa

4.polarograficzna

Interpretacja oznaczeń cholesterolu całkowitego

Cholesterol całkowity

<200 mg/dl - niskie ryzyko miażdżycy

200-249 mg/dl - umiarkowane ryzyko miażdżycy

> 250 mg/dl - wysokie ryzyko miażdżycy

Cholesterol całkowity mg/dl * 0,0258 = mmol/l

<5,16 mmol/l - niskie ryzyko miażdżycy

5,16-6,42 mmol/l - umiarkowane ryzyko miażdżycy

>6,42 mmol/l - wysokie ryzyko miażdżycy

Wzrost stężenia cholesterolu:

-ciąża, okres przedmiesiączkowy

-cukrzyca

-zespół nerczycowy

-niedoczynność tarczycy

-przewlekłe zapalenie trzustki

-przewlekłe kłębuszkowe zapalenie nerek

-zapalenie wątroby z cholestazą

-żółtaczka mechaniczna

-glikogeneza

-łuszczyca

-hiperlipidemie rodzinne typu I, II, III

-skrobiawica

-choroba Gauchera

-celiaklia

-leczenie ACTH i kortykosterydami

Zmniejszenie stężenia cholesterolu

-miesiączka

-marskość wątroby, uszkodzenie miąższu wątroby

-żółtaczka hemolityczna

-ostre zapalenie trzustki

-nadczynność tarczycy

-niedokrwistość z niedoboru żelaza

-niedokrwistość Addisona-Biermera

-niewydolność krążenia

-A-β-lipoproteinemia

HDL-cholesterol

Metody oznaczania:

-metody precypitacyjne (strąceniowe) np.: wg Lopesa - Virella

-metody bezpośrednie

1.metody precypitacyjne

-zasada metody precypitacyjnej polega na tym iż polianion, detergent, obojętne polimery wraz z dwuwartościowymi kationami tworzą z lipoproteinami nierozpuszczalne kompleksy wytrącane z surowicy. Precypitacja zależy od natury anionów i kationów, stężenia odczynnika, pH roztworu

*wytrącanie VLDL i IDL przez heparynę

Zasada metody Lopes - Virella

-mieszanina jonów Mg i fosforowolframianu wytąca lipoproteiny frakcji LDL, VLDL i chylomikrony

-po odwirowaniu w nadsączu znajdują się frakcja HDL w której oznaczamy cholesterol metodą enzymatyczną ze względu na jej czułość (nadsącz po odwirowaniu winien być klarowny)

-w surowicy z wysokim poziomem TG mogą się nie wytrącać całkowicie lipoproteiny (obserwuje się wtedy zmętnienie nadsączu lub flotację części lipoprotein)

-w takim wypadku należy surowicę rozcieńczyć 0,9% NaCl i powtórnie odwirować, otrzymany wynik pomnożyć przez rozcieńczenie.

WYKŁAD 28 X 2009r.

Metoda precypitacyjna wg Lopesa-Virella

Metody bezpośrednie oznaczeń HDL-cholesterolu

zasada metody:

-polega na użyciu mieszaniny polimerów lub polianionów lub przeciwciał które są wiązane na powierzchni chylimikronów, VLDL i LDL w wyniku czego powstają stabilne kompleksy nie rozpadające się nawet w obecności detergentów

-cząsteczki HDL nie są stabilizowane przez polimery lub polianiony ulegają więc solubilizacji pod wpływem detergentu

Metody bezpośrednie oznaczania HDL-cholesterolu

-w efekcie tylko cholesterol znajduje się we frakcji HDL jest oznaczany metodami enzymatycznymi

W metodach bezpośrednich nie ma pośredniego etapu wirowania !!

Oznaczanie HDL-cholesterolu metodą enzymatyczno-kolorymatryczną w metodzie bezpośredniej

ChE(w HDL) + H₂O - - - esteraza cholesterolowa - - - ChW

ChW + O₂ - - - oksydaza cholesterolowa - - - cholestanon + H₂O₂

H₂O₂ + 4AAP + P-chlorofenol - - - peroksydaza - - -chinonoimina + H₂O

Metody bezpośrednie oznaczania HDL-cholesterolu wykorzystywane na analizatorach biochemicznych

1.metoda PEGME - z glikolem polietylenowym w modyfikacji enzymatycznej z α-cyklodekstranem

2.PPD - poianion -polimer/detergent

3.IS-immunoseparacja z użyciem przeciwciał

4.metoda Clearance firmy Randox

Metoda bezpośrednia (PEGME) z glikolem polietylenowym i cylkodekstranem

zasada metody

-Reagent I = zawierający α-cyklodekstran i dextran razem z jonami Mg²⁺ powoduje powierzchniowe „opłaszczenie” wszystkich lipoprotein za wyjątkiem HDL-cholesterolu

-”opłaszczenie” uniemożliwia dostęp do tych lipoprotein enzymów zawartych w reagencie II

-Reagent II zawiera glikol polietylenowy wraz z enzymami dzięki którym oznaczany jest w dalszym etapie tylko cholesterol w HDL (metoda enzymatyczna przy odczycie 600nm)

Metoda bezpośrednia PPD

zasada metody:

-badanie HDL-cholesterol jest jednorodną metodą bezpośredniego pomiaru cholesterolu w HDL z pominięciem jakichkolwiek procedur wstępnych

-zasadę metody stanowi użycie dwóch odczynników

-reagent I zawiera mieszaninę polimerów i polianionów których są wiązane na powierzchni wszystkich lipoprotein (LDL, VLDL i chylomikronów) za wyjątkiem HDL

-te kompleksy lipoprotein z polianionami i polimerami są stabilne nawet w obecności detergentów które stanowią składnik drugiego odczynnika (RII) i są niewrażliwe na enzymy (w RII)

-w odróżnieniu cząsteczki HDL nie są solubilizowane przez polimery i polianiony i ulegają solubilizacji przez detergenty

-w efekcie w tych warunkach tylko cholesterol w HDL jest oznaczany w dalszym stapie metody enzymatycznej

Metoda bezpośrednia immunoseparacji (IS) oznaczania HDL-cholesterolu

zasada metody

-w metodzie tej wykorzystywane są swoiste przeciwciała przeciwko ludzkiej lipoproteinom frakcji LDL, VLDL i chylomikronom

-frakcje te tworzą z przeciwciałami kompleksy nie posiadające zdolności reakcji enzymatycznej z enzymami wykorzystywanymi w enzymatycznej metodzie oznaczania cholesterolu w frakcji HDL

-enzymy te reagują tylko z wolną frakcją HDL

Schemat ETAP I

VLDL, IDL, LDL, chylomikrony + przeciwciała przeciwko apolipoproteinom - - - opłaszczenie lipoprotein - - - oporne na działanie enzymów

ETAP II

HDL - - - esteraza - - - cholesterol wolny (oznaczanie metodą enzymatyczną)

Metoda bezpośrednia Clearance Firmy Randox

zasada metody :

-oznaczenie przebiega w dwóch etapach:

*faza eliminacji → bufor o odpowiedniej sile jonowej (bufor Good`a i MgCl₂) i w obecności enzymu (esteraza) uwalnia z lipoprotein (z wyjątkiem HDL) cholesterol, który po zadziałaniu oksydazy zostaje utleniony do cholestenonu i nadtlenku wodoru, a ten ostatni zostaje rozłożony pod wpływem katalazy

*faza oznaczania → pod wpływem swoistego detergentu w stosunku do HDL lipoproteina ta zostaje uwolniona a następnie cholesterol we frakcji oznaczany metodami enzymatycznymi

-dodany z odczynnikiem RII silny surfaktant pozwala na wyeliminowanie zmętnienia spowodowanego chłonką

Współcześnie postuluje się używanie do oznaczeń HDL-cholesterolu tylko metod bezpośrednich !!

HDL-chlesterol musi stanowić co najmniej 20% cholesterolu całkowitego

Wzrost stężenia HDL-cholesterolu

-ciążą

-terapia estrogenami (np.: hormonalna terapia zastępcza)

-regularny wysiłek fizyczny

-właściwa dieta

-małe dawki alkoholu (do 25 g/doba)

-rodzinna hyperalfalipoproteinemia

Spadek stężenia HDL-cholesterolu

-palenie papierosów

-otyłość

-mała aktywność fizyczna

-sterydy anaboliczne, progesteron, β-blokery

-hipertriglicerydemia

-zaburzenia endokrynologiczne np.: cukrzyca, choroba Cushinga

-choroba Tangierska ( zaburzenia estryfikacji cholesterolu)

Alkohol a ryzyko miażdżycy

-alkohol w małej ilości i niskoprocentowy (maksymalna dawka dobowa 25 gram etanolu/doba) podwyższa poziom HDL a obniża poziom całkowitego cholesterolu

-podobnie działa spożywanie kawy - 2 filiżanki dziennie

Metody oznaczania frakcji LDL-cholesterolu

1.metody precypitacyjne

2.wzór Friedewalda

3.metody bezpośrednie

Metody precypitacyjne

zasada metody:

-polianiony, detergenty, obojętny polimer wraz z dwuwartościowymi kationami tworzą z lipoproteinami nierozpuszczalne kompleksy wytrącane z surowicy

-precypitacja zależy od natury anionów i kationów, stężenia odczynników, pH roztworu i siły jonowej

-przez właściwy dobór warunków osiąga się selektywne strącanie klas lipoproteina

Przykłady:

1.wytrącanie VLDL i IDL przez heparynę i jony manganu

2.wytrącanie VLDL i LDL przez concawalinę A (dzięki powinowactwu do apo B)

3.selektywne strącanie frakcji LDL za pomocą amfipasywnych ????? polimerów siarczanu dekstranu, siarczanu laurylosodowego

4.selektywne strącanie przy użyciu immunoglobulin anty-apo-B

Metody precypitacyjne

-w dalszym etapie próbkę poddaje się wirowaniu

-po odwirowaniu nadsącz oddziela się od osadu i poddaje dalszym etapom oznaczania

-jeśli strącono lipoproteiny (inne niż LDL) odciąga się nadsącz i oznacza w nim cholesterol we frakcji LDL metodami enzymatycznymi

-jeżeli strącono LDL to odciąga się nadsącz i nalizuje osad po ponownym rozpuszczeniu i oznacza się cholesterol LDL

Wzór Friedewalda

LDL-cholesterol = cholesterol całkowity - HDL-cholesterol - TG /5 (mg/dl)

LDL-cholesterol = cholesterol całkowity - HDL-cholesterol - TG /2,2 (mmol/l)

Uwagi do wzoru:

-wzór Friedewalda nie można stosować przy hipertriglicerydemii powyżej 400 mg/dl

-bardzo tania metoda , wymaga tylko wyliczenia

-współcześnie postuluje się używanie do oznaczeń LDL-cholesterolu tylko metod bezpośrednich

Metody bezpośrednie oznaczania LDL-cholesterolu na analizatorach

1.metoda bezpośrednia opracowana przez firmę BioMerieux

zasada metody:

-wykorzystuje poliklonalne przeciwciała przeciwko ludzkim apolipoproteinom frakcji HDL, VLDL, i chylomikronom

-mogą być także wykorzystywane polimery lub polianiony do opłaszczania lipoprotein

-w końcowym etapie cholesterol we frakcji LDL oznacza się zawsze metodami enzymatycznymi

Metoda bezpośrednia BioMerieux

1.zestaw składa się z dwóch odczynników

*RI - detergent oksydaza kwasu askorbinowego, 4-aminoantypirydyna, peroksydaza oraz enzym katalizujący przemianę cholesterolu

*RII - detergent: sulfonylobutynyl ???

2.zasada metody: oznaczanie przebiega w 2 fazach

*faza eliminacji:

-chylomikrony, VLDL, HDL - - - detergent RI - - - przechodzą do fazy płynnej - - - esteraza - - - uwolniony cholesterol - - - oksydaza cholesterolowa, peroksydaza - - - bezbarwny produkt

*faza oznaczania

-LDL - - - detergent RII - - - faza płynna - - - esteraza cholesterolowa - - - cholesterol wolny

-cholesterol wolny - - - oksydaza cholesterolowa - - - cholestanon + H₂O₂

-H₂O₂ - - - oznaczanie metodą peroksydazową

Metoda lateksowa Pointe Scientific

1.lateks opłaszczony przez poliklonalne przeciwciała przeciwko apolipoproteinom - - - wiązanie lipoprotein innych niż LDL

2.LDL - - - esteraza cholesterolu - - - cholesterol wolny oznaczany metodami enzymatycznymi

Dla LDL postuluje się oznaczanie metodami bezpośrednimi

lipoproteina (a)

-schematycznie jest to LDL połączone z apolipoproteiną (a)

-stężenie zależy od ekspresji genetycznej

-jest niezależnym czynnikiem aterogennym zwłaszcza w połączeniu z innymi czynnikami ryzyka miażdżycy

Lp(a)

-budowa domenowa podobna do protrombiny aktywatora plazminogenu (tPA), urokinazy, czynnika XII

-prowadzi do zwiększenia ryzyka zakrzepów

-usuwana głównie przez receptory typu scavenger prowadząc przy podwyższonym stężeniu do wzrostu liczby komórek piankowatych

Metody oznaczania Lp(a)

1.metody turbidymetryczne i nefelometryczne (metody zmętnieniowe) z surowicami anty-Lp(a)

2.elektroimmunodyfuzja- elektroforeza rakietkowa Laurella - przydatna do małej liczby próbek - technika prosta

3.ELISA

Metoda zmętnieniowa

-najczęściej jest to metoda turbidymetryczna

-możliwość wdrożenia tej metody na analizatory biochemiczne

-wykorzystywane są przeciwciała w stosunku do Lp(a) a konkretnie w stosunku do Apo A

-test trwa ok. 20 minut

-często używana do badań scriningowych

Metoda ELISA

-standardowa metoda ELISA z płytką na 96 studzienek

-zestaw zawiera koniugant sprzężony z peroksydazą

-metoda czuła

-metoda mająca małe zastosowanie w diagnostyce rutynowej gdyż jest bardzo pracochłonna

Elektroimmunodyfuzja rakietkowa Laurella

-zestaw 3 żeli (na każdym 13 studzienek)

-do studzienek nakłada się surowicę (dyfuzja na żelu)

-dalej elektroforeza

-następnie mamy barwienie, utrwalanie, odczyt charakterystycznych prążków w kształcie „rakietek tenisowych”

Wartości ryzyka choroby wieńcowej na podstawie poziomu Lp(a)

niskie - <10 mg/dl

umiarkowane - 10-30 mg/dl

wysokie - > 30mg/dl

Apolipoproteiny

Metody oznaczania

1.turbidymetria

2.nefelometria

3.immunoenzymatyczne np.: ELISA

4.metoda immunofuorescencyjna

5.metoda chemiluminescencyjna

6.metoda immunoizotopowa

Metody zmętnieniowe

-są to metody służące do pomiaru ilościowego substancji nierozpuszczalnych, wywołujących zmętnienie

1.nefelometria → wykorzystuje efekt Tyndalla który polega na pomiarze ilości światła rozproszonego przez mętny roztwór w kierunku prostopadłym do kierunku padania światła

2.turbidymetria → opiera się na pomiarze światła przepuszczanego przez mętny roztwór

-wykorzystywana jest najczęściej w metodach stosowanych na analizatorach biochemicznych

Metody zmętnieniowe:

-wiele analiz z zakresu bakteriologii, immunologii i diagnostyki laboratoryjnej białek wykonuje się tymi metodami

-są one o wiele trudniejsze niż metody spektrofotometryczne gdyż roztwory koloidalne są bardziej nietrwałe, łatwo wytrącają się lub sedymantują w roztworach

-w celu uniknięcia błędów tym spowodowanych używa się koloidów ochronnych lub żelatyny

Apolipoproteina A1

-składnik HDL (głównie) i chylomikronów

-aktywator LCAT

-łączą się z receptorem dla Apo A1

-spadek stężenia koreluje ze wzrostem ryzyka miażdżycy

Metody turbidymetryczne oznaczania Apo A1

zasada metody:

-opracowano wiele metod oznaczania apo A 1 w tym immunoturbidymetrycznych w których powstaje nierozpuszczalny kompleks (immunoprecypitat) apo A1 ze specyficznym przeciwciałem

-optymalne warunki reakcji osiąga się przez odsłonięcie wszystkich miejsc wiążących przeciwciała za pomocą specjalnego aktywatora

-odczynnik aktywujący jest specjalną kompozycją specyficznych związków powierzchniowo aktywnych rozpuszczonych w buforze konserwowanym azydkiem sodu.

-powstające w wyniku reakcji zmętnienie jest mierzone w spektrofotometrze przy długości fali 340 nm

-stężenie apo A1 odczytywane jest z krzywej kalibracyjnej

-przeciwciała zastosowane w przedstawionej metodzie otrzymywane są z surowicy kóz immunizowanych oczyszczonym preparatem apo A1 z ludzkich frakcji HDL

-metodą immunoelektroforezy wykazano monospecyficzność tych przeciwciała w stosunku do apo A1 w ludzkiej surowicy krwi.

Metoda turbidymetryczna

-pomiar stężenia apo A1 białka występującego w największej ilości we frakcji HDL w połączeniu z pomiarem apo B (białko LDL) jest przydatny do identyfikacji pacjentów szczególnie narażonych na rozwój choroby wieńcowej, a także do diagnozowania pacjentów z rodzinnym niedoborem apo A1 i chorobą Tangierską

Apo A1 ryzyko CHNS (choroba niedokrwienna serca)

niskie - >115 mg/dl

umiarkowane - 115-90 mg/dl

wysokie - < 90 mg/dl

wzrost stężenia Apo A1

-ciąża

-terapia estrogenami

-ćwiczenia fizyczne

spadek stężenia Apo A1

-infekcje

-cholestaza

-cukrzyca

-palenie papierosów

-typ I i V hiperlipoproteinemii

-leki androgenne, diuretyki

Zmiany stężenia apo A1 są równoległe ze zmianami stężenia HDL

Antyaterogenne są tylko lipoproteiny HDL zawierające dużą przewagę apoA1 nad apo A2 (przynajmniej 5 razy)

Apolipoproteina B

-2 formy - apo B48 i apo B100

-oznaczane jest głównie apoB100

-60-80% cholesterolu całkowitego związane jest z apo B

-synteza w wątrobie

-ligand dla receptora apo B/E

-nie występuje w HDL

-jest więc bardziej obiektywnym wskaźnikiem zagrożenia miażdżycą

-aterogenność wzrasta wraz ze wzrostem stężenia

-apolipoproteina B100 jest głównym białkiem frakcji LDL (ponad 90% ogólnej masy białek tej frakcji)

-wzrost poziomu LDL jest związana z wzrostem ryzyka rozwoju choroby wieńcowej

Metoda turbidymetryczna oznaczania apo B

zasada metody:

-w metodzie immunoturbidymetrycznej powstają nierozpuszczalne kompleksy (immunoprecypitaty) apo B ze specyficznymi przeciwciałami

-powstające w wyniku reakcji zmętnienie jest mierzone w spektrofotometrze przy długości fali 340 nm

-stężenie apo B odczytywane jest z krzywej kalibarcyjnej

Apo B odgrywa podstawową rolę w transporcie i metabolizmie lipidów poprzez interakcje z receptorem błony komórkowej oraz hamowaniem kluczowego enzymu cholesterolowego- reduktazy 3-hydroksy-3metyloglutanylokoenzymuA

-inne badania wykazują że pomiar stężenia apo B w połączeniu z apoA1 jest lepszym wskaźnikiem przewidywania rozwoju miażdżycy niż inne parametry.

-określenie stężenia apo B umożliwia wyselekcjonowanie pacjentów u których cholesterol frakcji LDLjest prawidłowy przy jednoczesnym wzroście apo B (hiperβlipoproteinemia)

Ryzyko CHNS na podstawie apo B

niskie < 115 mg/dl

umiarkowane 115-135 mg/dl

wysokie >135 mg/dl

Wzrost stężenia apo B

-w typie IIa i IIIb hiperlipoproteinemii

-otyłość

-palenie papierosów

-mała aktywność fizyczna

-sterydy anaboliczne, cyklosporyny,

-zaburzenia endokrynologiczne np.:cukrzyca, choroba Cushinga

-zespół nerczycowy

-wzrost stężenia apo B koreluje ze wzrostem ryzyka miażdżycy

Spadek stężenia apo B

-a-betalipoproteinemia

-terapia estrogenami ( hormonalna terapia zastępcza)

-infekcje

-wysiłek fizyczny (regularny)

Zmiany stężenia apo B są równoległe ze zmianami stężenia LDL

porównanie czułości i specyficzności oznaczeń apolipoprotein z LDL-cholesterolem i HDL-cholesterolem

czułość specyficzność

LDL-chol/HDL-chol 60% 70%

apoB/apoA 70% 82%

elektroforeza lipoprotein (lipidogram)

metody elektroforetycznego- polegają na rozdziale lipoprotein osocza na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym (PPA)

Położenie frakcji

agaroza PPA

chylomikrony START chylomikrony

β pre-β

pre-β β

α α

Ruchliwość elektroforetyczna zależy od:

-wielkości (największe są chylomikrony i w polu ycznym ??? prawie się nie ruszają)

-rodzaj nośnika (żel, bibuła)- zależy od wielkości oczek tworzonych przez usieciowanie żelu lub bibuły

-składnika białkowego - im więcej białek tym wyższy ładunek- stosuje się odpowiednie bufory ( zawsze zasadowe)- białko zyskuje ładunek ujemny- wieć ida do elektrody ujemnej (najwięcej białek ma frakcja HDL- najdalej wędruje)

Typ I

-β i pre-β- zazwyczaj połączone

-podwójny pik chylomikronów- frakcja szeroka

-niskie α

-bardzo wysokie TG

-mierny wzrost cholesterolu

-niskie wartości HDL-cholesterolu

Typ IIa

-frakcja β dominuje

-wzrost cholesterolu całkowitego, LDL-cholesterolu

-mierny wzrost HDL-cholesterolu

Typ Iib

-wzrost TG, LDL-cholesterolu,

-HDL-cholesterol- nrma lub wzrost

-wzrost całkowitego cholesterolu

Typ III

????????

Typ IV

-pre-β, później β ?????(rosną)

-α- norma lub spada

-wzrost cholesterolu całkowitego, TG !, LDL-cholesterolu

-HDL-norma lub spadek

-ten typ jest charakterystyczny dla cukrzycy

Typ V

-wzrost chylomikronów, wzrost pre-β (VLDL)

-spada α

-wzrost cholesterolu całkowitego (mierny) , wzrost LDL- cholesterolu (mierny)

-znaczny wzrost TG, spadek HDL

Elektroforeza

-tylko wykonywana z surowicy

-najlepiej z surowicy świeżej

-z tej samej surowicy powinien być wcześniej zrobiony profil lipidowy

-surowica dobowa ( trzymana nie dłużej niż 24h)

WYKŁAD 18 XI 2009

Choroby nerek

biochemiczne markery filtracji kłębuszkowej

-kwas moczowy - produkt metabolizmu puryn, który jest łatwo filtrowany przez kłębki nerkowe (tak jak kreatyna ) ale podlega też reabsorpcji i sekrecji w kanalikach. Tylko 6 do 12% kwasu moczowego z oryginalnego przesączu (filtratu) jest wydalana z moczem . Kwas moczowy występuje w formie zjonizowanej i ma tu duze znaczenie w tworzeniu się kamieni moczowych (podagra ??)

-mocznik - (określany także jako azot mocznika BUN) - produkt metabolizmu białek. Ponieważ jego stężenie zależy od trzech czynników -filtracji kłębkowej, reabsorpcji kanalikowej i metabolizmu białek, nie jest on dobrym miernikiem funkcji nerek przydatnym w diagnozowaniu, ale może być użyty do monitorowania w przypadku wyraźnie obniżonej filtracji (GFR).

-kreatynina- produkt mięśni, łatwo filtrowany przez kłębki i w odróżnieniu od mocznika bardz słabo reabsorbowany w kanalikach. Odpowiednia do diagnozowania chorób nerek

*klirens kreatyniny

Najlepsze badanie - klirens krestyniny, kreatynina, (mierzenie mocznika a szczególnie kwasu moczowego bez sensu, nie bardzo przydatne)

-cystatyna C- polipeptyd o masie cząsteczkowej 13 kDa. Ponieważ cechuje się stałym stopniem syntezy i nieograniczoną możliwością filtracji kłębuszkowej. Cystatyna C jest endogennym markerem filtracji kłębkowej (GFR) lepszym niż kreatynina. Korelacja pmiędzy stężeniem cystatyny C w surowicy i GFR jest lepsze niż pomiędzy stężeniem kreatyniny i GFR

(β-2-mikroglobulina - też się nadaje ale nie przy białaczkach)

Ostra niewydolność nerek

-zapalenie kłębków nerkowych \ choroby nerek

-toczeń układowy SLE /

-niesteroidowe leki przeciwzapalne \ działanie nefrotoksyczne (zwiazki nefrotoksyczne)

-aminoglikozydy, cefalosporyny, /

-słaby przepływ przez nerki- spadek ciśnienia krwi, sepsa, oparzenia, krwotoki, uszkodzenia powypadkowe, niewydolność serca

-filtrujące się białko Bence-Jonesa - przyczyna wewnętrzna

Zmiany biochemiczne w ostrej niewydolności nerek ONN

wzrost: spadek:

-potasu -sodu

-mocznika -wapnia

-kreatyniny -wodorowęglanów

-magnezu

-fosforanów

-moczanów

-kwasicy

Końcowa faza ONN- schyłkowa

Biochemiczne zmiany:

wzrost: spadek:

-potas -sód

-kreatynina -wapń

-magnez -wodorowęglany

-kwasica

-moczany

Przewlekła niewydolność nerek

-spadek produkcji erytropoetyny

-retencja produktów metabolicznych

U ludzi dializowanych dochodzi do wzrostu luki osmotycznej

Proteinuria (przyczyny)

a).przewlekła

-białka o niskiej masie cząsteczkowej np.: białko Bence-Jonesa ( ilość białek przekracza zdolność reabsorpcji nerek- pojawienie się białek w moczu)

b).kłębkowa

-większa przepuszczalność kłębka (uszkodzony kłębek)- uciekają białka prawidłowe np.: albuminy, globuliny

c).kanalikowe

-uszkodzone kanaliki - brak reabsorpcji białek np.: β-2-mikroglobuliny- powinna być w 100% reabsorbowana, a nie jest

d).sekrecja

-wydzielanie białek przez drogi moczowe np.: białko Tomma-Horsfall

Cukrzyca

Hormony

I-insulina - spadek glukozy we krwi

II-glukagon \

III-adrenalina \ wzrost stężenia glukozy we krwi

IV-hormon wzrostu /

V- glukokortykosteroidy- kortyzol /

Insulina

*nasila, powoduje:

- wchodzenie glukozy do tkanek (głównie do tkanki tłuszczowej i mięśni)

-glikolizę

-syntezę glikogenu

-syntezę białek

-wejście do komórek potasu i fosforu

*stopuje, hamuje:

-glukoneogenezę (stop dla syntezy glukozy w tkankach)

-zatrzymuje glikogenolizę

-lipolizę

-zatrzymuje ketogenezę

-zatrzymuje rozpad białek (proteoliza)

Powstawanie insuliny:

-proinsulina → odłącza się od niej peptyd C → normalan insulina

Cukrzyca Typ I i Typ II

cukrzyca	Typ I	Typ II
patogeneza	Autoimmunologiczne zniszczenie komórek β, całkowity brak insuliny	Połączony defekt sekrecji insuliny i insulinooporności
Początek choroby	Poniżej 30 roku życia	Powyżej 30 roku zycia
Skłonność do kwasicy ketonowej	Duża	mała
Otyłość	rzadko	często
leczenie	Dieta, insulina	Dieta, doustne leki hipoglikemizujące, insulina

MODY

-cukrzyca dorosłych występująca w wieku młodzieńczym. MODY jest rzadko występującą formą cukrzycy typu 2 pojawiającą się przed 25 rokiem życia najczęściej w wieku 9-13 lat. Polega na zaburzeniu wydzielania insuliny przy braku oporności na insulinę

schemat metabolizmu komórkowego:

glukoza

-{synteza glikogenu}- -{glikoliza}-

glikogen ← ----------------------------------------------

insulina + insulina +

glukagon - glukagon - ← NORMA

↓

pirogronian

-{ketogeneza}-

zawiązki ketonowe ← Ac-CoA

insulina + -{lipogeneza}-

glukagon - insulina +

glukagon -

WKT

glukoza

↑

{glikogenoliza} {glukoneogeneza}

glikogen ↑

insulina - insulina -

glukagon+ glukagon+

pirogronian ← zaburzenie

ketogeneza

związki ketonowe ← Ac-CoA

{lipoliza}

insulina -

glukagon + insulina -

glukagon+

WKT

Ciała ketonowe

-aceton

-kwas acetooctowy

-kwas β-hydroksymasłowy

Mechanizm powstawania kwasicy ketonowej w cukrzycy:

brak insuliny

↓ ↓ ↓

spadek wychwytu wzrost syntezy wzrost lipolizy

glukozy przez tkanki glukozy w wątrobie ↓

obwodowe wzrost ketogenezy

↓

hiperglikemia ketonuria

↓ ↓

glukozuria kwasica metaboliczna

ketonuria ↓

↓ kompensacja oddechowa

odwodnienie ↓

hiperwentylacja, oddech

Kussumala

Nefropatia cukrzycowa

zwiększona przepuszczalność ← ------------------------- → zwiększona wytwarzanie

w kłębuszkach nerkowych błony podstawnej

↑

↓

mikroalbuminuria ------------------ → wydalanie albumin w moczu > 30mg/dl

↓

proteinuria okresowa

↓

proteinuria utrwalona -------------- → nefropatia: wydalanie białek w moczu

↓ > 0,5 g/24h

upośledzenie funkcji nerek ↓ skala czasu

6-30 lat trwania

cukrzycy

Badania laboratoryjne w cukrzycy:

-stężenie glukozy

-stężenie insuliny

-stężenie C-peptydu

-test tolerancji glukozy

-profil dobowy glukozy

-samokontrola stężenia glukozy we krwi

-hemoglobina glikowana (HbA1_c)

-fruktozamina (glikowana albumina)

-osmolalność osocza

-równowaga kwasowo-zasadowa

-mleczany

-glukoza w moczu

-mikroalbuminy w moczu (mikroalbuminuria)

-ciała ketonowe w moczu (ketonuria)

Interpretacja wartości stężenia HbA1_c

HbA1 (% całkowitej Hb)

5,5-8% norma /dobrze wyrównana cukrzyca/

8-10% dość dobrze wyrównana cukrzyca

10-12% częściowo wyrównana cukrzyca

12% niewyrównana cukrzyca

Wykład 25 XI 2009

Zastosowanie nowoczesnych metod immunologicznych (RIA, EIA, FIA i chemiluminescencji) w diagnostyce laboratoryjnej

Metody immunologiczne:

*możliwość oznaczania substancji występujących w śladowych ilościach

+rzędu pmol/l → 10^-12 mol/l lub

+ fmol/l → 10^-19 mol/l

*reakcja antygenu ze swoistym przeciwciałem

*powstanie kompleksu antygen-przeciwciało

Podział metod immunologicznych

*heterogenne

-przeciwciało jest związane z fazą stałą

-wymagają oddzielenia formy wolnej antygenu od formy związanej z przeciwciałem

-metoda MEIA

*homogenna

-reakcja zachodzi w roztworze

-nie wymaga oddzielenia formy wolnej antygenu od formy związanej z przeciwciałem

-FPIA, EMIT

Techniki rozdziału frakcji wolnej od fazy związanej:

+absorpcja frakcji wolnej

-węgiel aktywowany

+precypitacja fazy związanej

-chemiczna

-immunologiczna

+absorpcja fazy związanej

-faza stała np.: ścianki probówki z opłaszczonym pierwszym przeciwciałem

Podział metod immunologicznych

+kompetencyjne (niedomiarowe)

-badany antygen współzawodniczy z antygenem znakowanym o ograniczoną ilość przeciwciał

-odwrotna zależność aktywności znacznika od stężenia antygenu w probówce !!!!

-do oznaczania haptenów

-metoda RIA

+niekompetecyjne (nadmiarowe)

-oznaczenia stężenia dużych antygenów mających c najmniej dwa miejsca wiążące przeciwciało

-stosuje się nadmiar dwóch różnych przeciwciał

-aktywność znacznika wprost proporcjonalna do stężenia antygenu

-metoda IRMA

Rodzaje przeciwciał:

+poliklonalne

-produkowane przez różnorodne komórki (różne immunochemicznie)

-reagują z kilkoma epitopami na antygenie

+monoklonalne

-produkowane przez komórki myszy (identycznych immunochemicznie)

-reagują z jednym specyficznym epitopem na antygenie

Podział metod immunologicznych w zależności od stosowanego znacznika

-RIA (radioimmunologiczne)

-EIA (immunoenzymatyczne)

-FIA (fluorescencyjne)

-CLIA (chemiluminescencyjne)

RIA

-metoda izotopowa

-pomiar radioaktywności substancji znakowanej izotopem promieniotwórczym wchodzącym w skład reakcji antygen-przeciwciało

-oznaczanie substancji drobnocząsteczkowych (hapten, leki)

-kompetencyjna !!!!

-heterogenna !!!!!

RIA- technika pomiaru:

-układ z zastosowaniem stałego kryształu

*licznik gamma

-układ scyntylacji ciekłej

*licznik beta

RIA- znaczniki:

+izotopy promieniotwórcze

-emitery gamma (znakowanie antygenów białkowych) → izotopy jodu ( I¹³¹, I¹²⁵)

→ izotopy kobaltu (Co⁵⁷)

-emitery beta (znakowanie związków drobnocząsteczkowych ) → izotopy węgla (C¹⁴)

→ izotopy wodoru- tryt (H³)

+znakowany może być antygen lub przeciwciało

Zasada metody:

-do mieszaniny zawierającej stałą ilość antygenu znakowanego i stałą ilość przeciwciał dodaje się nieznaną ilość antygenu (z próby badanej)

-znakowany i nieznakowany antygen konkuruje o ograniczoną ilość miejsc wiążących na cząsteczce przeciwciała

-powstają kompleksy:

*znakowany antygen-przeciwciało

*nieznakowany antygen-przeciwciało w takich samych proporcjach jak znakowany i badany antygen

-po okresie inkubacji oddziela się frakcję wolną znakowanego antygenu od frakcji związanej

[oddzielenie najczęściej poprzez płukanie]

-odczyt

IRMA- metoda immunoradiometryczna

-bardziej czuła odmiana metody RIA

-znakowane jest przeciwciało zamiast antygenu

-do oznaczania antygenów białkowych (minimum dwa epitopy )np: TSH

-radioaktywność wprost proporcjonalna do stężenia antygenu

-niekompetecyjna !!!!!

-przeciwciało jest opłaszczone na fazie stałej (ścianka probówki, kulka szklana czy studzienka mikropłytki)

-badany antygen łączy się z przeciwciałem którego radioaktywność jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu

EIA

-wysoka czułość i specyficzność

-przeciwciała lub antygen związane jest z aktywnym enzymem :

*fosfatazą alkaliczną

*peroksydazą chrzanową (najczęściej)

-do monitorowania przebiegu reakcji enzymatycznych stosuje się różne metody detekcji:

*fotometria (najbardziej popularna)

*chemiluminescencja

*fluorymetria

ELISA

-jeden z uczestników reakcji (przeciwciało lub antygen) jest związany z fazą stałą (mikropłytki z dołkami)

-metoda może być kompetencyjna lub niekompetencyjna

-stosowana do oznaczeń markerów nowotworowych, cytokin, hormonów, swoistych przeciwciał

Zasada metody → znać

MEIA → znać zasadę metody, metoda immunofluorescencyjna

-metoda heterogenna

ELFA → znać zasadę metody , szybkość powstawania produktu jest wprost proporcjonalna ?????

FEIA - metoda fluoroimmunoenzymatyczna

-diagnostyka alergologiczna → oznaczanie IgE całkowitego i swoistego, ECP, tryptazy.

-analizator UniCap firmy Pharmacia Diagnostics

-wykorzystuje immunocapy (małe naczynka z materiałem porowatym, gdzie jest pierwsze przeciwciało

-metoda detekcji → fluorometryczna

-wysoki koszt badania

Alergeny:

a)wziewne

-roztocza

-pylenie

b)pokarmowe

c)alergeny pleśni

d)alergeny od zwierząt (kot, pies, świnka morska, pszczoła, trzmiel)

e)leki

FEIA → znać zasadę metody

FIA - metoda immunofluorescencyjna

-wykrywanie i lokalizacja antygenu (podstawowe histochemiczne i cytchemiczne techniki służące do wykrywania , lokalizacji antygenów)

-wysoka czułość reakcji (rzędu 10^-15 mol/l)

-przeciwciała lub antygen są związane z substancją fluoryzującą

-metoda kompetencyjna !!!!

CLIA

-wykorzystuje emisję światła wytwarzanego w reakcji chemicznej

-utlenienie znaczników chemiluminescencyjnych przyczepionych do przeciwciała lub haptenu wywołuje emisję światła o określonej długości fali i daje możliwość pomiaru stężenia badanej substancji

Znaczniki:

*substancje chemiluminescencyjne

-estry akrydyny

-luminol

-izoluminol

-lucyferyna

Natężenie światła jest wprost proporcjonalne do stężenia badanego antygenu

-oznaczanie → przeciwciał, cytokin, markerów nowotworowych, białek specyficznych

ECLIA - metoda elektrochemiluminescencyjna

-emisja światła wytwarzanego w czasie reakcji chemicznej jest wywołana podłączeniem prądu

-znacznik → sole rutenu???

-faza stała → cząsteczki magnetyczne

-wykorzystuje himeryczne przeciwciała (fragmenty Fab są mysie i ludzkie???)

WYKŁAD 2 XII 2009

układ hormonalny

oddziaływanie komórek:

-parakrynne

-autokrynne

-endokrynne

Hormony

a)białkowe → zawsze działają przez receptory białkowe, sygnał przez nie przenoszony może być wzmocniony w samej błonie, produkowane są w bardzo małych ilościach

b)niebiałkowe (np.: steroidowe) → przechodzą przez błonę komórkową, receptory mają dopiero w cytoplazmie, po związaniu z receptorem wędrują do jądra- jednostka A wiąże się z DNA, a jednostka B odblokowuje dostęp do DNA

Schemat działania układu hormonalnego

CUN

↓

podwzgórze

ujemne sprzężenie

zwrotne ← liberyny

przysadka

← hormon tropowy

gruczoł obwodowy

← hormony

komórki docelowe

↓

efekt

centralna rola podwzgórza i przysadki

Podwzgórzowe liberyny i statyny

hormon	działanie
TRH (tyreoliberyna )	Uwalnianie TSH
GnRH (gonadotropina)	Uwalnianie gonadotropiny
GHRH (liberyna uwalniająca hormon wzrostu)	Uwalnia GH
CRH (kortykoliberyna)	Uwalnia ACTH
SRIH (somatostatyna)	Hamuje uwalnianie GR(H)?????
PIH	Hamuje uwalnianie PRL
MRIH	Hamuje uwalnianie MSH

Działanie na

CRH ------------------- → ACTH (+)

GnRH ----------------- → LH, FSH (+)

TRH ------------------- → TSH, prolaktyna (+)

dopamina ------------- → prolaktyna (-)

GHRH ----------------- → GH (+)

SRIH ------------------- → GH (-)

Hormon antydiuretyczny ADH

-produkowany w podwzgórzu

-wydzielany przez tylną część przysadki

-stymulacja wydzielania:

*osmolalność osocza ↑

*ciśnienie krwi ↓

*objętość krwi ↓

-działanie

*skurcz naczyń

*reabsorpcja wody w nerkach

(osmoreceptory, baroreceptory → ciśnienie, rdenoreceptory??? → objętość naczyń)

ADH

*zaburzenia wydzielania

I.niedoczynność (poliuria)

-moczówka prosta (postać centralna)

+zaburzenie wydzielania ADH przez przysadkę

-moczówka prosta (postać nerkowa)

+brak odpowiedzi nerek na ADH

-do różnicowania z psychogenną polidypsją

+zatrucie wodne

II.nadczynność (oliguria)

-zespół nadmiernego wydzielania ADH → SIADH

+autonomiczne wydzielanie ADH przy braku stymulacji

Test ograniczenia płynów

-ograniczenie podawania płynów 6 do 12 godzin

-reakcja fizjologiczn

*spadek objętości moczu

*wzrost osmolalności moczu >750 mOsm/kg wody

*wzrost ciężaru właściwego moczu

-test jest przerywany kiedy:

*spadek masy ciała o 6-8% i/lub

*wzrost w surowicy stężenia Na⁺ >165 mmol/l

-podawanie ADH w celu różnicowania pomiędzy centralną i nerkową moczówką prostą

Hormon wzrostu GH

-GHRH

*podwzgórzowy peptyd stymulujący wydzielanie GH przez przysadkę

-GH

*białko przedniego płata przysadki które działa poprzez insulinopodobny czynnik wzrostu typu 1 (IGF-1-somatomedyna)

-IGF-1

*polipeptyd syntetyzowany w wątrobie w odpowiedzi na obecność GH i będący głównym regulatorem wzrostu i różnicowania komórek

Rytm wydzielania GH

rysunek

GH - działanie

-wpływa bezpośrednio na metabolizm poprzez indukowanie oporności na insulinę i wzrost poziomu wolnych kwasów tłuszczowych

-GH jest mediatorem wzrostu tkanek miękkich, mięśni, chrząstek i kości poprzez indukowanie syntezy insulinopodobnego czynnika wzrostu typu 1 (IGF-1-) w wątrobie

+IGF-1- stymuluje syntezę białek i tłuszczów oraz metabolizm glukozy

Zaburzenia wydzielania

I.nadmiar GH

+gigantyzm → dzieci

+akromegalia → dorośli

przyczyny:

-guzy przysadki (mogą wydzielać też inne hormony)

-guzy podwzgórza i inne wydzielające ektopicznie hormony przysadki

-inne guzy wydzielające ektopicznie hormony podwzgórza (GHRH)

(ektopicznie - poza przysadką np.: nowotwory)

II.niedobór GH

+karłowatość → dzieci

+u dorosłych objawy osłabienia i utraty masy kostnej wymagające leczenia. Przyczyną niedboru GH jest wrodzona lub nabyta niewydolność przysadki, nieaktywne metabolicznie hormony, przerzuty nowotworowe i promieniowanie radioaktywne

Ocena wydzielania GH

-w przypadku zwiększonego wydzielania GH stężenie GH i IGF-1 w osoczu jest podwyższone

-najlepszym testem na ocenę nadmiernego wydzielania GH jest ocena stężenia IGF-1

-test hamowania glukozą

*stężenie GH w surowicy przed i 2 h po podaniu 75g glukozy

*wydzielanie GH jest zahamowane u osób zdrowych

-niedobór GH jest najlepiej oceniany testem prowokacyjnym

*stymulatory GH: wysiłek fizyczny, hipoglikemia, arginina, L-dopa, klonidyna, GHRH, hexahelina???

*prawidłowa odpowiedź na stymulatory GH > 5-10 ng/ml

*wynik jest pozytywny jeśli GH nie odpowiada wzrostem stęzenia na co najmniej dwa stymulatory

Test tolerancji glukozy w diagnostyce akromegalii (TTG)

-wskazania: diagnostyka akromegalii

*na czczo od północy, i.v. kaniula 30minut przed testem

*glukoza i.v 75 g

*pobranie - krew na GH i glukozę 0, 30, 60 90, 120 i 150 minut po podaniu

-interpretacja

*odpowiedź prawidłowa : stężenie GH < 1ng/ml

*brak odpowiedzi : wydzielanie GH po glukozie wskazuje na akromegalię

Test z GHRH

-wskazanie : diagnostyka niedoboru GH

-procedura:

*na czczo od północy

*wkłucie kaniuli 30 minut przed testem

*GHRH i.v. 1μg/kg

*pobieranie -krew na GH w czasie 0, 15, 30, 60 minut

-interpretacja:

*odpowiedź prawidłowa: wzrost stężenia GH w osoczu > 10ng/ml po 30-50 minutach - niedobór GH wykluczony

Test insulinowy (stres)

-hipoglikemia stymuluje wydzielanie GH

-wskazania- ocena wydzielania (rezerwy) GH

-przeciwwskazania: choroba niedokrwienna serca, padaczka

-procedura:

*na czczo od północy, i.v. Kaniula

*insulina i.v 0,15 j.m/kg

*pobieranie - krew na glukozę i GH po 0, 30, 45, 60, 90 i 120 minutach

-interpretacja:

*odpowiedź prawidłowa- wzrost stężenia GH w osoczu do 20 ng/ml lub wyżej po 30-90 minutach

*stężenie glukozy musi być poniżej 2,2 mmol/l w celu wywołania stresu hipoglikemicznego

Prolaktyna

-polipeptyd wydzielany przez przedni płat przysadki

-wydzielanie hormonu nie podlega ujemnemu sprzężeniu zwrotnemu

*hamowanie wydzielania przez dopaminę (PIH)

*stymulacja wydzielania przez TRH, insulinę, hipoglikemię, ciążę stres fizyczny, emocjonalny, stosunek płciowy, mocznicę, karmienie piersią, niektóre leki (szczególnie metaklopramid), sen, laktację, estrogeny, orgazm, posiłek białkowy

Prolaktyna PRL

-działanie- produkowana w czasie ciąży i laktacji

*wywołuje i podtrzymuje laktację

*hamuje wydzielanie GHRH → brak owulacji i cyklu miesiączkowego

-nadczynność jest wywoływana przez

*zmniejszenie hamowania ( ↓ dopaminy)

*gruczolak przysadki (prolaktynoma)

*hiperprolaktynemia funkcjonalna

*pierwotna niedoczynność tarczycy (wtórna hiperprolaktynemia)

-kliniczne objawy hiperprolaktynemii

*kobiety → galaktorrhea, amenorrhea, spadek libido, hirsutyzm

*mężczyźni → hipogonadyzm, ginekomastia, spadek libido, impotencja, galaktorrhea

Stężenie prolaktyny w surowicy

-korelacja pomiędzy wielkością guza a wydzieleniem PRL

*10x PRL → prolaktynoma

*5-10x PRL → wysokie prawdopodobieństwo prolaktynomy

*<5x PRL → należy wykonać test

Objawy towarzyszące:

-bóle głowy

-utrata wzroku

Test z metaklopramidem:

-prawidłowo 3-6 krotny wzrost stężenia PRL po stymulacji

-wyższy wzrost - hiperprolaktynemia funkcjonalna

-podwyższone wydzielanie podstawowe i po stymulacji - hipertrofia komórek laktotropowych

-niskie wydzielanie podstawowe i brak wzrostu po stymulacji- hipoprolaktynemia

-podwyższone wydzielanie podstawowe i brak wzrostu po stymulacji- prolaktynoma

Zaburzenia czynności przysadki

1.niedoczynność

-monohipopituitaryzm- niedobór jednego hormon (najczęściej GH)

-panhipopituitaryzm- niedobór wielu hormonów występujących w przysadce w przypadku zniszczenia przysadki w wyniku urazu czaszki, krwotoku lub martwicy np.: po wstrząsie okołoporodowym

2.nadczynność- rzadka, najczęściej dotyczy GH

Tarczyca

-gruczoł tarczycy składa się z 2 płatów połączonych cieśnią i położonych po obydwu stronach krtani

Funkcja tarczycy:

-wspomaga wzrost i rozwój, szczególnie u osób młodych (wyższe stężenia rozkojarzają oksydatywną fosforylację - ↑temperatury ciała)

-pomaga utrzymać równowagę energetyczną metabolizmu. Wzrost ilości i wielkości mitochondriów, zwiększenie aktywności enzymów łańcucha oddechowego, wzrost aktywności

Na⁺/K⁺ATPazy (przyspiesza transport Na, K, Ca) nadmiar hormonów działa katabolicznie na przemianę białkową i lipidową

-działa pobudzająco na prawidłową funkcję komórek (także na mięsień sercowy)

Synteza hormonów tarczycy

-T4- jest metabolizowana do T3 w tkankach obwodowych poprzez mechanizm dejodynacji T4 (30-40%)

-T3 jest syntetyzowana bezpośrednio w tarczycy (20%) lub tkankach obwodowych poprzez dejodynację T4 (80%)

-T3 jest 3-4x silniejsza w działaniu niż T4

-rT3- syntetyzowana obwodowo w wątrobie i nerkach poprzez dejodynację T4 i konwersję T3

-rT3 jest biologicznie nieaktywna - wzrasta w ostrych chorobach niektórych narządów (odwrotna trójjodotyronina)

T3 i T4

-we krwi (>90%) transportowane przez białka osocza

*globulina wiążąca tyroksynę TBG → 75%

*prealbumina wiążąca tyroksynę TBPA → 15%

*albumina TBA → 10%

-wolna T3 i T4 nie jest związana z białkami

*fT4 → 0,03% całkowitej T4

*fT3 → 0,3% całkowitej T3

-wolne hormony tarczycy są formami aktywnymi których stężenie jest regulowane przez ujemne sprzężenie zwrotne

-mediatorem ujemnego sprzężenia zwrotnego jest fT3

	Stężenie całkowite w osoczu nmol/l	Norma w osoczu pmol/l	Wiązanie z białkami	Połowiczny okres rozpadu (dni)
T4	60-150	9-26	????????	6-7
T3	1,0-2,9	3-9	?????????	??????

Ocena funkcji tarczycy

poziom TSH

Wysoki	Pierwotna niedoczynność	Subkliniczna niedoczynność	Wtórna nadczynność
Prawidłowy	---------------------------	eutyreoza	--------------------------
Niski	Wtórna niedoczynność	Subkliniczna nadczynność	Pierwotna nadczynność
	Niski	Prawidłowy	Wysoki

Poziom hormonów tarczycy

Traczyca

niedoczynnść	TSH	fT4	fT3
jawna	↑↑	↓	↓/N
subkliniczna	↑	N	N
wtórna	↓	↓	↓/N
nadczynność
Jawna	↓↓	↑↑	↑↑
subkliniczna	↓	N	N
T3-tyreotoksykoza	↓↓	N	↑

WYKŁAD 9 XII 2009

Test z TRH

-test z TRH ocenia wzrost stężenia TSH w osoczu po podaniu TRH

-test ten jest przydatny:

*do różnicowania pomiędzy podwzgórzową i przysadkową wtórną niedoczynnością tarczycy

*w diagnostyce łagodnej tyreotoksykozy kiedy wyniki innych testów są niejenoznaczne

*w diagnostyce różnicowej zaburzeń sekrecji TSH szczególnie przy podejrzeniu adenomy

Rysunek

Przeciwciała przeciwtarzczycowe:

1.choroby tarczycy mogą być wynikiem zaburzeń autoimmunologicznych (produkcja przeciwciał przeciwko tarczycy)

*przeciwciała przeciwmikrosomalne (Mic, MicAb)

*przeciwciała przeciwtyreoperoksydazie (TPO, TPOAb)

*przeciwciała przeciwtyreoglbulinowe (Tg, TgAb)

*przeciwciała przeciwreceptorowe TSH (TRAb)

I.TPOAb są bardziej specyficzne niż MicAb i mają wyższą czułość diagnostyczną niż TgAb

przeciwciała przecwtarczycowe

przeciwciało	choroba
Immunoglobulina stymulująca receptor TSH	Choroba Gravesa-Basedowa
Przeciwko tyreoperoksydaznie	ch. Hashimoto (zapalenie, 90%) ch. Gravesa-Basedowa (70-90%)
Przeciwko tyreoglobulinie (TgAb)	ch. Hashimoto (90%) ch. Gravesa-Basedowa (50%) inne zapalenia tarczycy (10-20%)

TPOAb → najczulszy test do wykrywania autoimmunologicznych chorób tarczycy, najczęściej w wykrywaniu niedoczynności w przebiegu choroby Hashimoto (zapalenia)

Zaburzenia funkcji tarczycy

-nadczynność : choroba Gravesa-Basedowa

-przyczyny: zaburzenia immunologiczne, genetyczne, nowotworowe, inne

-Objawy:

*tachykardia

*senność

*potliwość

*osłabienie

*drżenie nóg

*utrata wagi

*utrata włosów

*zmiany skórne

*zwiększona perystaltyka jelit

*wole

*wytrzeszcz

*zaburzenia miesiączkowania

Niedoczynność

-jest przyczyną ogólnego spowolnienia funkcji organizmu. Kobiety chorują częściej. Także 1 na 4 tysiące noworodków rodzi się z niedoczynnością tarczycy. Jeżeli dziecko nie będzie leczone to nastąpi niedorozwój umysłowy i fizyczny.

Objawy u dorosłych:

*uczucie osłabienia

*uczucie zimna

*senność w ciągu dnia

*osłabienie pamięci

*ochrypły głos

*sucha i szorstka skóra

*nadmierne krwawienia miesiączkowe

*zwolnienie akcji serca

*trudności w koncentracji

*przyrost masy ciała

*rzadkie włosy

*uczucie depresji

*niepłodność

Choroby tarczycy

-niedoczynność (najczęściej występujące zaburzenie funkcji)

*niedobór jodu

*wole endemiczne

*kretynizm

*choroba Hashimoto (zapalenie tarczycy)

-nadczynność (tyreotoksykoza)

*choroba Gravesa-Basedowa

*T3-tyreotoksykoza 10-15%

*nadczynność subkliniczna

*tyrotoksykoza ciężarnych

Choroby pozatarczycowe z towarzyszącą zmianą stężenia hormonów tarczycy

-nowotwory tarczycy

*przerosty łagodne

*nowotwory złośliwe

Pierwotna niedoczynność traczycy

-przyczyny

*choroby autoimmunologiczne

+zapalenie tarczycy - choroba Hashimoto

*leczenie choroby Gravesa-Basedowa

*wrodzone

+hipoplazja szpiku

Choroba Gravesa-Basedowa (5:1 kobiet do mężczyzn)

-główna przyczyna- choroba autoimmunologiczna

*przeciwciała tarczycowe zazwyczaj stymulujące

*w 90% przeciwciała przeciwko receptorowi TSH

*objawy zależne od przeciwciał stymulujących receptor TSH

*często wytrzeszcz

*naciekowa oftalmopatia

Choroba Hashimoto

-przewlekłe limfocytarne zapalenie tarczycy

-główna przyczyna niedoczynności tarczycy (u 95% kobiet)

-choroba autoimmunologiczna → w 90% przeciwciała przeciwtarczycowe TPOAb

-często wole występuje

Nadnercza

Mineralokortykoidy → wydzielane przez warstwę kłębkową w odpowiedzi na działanie systemu renina-angiotensyna-aldosteron RAA (antagonista ADH )

-aldosteron !!

-kortykosteron

Glukokortykosteroidy → wydzielane przez warstwę pasmowatą, pod wpływem ACTH (sterowanie przez przysadkę)

-kortyzol

-bez(dez)oksykortyzol ???

Choroba Cushinga- nadczynność ( wzrost glukokortykosteroidów)

Test

-oznaczanie kortyzolu

-test z oksametanonem (hamuje produkcję kortyzolu)

Synteza katecholamin - rdzeń nadnerczy

tyrozyna → DOPA → dopamina → noradrenalina → adrenalina

rysunek

Oznaczanie w moczu kwasu wanilino-migdałowego jako metabolitu katecholamin. Obecnie odchodzi się od tej metody

Męskie hormony płciowe

-testosteron

-androstendion

-DHEA- dehydroepiandosteron

-DHEAS - siarczan dehydroepiandosteronu

Kora nadnerczy (warstwa siateczkowata) jest także źródłem androgenów (androstendion, DHEA, DHEAS). Wydzielanie nadnerczowych androgenów może być u kobiet przyczyną poważnych zaburzeń hormonalnych

rysunek

Zespół nadnerczowo-płciowy

*grupa wrodzonych zaburzeń będących wynikiem niedoboru enzymów związanych z syntezą nadnerczowych hormonów steroidowych

-ostrość objawów zależy od miejsca bloku enzymatycznego i stopnia niedoboru enzymu

-całkowity brak enzymu nie daje szans na przeżycie

*wrodzony przerost nadnerczy spowodowany stymulacją przez ACTH

-spadek produkcji kortyzolu, wzrost stężenia ACTH i pośrednich produktów syntezy steroidów

Spadek wydzielania hormonów u mężczyzn

-DHEA - androgenoza

-GH, IGF-1 → somatopauza

-melatonina → melatoninopauza

-testosteronu → andropauza

Ocena wydzielania testosteronu

-ocena hirsutyzmu i wirilizacji u kobiet

-u mężczyzn ?????

Wydzielanie androgenów u kobiet

	nadnercza	jajniki
testosteron	0,04	0,02
androstendion	7	3
DHEA	24	3
DHEAS	17	0

Żeńskie hormony płciowe

-estradiol

-progesteron

Regulacja wydzielania:

podwzgórze---GnRH-- → przysadka ---LH, FSH-- → pęcherzyk Graffa--- → jajeczkowanie--- → ciałko żółte--- → progesteron ↓

estradiol --- (+)-- → podwzgórze

Ocena stężenia estradiolu

-diagnostyka różnicowa braku miesiączki

-diagnostyka przedwczesnego dojrzewania u dziewcząt

-ocena dojrzałości pęcharzyka

-ocena ginekomastii

-wskazania prognostyczne w zapłodnieniu pozaustrojowym

hCG → ludzka gonadotropina kosmówkowa

-hCG służy do podtrzymywania produkcji progesteronu przez ciałko żółte we wczesnym okresie ciąży

-hCG stymuluje rozwój gonad płodu i syntezę androgenów w jądrach płodu

-nie ciężarne kobiety <5mIU/ml

-3-4 tydzień 500-6000 tys mIU/ml

-podwyższony poziom może wskazywać na obumieranie płodu, niepełne poronienie lub zagrażające poronieniu

WYKŁAD 9 XII 2009

Markery nowotworowe

Nowotwory najczęściej stają się wykrywalne kiedy liczba komórek sięga miliarda (ok. 1g - 0,5-1cm średnicy). Liczba biliona komórek jest z reguły zabójcza (ok.1kg)

Marker nowotworowy - definicja

-substancja produkowana przez komórki nowotworowe lub pod wpływem tych komórek przez komórki zdrowe ale pod warunkiem że w znaczących ilosciach

Zastosowanie:

-podstawową dziedziną wykorzystywania markerów jest monitorowanie przebiegu choroby.

-ocena efektywności leczenia pierwotnego

-kontrola chorego po zakończeniu leczenia lub w celu wykrycia wznowy i/lub odległych przerzutów

-monitorowanie leczenia uzupełniającego

-ocena reakcji na leczenie

Markery nowotworowe są odbiciem trzech podstawowych procesów zachodzących w komórkach nowotworowych:

-proliferacja

-różnicowanie

-śmierć komórki (nekroza lub apoptoza)

Markery śmierci komórkowej

-apoptoza lub nekroza powodują uwalnianie produktów rozpadu komórek i powoduje wzrost ich stężenia w osoczu i innych płynach ustrojowych

TPA i CYFRA21-1 są przykładami markerów śmierci komórkowej

Markery różnicowania komórkowego

*stężenie markerów jest odbiciem masy żywych komórek nowotworowych. Większość markerów posiada tą cechę: (najczęściej oznaczane)

-AFP

-CA 15-3

-CA 125

-CA 19-9

-CEA

-PSA

Proliferacja komórek nowotworowych

-stężenie markerów należących do tej grupy są funkcją szybkości podziału komórek. Takim markerem jest TPS który powstaje w późnym okresie fazy S, po zakończeniu syntezy DNA oraz w fazie G2 i jest uwalniany z komórek podczas mitozy oraz tuż po jej zakończeniu

markery nowotworowe

komórkowe krążące

Podział markerów nowotworowych

1.tkankowe markery nowotworowe → wykrywane na powierzchni lub w cytoplazmie komórek nowotworowych

2.humoralne → wykrywane we krwi lub innych płynach ustrojowych

3.krążące

4.neoantygeny, hormony, antygeny towarzyszące nowotworom, nieswoiste markery nowotworowe

Antygeny towarzyszące nowotworom

-komórki nowotworowe mogą uzyskiwać zdolność wytwarzania substancji których synteza w komórkach macierzystych ma miejsce tylko na określonych etapach organogenezy i zostaje zablokowana w komórkach dojrzałych np.: antygeny płodowo-zarodkowe (CEA, AFP), antygeny łożyskowe (hCG), antygeny transplantacyjne (CA 19-9, CA 125)

5.enzymy i izoenzymy

6.cytokiny, receptory cytokin, ferrytyna

Klasyfikacja markerów nowotworowych

*antygeny płodowo zarodkowe

-antygen karcinoembrionalny (CEA)

-alfa-fetoproteina (AFP)

*antygeny łożyskowe

-ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG, β-hCG)

-ludzki laktogen łożyskowy (HPL)

*enzymy i izoenzymy

-kwaśna fosfataza sterczowa (PAP)

-specyficzny antygen sterczowy (PSA)

-swoista enozlaza neuronowa (NSE)

-kinaza kreatynowa (CK) i izoenzymy (CK-BB)

-fosfataza alkaliczna (ALP)

-izoenzym łożyskowy ALP (PALP)

-izoenzym kostny ALP (bALP)

-dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

-lizozym (muramidaza)

Klasyfikacja markerów c.d

*markery klasyczne

-CA 125

-CA 15-3

-CA 19-9

-CA 50

-CA 72-4

-CYFRA 21-1

-SCC

-TPA

-TPS

*hormony

-adrenokortykotropowy (ACTH)

-antydiuretyczny (ADH)

-ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)

-kalcytonina

-tyreotropowy (TSH)

-parathormon (PTH)

-erytropoetyna (

*receptory hormonów steroidowych

-receptor estrogenów i progesteronu

-receptor androgenów

-receptor kortykoidów

*immunoglobuliny monoklonalne

-IgG, IgA, IgM, IgD, IgE

-łańcuchy lekkie kappa i lambda

*immunofenotypowanie

-komórki limfoidalne

-komórki mieloidalne

*analiza DNA

*diagnostyka molekularna

Cytokiny → nowa grupa markerów. W przebiegu chorób nowotworowych wykazano wzmożoną ekspresję genów kontrolujących produkcje cytokin

Cytokiny syntetyzowane w komórkach nowotworowych i uwalniane do krwi:

-prozapalne ( IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α)

-inhibitory przeciwzapalne (IL-10, IL-1, RA)

-wolne receptory (sTNF R1, sTNF RII, sIL-2Ra)

-cytokiny krwiotwórcze (SCF, IL-3, GM-CSF, G-CSF, M-CSF)

-cytokiny proangiogenne (VEGA, bFGF, HGF)

-chemokiny (IL-8)

-inne (GGF)

Antygen karcinoembrionalny (CEA)

-glikoproteina powierzchniowa

-znajdowana na komórkach nabłonka przewodu pokarmowego

-obecny w ekstraktach tkanek nowotworowych od pacjentów z adenokarcinomą przewodu pokarmowego

-nazwa wynika z obecności w tkankach nowotworowych i embrionalnych

-specyficzny i czuły w diagnostyce raka jelita grubego i innych nowotworów

-podwyższony w surowicy u palaczy tytoniu

Alfafetoproteina (AFP)

-glikoproteina jednołańcuchowa ściśle związana z albuminami

-syntetyzowana w wątrobie, pęcherzyku żółciowym, przewodzie pokarmowym płodu.

-poziom AFP jest podwyższony u pacjentów z rakiem wątroby (głównie), jajnika i jąder

-antygen onkofetalny wykryty w surowicy ludzkiej w 1956 r.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG, βhCG)

-heterolimer ????? zbudowany z podjednostki α i β

-podjednostka α jest wspólna dla innych hormonów glikoproteinowych

-podczas ciąży hCG jest syntetyzowane w komórkach syncytiotrofoblastów łożyska

-znacznie podwyższone stężenie w ciąży

-βhCG jako marker nowotworowy jest użyteczna w diagnostyce ciążowej choroby trofoblastycznej , kosmówczaka, zlokalizowanych w łożysku guzów trofoblastycznych

-przydatna także do określania topnia zaawansowania i monitorowania zarodkowych guzów (nowotworów) jajnika i jąder

-podwyższony poziom hCG był również obserwowany w raku jajnika, piersi, czerniaku, nowotworach przewodu pokarmowego, mięsakach, raku płuc i nerek

Ludzki laktogen łożyskowy (HPL)

-hormon trofoblastyczny produkowany przez syncytiotrofoblastyczne komórki łożyska

-HPL ma właściwości laktogenne

-obecny w surowicy ciężarnych kobiet i użyteczny jako wskaźnik funkcji łożyska i stanu płodu

-podwyższony poziom jest związany z nowotworami trofoblastycznymi, zarodkowymi, gonadalnymi lub pozagonadalnymi.

Fosfataza alkaliczna (ALP)

-przydatna do wykrywania pierwotnych i przerzutowych nowotworów wątroby i kości

-zmiany osteoblastyczne w kościach spowodowane przerzutami raka prostaty oraz osteosarkoma dają bardzo wysokie wzrosty aktywności ALP

-zmainy osteolityczne spowodowane przerzutami raka płuc do kości powodują umiarkowany wzrost aktywności ALP (możliwy jest brak wzrostu)

-aktywność ALP rośnie w przebiegu cholestazy

-źródło podwyższonej aktywności ALP (wątroba lub kości) może być określone przez pomiar innych enzymów wątrobowych takich jak GGT i 5`NU (enzymy ekskrecyjne)

Izoenzym kostny ALP (bALP)

-uwalniany przez aktywne osteoblasty (marker kościotworzenia)

-wzrost aktywności w nowotworach kości pierwotnych i przerzutowych

-wzrost aktywności w dzieciństwie w okresie dojrzewania, w nadczynności przytarczyc, osteomalacji, akromegalii

Łożyska ALP (PALP)- izoenzym łożyskowy

-izoenzym ALP syntetyzowany przez komórki trofoblastyczne łożyska

-obecny w surowicy kobiet ciężarnych

-zidentyfikowany w 1968 r. przez Fishmanna, w surowicy i tkance nowotworowej pacjenta (izoenzym Regena)

Kwaśna fosfataza sterczowa (PAP)

-jeden z pierwszych testów laboratoryjnych użytecznych w diagnozowaniu raka (odkryty 50 lat temu)

-produkowany głównie przez gruczoł krokowy

-znaleziony także w kościach, wątrobie, śledzionie i nerkach

PSA

-enzym-proteaza serynowa wydzielana przez komórki nabłonkowe prostaty

-PSA we krwi występuje jako wolny i związany z inhibitorami proteazy serynowej (antychymotrypsyną i α2-makroglobuliną)

-PSA jest narządowo specyficzny (nie nowotworowo)

-Cut-off = 4ng/ml, od 4-10 ng/ml ← zmiany łagodne

-stosunek wolne PSA/całkowite PSA mniejszy niż 0,1 (10%) gdy tPSA jest niższe nić 4ng/ml- sugeruje obecność raka prostaty

-stosunek fPSA/tPSA mniejszy niż 0,25 (25%) gdy tPSA jest niższy niż 10ng/ml - sugeruje obecność raka

Dehydrogenaza mleczanowa izoenzym 1 (LDH-1)

-LDL-1 znacząco rośnie w nowotworach zarodkowych jąder takich jak teratoma-seminoma ????

Specyficzna enolaza neuronowa (NSE)

-glikolityczny enzym znaleziony w neuronach, komórkach neuroendokrynnych i neurogennych guzach

-marker guzów związanych z systemem neuroendokrynnym takich jak rak drobnokomórkowy płuc, neuroblastoma, karcinoid i rak wysepkowy trzustki

CA 15-3

-CA 15-3 jest wysokocząsteczkową glikoproteiną obecną w nabłonkach przewodów mlecznych znany jako „episjalina”

-podwyższony w surowicy pacjentek z rakiem piersi

-podwyższony u pacjentów z przerzutami raka piersi, trzustki, płuc, jelita grubego i wątroby

CA 125

-glikoproteina, jest antygenem o wysokiej masie cząsteczkowej produkowanym przez komórki nabłonka jajnika

-80% pacjentek z rakiem jajnika ma podwyższony poziom CA 125

-rak trzonu macicy

SCC

-marker z komórek „squamous” szyjki macicy, przełyku, odbytu, karku, szyi

-podwyższony poziom w przebiegu marskości wątroby i zapaleniu trzustki, z niewydolnością nerek. W łagodnych chorobach płuc i narządu rodnego poziom SCC podwyższony u 40% chorych, łagodne schorzenia skóry- wzrost u 80% chorych

-(obszar karku i szyi)

CA 19-9

-sialowany antygen grup krwi Lewis

-podwyższony w rakach jelita grubego, żołądka!!, wątroby, trzustki

-podwyższony także w chorobach takich jak: zapalenie trzustki i cholestaza, zewnątrzwątrobwa marskość wątroby

łączne oznaczenie CA 19-9 i CA 50 nie zwiększa czułości i specyficzności

TAG 72

-glikoproteina, należy do markerów towarzyszących nowotworom

-podwyższone stężenie stwierdzono w gruczolakach przewodu pokarmowego, płuc, jajników oraz gruczołów piersiowych

-jedyny marker wykazujący 100% specyficzność w stosunku do nienowotworowych chorób przewodu pokarmowego (czyli nie występuje)

-charakteryzuje się najwyższa czułością w diagnostyce raka żołądka (w porównaniu z CEA i CA 19-9)

Tkankowy antygen polipeptydowy (TPA)

-TPA jest jednołańcuchowym polipeptydem należącym do rodziny cytokeratyn

-jest syntetyzowany pomiędzy fazą S i M cyklu komórkowego i jest wskaźnikiem złośliwości guza

-wzrost w surowicy pacjentów z nowotworem płuc, piersi, trzustki, jelita grubego i żołądka

Tkankowo swoisty antygen polipeptydowy (TPS)

--marker proliferacji

-stosowany w monitorowaniu leczenia raka jajnika razem z CEA, raka drobnokomórkowego płuc razem z NSE

-wzrost poziomu w wielu stanach zapalnych o etiologii nienowotworowej

Receptory hormonów steroidowych

-oznaczanie receptorów estrogenowych i progesteronowych jest użyteczne w przewidywaniu odpowiedzi na terapię hormonalną pacjentów z rakiem piersi, prostaty i rakiem endometrialnym macicy

Etapy diagnostyki raka żołądka

rozpoznanie			monitorowanie
	czułość	specyficzność	70%
CEA	20-30%	50%
CA 19-9	40-50%	50%
TAG-72	40-50%	100%

WYKŁAD 6 I 2010

Kontrola jakości

Metody kontroli jakości:

1.polegają na ocenie statystycznej

2.nie ma możliwości kontroli jakości poszczególnych wykonywanych analiz

3.jakość pracy w laboratorium kontroluje się przez stosowanie prób kontrolnych

4. „metoda próbek kontrolnych” polega na włączeniu próbek kontrolnych do serii badań próbek pacjenta. Uzyskany wynik porównuje się z wartością odniesienia i przyjętą dopuszczalną granicą błędu

5.wewnątrzlaboratoryjna kontrola jakości powinna wskazywać na rodzaj popełnianego błędu

6.kontrola może mieć charakter:

*prospektywny

*retrospektywny

Kryteria oceny wyników prób kontrolnych zostały wprowadzone w latach 70-tych przez Westgarda. Określił on prawdopodobieństwo wykrycia rzeczywistego błędu oraz prawdopodobieństwo fałszywego odrzucenia poprawnego wyniku.

Etapy kontroli jakości:

1.ustalenie własnych granic kontrolnych ( limitów kontrolnych) poprzez wykonanie pomiarów wstępnych (faza wstępna lub przygotowawcza)

2.wykonanie pomiarów kontrolnych

3.porównanie wyników kontroli z ustaloną dopuszczalną granicą błędu (limitem kontrolnym)

4!!!!!!decyzja o akceptacji lub odrzuceniu wyników kontroli = decyzja o akceptacji lub odrzuceniu wyników pacjenta !!!!!!!

Faza wstępna kontroli jakości badań- wymagania

1.minimalna liczba pomiarów wstępnych w materiale kontrolnym nie powinna być mniejsza niż 20

2.minimalny czas pomiarów wstępnych nie powinien być krótszy niż 10 dni

3.badania biochemiczne należ kontrolować przy pomocy co najmniej 2 różnych materiałów kontrolnych, a badania hematologiczne, koagulologiczne, immunochemiczne, gazometryczne- przy pomocy 3 materiałów kontrolnych.

!!!wymagane jest aby kontrolować metodę w zakresie pomiarowym.!!!

Kontrola jakości wyników:

probówki materiału kontrolnego mogą być dołączone do serii pomiarowej w różny sposób:

a0na początku lub na końcu serii

b)na początku i na końcu serii pomiarowej tzw: ujęcie w nawiasach

c)równomierne rozmieszczenie co „n” próbek

d)rozrzucone przypadkowo w serii

Materiał kontrolny

1.Międzynarodowa Federacja Chemii Klinicznej i Medycyny Laboratoryjnej (JFCC) definiuje materiał kontrolny jako próbkę, którą analizuje się wyłącznie do celu przeprowadzenia kontroli jakości. Próbka taka nie może służyć do kalibracji

2.stężenie w probówkach kontrolnych powinno dostarczać informacji ważnych medycznie lub analitycznie. Niemożliwe jest kontrolowanie metody w całym zakresie pomiarowym

→ z analitycznego punktu widzenia- w punktach gdzie zaczyna się i kończy liniowość metody

→ z medycznego punktu widzenia- w punktach przy których podejmowane są decyzje medyczne np.: o podaniu leku, przeszczepieniu nerek, wykonaniu operacji, decydujących o rozpoznaniu

Obowiązek kontroli jakości

Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 III 2006r.

-określa standardy jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych w zakresie czynności laboratoryjnych diagnostyki medycznej, ocena ich jakości i wartości diagnostycznej oraz laboratoryjnej interpretacji i autoryzacji wyników

-każdy rodzaj oznaczenia wykonywanego przez laboratorium podlega stałej kontroli jakości wyników badań: wewnątrzlaboratoryjnej i międzylaboratoryjnej

-laboratorium opracowuje procedury wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości wyników, w których określane są:

*rodzaj materiałów kontrolnych

*częstotliwość i forma tej kontroli

*metody oceny błędów przypadkowych i systematycznych

*kryteria akceptacji i zasady postępowania w przypadku dyskwalifikacji wyników kontrolnych z uwzględnieniem zaleceń COBJwDL (Centralnego Ośrodka Jakości w Diagnostyce Laboratoryjnej)

-za prowadzenie programów kontroli jakości odpowiada kierownik laboratorium lub wyznaczony przez niego pracownik

-laboratorium stosuje materiały kontrolne o różnych poziomach ocenianego składnika

-każdy nie mianowany materiał kontrolny podlega wyznaczeniu wartości umownie należnych oraz rozproszenia uzyskanych wyników

-w przypadku gdy nie są dostępne materiały kontrolne (lub jest ich brak) co jest poświadczone przez wytwórców tych materiałów (lub autoryzowanego przedstawiciela). Minimalną formą kontroli jakości wyników jest kontrola powtarzalności z użyciem próbek pacjenta.

-laboratorium kontroluje wielkość błędu systematycznego nie rzadziej niż raz w miesiącu oraz przy każdej możliwości jego wystąpienia a w szczególności gdy zmieni się seria odczynnika, kalibracja, pojawi się sygnał ostrzegawczy.

-Laboratorium prowadzi dokumentację kontroli wewnątrzlaboratoryjnej w której odnotowuje się:

-wynik oznaczeń

-przekroczenia dopuszczalnych błędów

-podjęte działania korygujące, naprawcze, zapobiegawcze

-Laboratorium bierze stały udział w podstawowych programach kontroli jakości organizowanych przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Laboratoryjnej. Dla badań nie objętych tymi programami, laboratorium bierze udział w innych programach krajowych lub międzynarodowych.

!laboratorium poddaje się kontroli międzylaboratoryjnej wyłącznie wyniki uzyskane na własnej aparaturze pomiarowo-badawczej oraz używając wyrobów medzycznych wymienionych w procedurze metody.!

-Dokumentacja kontroli jakości wyników badań jest przechowywany co najmniej przez 10 lat

-Kontrola wewnątrzlaboratoryjna nie jest w pełni obiektywna !!!

Cechy wynika ilościowego

1.każdy wynik laboratoryjny jest potencjalnie obarczony błędem.

2.błędów nie można wyeliminować całkowicie

3.błędy należy określić, zminimalizować i kontrolować czy są utrzymywane w dopuszczalnych granicach

4.błędy obciążające wynik można podzielić na:

-błędy przedlaboratoryjne

-błędy analityczne (laboratoryjne)

Błędy przedanalityczne:

-błędy przedlaboratoryjne- powstają w wyniku zmian materiału biologicznego w czasie pobrania, przechowywania i transportu materiału biologicznego oraz z niewłaściwego przygotowania pacjenta.

-źródła tych błędów są często niezależne od laboratorium ale ich skutki obciążają laboratorium

W celu uniknięcia tych błędów laboratorium opracowuje następujące procedury:

-procedury pobierania materiału do badań

-procedury transportu materiału do laboratorium

-procedury przyjmowania, rejestrowania i wewnątrzlaboratoryjnego oznakowania materiału do badań

-procedury przechowywania materiału do badań

Błędy analityczne

-błędy przypadkowe (precyzji)

-błędy systematyczne (poprawności)

-błędy trywialne (omyłki, gruby błąd)

Omyłki -błędy trywialne

-błędy trywialne dotyczą najczęściej identyfikacji próbki lub pacjenta (tzw: omyłki urzędnicze). Mogą powstawać także w wyniku odstępstw od procedur analitycznych. Poprawa organizacji i dyscypliny pracy w znacznym stopniu eliminuje te błędy.

WYKŁAD 13 I 2010

Błędy pomiaru

wartość zmierzona = wartość prawdziwa + wartość pomiaru

Dwa składniki:

-błąd przypadkowy

-błąd systematyczny

Błąd przypadkowy:

-błąd przypadkowy to różnica pomiędzy wynikiem pomiaru a średnią z wielokrotnych oznaczeń tego samego składnika w tym samym homogennym materiale, uzyskanych w porównywalnych warunkach. Ta różnica jest spowodowana nieodtwarzalnością czyli zmiennością każdego elementu oznaczenia a więc odmiennej objętości próbki i odczynników, mieszania, temperatury, odczytu. Te różnice powodują, że szereg pomiarów wykonanych w tym samym materiale różni się wartościami uzyskanych wyników

Błędy przypadkowe

*zbiór wyników będących rezultatem błędów przypadkowych powinien mieć rozkład normalny (zgodny z symetryczną krzywą Gausa). Miarą błędów przypadkowych jest odchylenie standardowe wyników rozproszonych wokół wartości średniej, czyli współczynnika zmienności (Wz lub CV)

*błędy przypadkowe mają charakter losowy nie są ukierunkowane. Wykonanie tej samej czynności może być obarczone raz błędem dodatnim a innym razem ujemnym. Wielkość tych błędów nie jest stała. Błędów precyzji nie można wyeliminować, można je jednak określić i zmniejszyć .

*błąd przypadkowy nie wpływa na wartość średniej, lecz na dystrybucję tej średniej.

Błędy przypadkowe - błędy precyzji

-dyspresja wyników wokół wartości średniej nazywana jest precyzją. Według definicji precyzja to zgodność wyników wielokrotnych pomiarów badanej cechy w tym samym materiale uzyskanych w określonych warunkach. Ilościowo oceniany jest rozrzut (rozproszenie) uzyskanych wyników a więc nieprecyzyjność- poprzez Wz. czynników generujących błędy przypadkowe jest wiele. W praktyce laboratoryjnej wyznacza się i kontroluje precyzję:

-w jednej serii analitycznej → powtarzalność

-w różnych seriach analitycznych → odtwarzalność

Kontrola precyzji

materiał użyty do kontroli precyzji może mieć nieznane stężenie badanej substancji. Jest to materiał niemianowany

Powtarzalność jest to zgodność wyników oznaczeń w tej samej próbce w jednej serii pomiarów (przy wykorzystaniu tego samego systemu kalibracyjnego). Inaczej jest to precyzja w serii jednoczesnej.

Odtwarzalność jest to zgodność wyników oznaczeń w tej samej próbce w różnych dniach, przy kolejnych kalibracjach układu pomiarowego. Inaczej jest to precyzja w serii niejednoczesnej.

Kontrola odtwarzalności

prowadzenie kontroli odtwarzalności jest obligatoryjna (obowiązkowa).

Karty kontrolne mogą mieć postać liczbową lub graficzną. Graficzna prezentacja karty kontroli odtwarzalności ma najczsciej postać wykresu Levey`a-Jenningsa. Możliwa jest manualna lub komputerowa wersja tych kart,

Reguły Westgarda:

*reguła 1_2S

jeden punkt przekracza 2 odchylenia standardowe → 4,5% wyników może znajdować się poza 2S i jeszcze jest dobrze- jeśli nie występują te punkty kolejno. Wykrywa błędy przypadkowe.

*reguła 1_3S

wykrywa duże błędy przypadkowe, jeden wynik przekracza 3S → 0,3%

*reguła 2_2S - w serii

dwa kolejne wyniki w serii przekraczają 2 odchylenia standardowe po tej samej stronie średnicy (2S), stosuje się w serii → wykrywa błąd przypadkowy ale równie dobrze systematyczny

*regułą 2_2S - pomiędzy seriami

pomiedzy seriami (dziś i np.: jutro), wykrywa błąd systematyczny

*reguła R_4S - serii

różnica dwóch kolejnych oznaczeń między dwoma kolejnymi oznaczeniami ???????? wykrywa duże błędy przypadkowe

*reguła R_4S - pomiędzy seriami

*reguła 4_1S - w serii

cztery kolejne wyniki oznaczeń przekraczają 1S po tej samej stronie średniej ( jeśli w serii to w 4 probówkach 1 punkt przekracza 1S) - błąd systematyczny

*reguła 4_1S - pomiędzy seriami- błąd systematyczny, 4 kolejne oznaczenia w tym samym materiale przekraczają 1S

*regułą 4_1S - w serii i pomiędzy seriami

mamy 2 materiały kontrolne w jednej serii, 2 wyniki przekraczają 2S i w drugiej serii też 2 wyniki przekraczają 2S. Wykrywa błąd systematyczny

*reguła 10x- w seriach

10 kolejnych wyników przekracza 1S- średnią po tej samej stronie średniej

wykrywa błąd systematyczny

*reguła 10x - w serii i pomiędzy seriami

mamy dwa materiały kontrolne, i tak np.: w jednym 5 wyników przekracza 1S i w drugim 5

Każda z tych reguł stosowana oddzielnie to reguła prosta.

Algorytm reguł Westgarda

↓

1_2S ----nie → wynik pod kontrolą

↓tak

1_3S-----nie → 2_2S ---nie → R_4S --- nie → 4_1S ---nie → 10x

↓tak ↓tak ↓tak ↓tak ↓tak

wynik poza kontrolą

(reguła złożona)

Ocena reguł interpretacyjnych

*prawdopodobieństwo wykrycia błędu (PED ?????)

-powinno wynosić 100%

-w praktyce przyjmuje się, że reguła powinna wykrywać co najmniej 90% błędów systematycznych, oraz 80% błędów przypadkowych

*prawdopodobieństwo fałszywego odrzucenia - PFR

-powinno wynosić 0%

-w praktyce przyjmuje się, że nie powinno przekraczać 5%, im więcej materiałów kontrolnych tym PFR bardziej rośnie.

Metody kontroli powtarzalności

2 metody oceny:

1.metoda klasyczna → polega na wykonaniu w materiale kontrolnym nie mniej niż 20 oznaczeń określonego składnika. Ocenia się rozproszenie uzyskanych wyników jako Wz. ten sposób jest kosztowny i uciążliwy, dlatego nie wykorzystuje się go do codziennej kontroli jakości.

2.metoda oznaczeń równoległych dubletów → wykorzystuje się dwa równoległe oznaczenia materiału klinicznego lub próbek pacjenta. Dobór próbek oznaczanych podwójnie powinien być przypadkowy. Każdy z pomiarów potencjalnie obarczony jest błędem przypadkowym.

Kontrola powtarzalnosci

!!!-jest podstawową formą kontroli dla oznaczeń dla których nie dysponuje się trwałym materiałem kontrolnym!!!

Błędy precyzji:

wymagania odnośnie błędów precyzji są różne ale zawsze posługują się pojęciem błędu dopuszczalnego lub dopuszczalnej granicy błędu

1.z zakresu wartości - reguła Tonksa

BD = ZWZ = 0,25* zakresu normy/średnią wartość normy

2.ze zmienności biologicznej

a)w serii jednoczesnej- nie większy od połowy średniej zmienności wewnątrzosobniczej

C_v ≤0,5C_vW (precyzja pożądana)

C_v ≤ 0,75C_vW (precyzja minimalna)

C_v ≤0,25 C_vW (precyzja optymalna)

b)w serii niejednorodnej- nie większy od połowy średniej zmienności wewnątrzosobniczej i międzyosobniczej

C_v = 0,5 pierwiastek z (C²_vW + C²_vm )

3.na podstawie aktualnego poziomu analityki- na podstawie badań między laboratoryjnych ustala się wymagania którym sprostało np.: 20% najlepszych laboratoriów

4.na podstawie opinii grupy ekspertów działających w upoważnionych organizacjach

5.na podstawie opinii klinicystów- nie są to wysokie wymagania, ponieważ doświadczenie ?????

WYKŁAD 20 I 2010

Kontrola poprawności

podstawowym warunkiem eliminacji lub ograniczenia błędów systematycznych jest poprawna kalibracja. Dlatego najważniejszą sprawą jest wiarygodność kalibratora. Najczęściej nie dysponujemy surowcami kontrolnymi z wyznaczoną wartością referencją lub definitywną lecz z wartościami tzw: „należną” wyznaczoną w sprawdzianach międzylaboratoryjnych.

!!! Jeżeli nasz system analityczny (aparat-metoda-odczynnik-kalibrator) jest identyczny jakim producent posłużył się do wyznaczania wartości należnej to możemy używać tych surowic do kontroli poprawności naszej metody !!!

Kontrola poprawnosci

Błąd poprawności jest stały. Powoduje stałe systematyczne zawyżanie (błąd dodatni) lub zaniżanie wyników badań (błąd ujemny)

Błąd systematycznych- wpływa na położenie wartości średniej, lecz nie wpływa na dystrybucję

-podstawowym warunkiem eliminacji lub ograniczenia błędów systematycznych jest poprawna kalibracja

-najczęstszą przyczyną błędów systematycznych jest nierównocenność (niekompatybilność) wzorców (kalibratorów) i próbek kontrolnych oraz próbek pacjentów (wpływ podłoża tzw: matrix)

Kontrola poprawności

rozróżniamy dwa rodzaje błędów systematycznych:

-laboratoryjny - niewłaściwy wzorzec i odczynnik, niezgodność kalibracyjna między wzorcem i badaną, niesprawdzone pipety

-metody:

*niska specyficzność (reakcje innych substancji obecnych w środowisku), interferencje

*zakłócenia przebiegu reakcji, straty substancji oznaczanej

Kontrola poprawności:

1.metoda oceny poprawności wyników w oparciu o wyniki próbek od pacjentów. Oznaczenia w próbkach pacjentów prowadzone są równolegle dwiema metodami- sprawdzaną i porównawczą (referencyjną)

!!!2.Metoda z wykorzystaniem mianowanych materiałów kontrolnych o ustalonej wartości naleznej (nominalnej). Posługuje się średnimi wartościami metodyczno-aparaturowo-odczynnikowymi!!!

Kontrola poprawności- graficzne porównanie dwóch metod

rysunek

A.brak błędu systematycznego

B.stały błąd systematyczny

C.wynik zgodny w małym zakresie

D.narastający błąd systematyczny

Błąd systematyczny:

przedstawiamy jako (miary):

1.różnicę (błąd) bezwzględny , Δ, B-bias, Diff

Δ = X_nasza - X_{prawdziwa, deklarowana, grupy} (Δ → średnia)

2.różnicę (błąd) względną, Δ%, B%, Diff%

a).Δ% = (X_nasza - X_prawdziwa) \ X_prawdziwa * 100%

b).Δ% = (X_nasza - X_deklarowana) \ X_deklarowana * 100%

c).Δ% = (X_nasza - X_grupy) \ X_grupy * 100%

3.wskaźnik popełnianego błędu - WPB

WPB = błąd uzyskany(%)\błąd dopuszczalny (%)

<0,25 → wynik bardzo dobry

0,26-0,5 → wynik dobry

0,51-0,7 → wynik zadowalający

0,71-1,0 → wynik niezadowalający

>1,0 → wynik zły

WPB- do kontroli międzylaboratoryjnej, do kontroli testów w całym laboratorium ponieważ odnosi się do błędu dopuszczalnego.

Błąd systematyczny:

wyniki oznaczeń powinny być wolne od błędu systematycznego

błąd systematyczny powinien być:

1.mniejszy niż 1\16 zakresu wartości normalnych

2.mniejszy od 1\4 biologicznej zmienności osobniczej (wewnątrz i międzyosobniczej):

Δ% ≤ 0,25 (pierwiastek z [C²_VW + C²_VW]) (poprawność pożądana)

Δ% < 0,375 (pierwiastek z [C²_VW + C²_VW]) (poprawność minimalna)

Δ% ≤ 0,125 (pierwiastek z [C²_VW + C²_VW]) (poprawność optymalna)

Błąd systematyczny:

powszechnie stosowanymi metodami oceny poprawności są:

!!! I.porównanie wyniku uzyskanego (średniej) z wartością deklarowaną (tzw: nominalną) przez producenta materiału kontrolnego- w kontroli wewnątrzlaboratoryjnej.!!!

!!! II.porównanie wyniku uzyskanego (średniej) ze średnią uczestników sprawdzianu międzylaboratoryjnego posługujących się taką samą procedurą (średnia grupy) - w kontroli zewnątrzlaboratoryjnej!!!

Metody a poprawność

-metody definitywne (absolutne) - największa poprawność, metody wyspecjalizowane i kosztowne, pozwalają na ustalenie rzeczywistej wartości, błąd nie większy niż 0,1%

-metody referencyjne - duża poprawność, służą do oceny metod rutynowych, błąd nie większy niż 1%

-metody rutynowe standaryzowane- mogą być obciążone błędem systematycznym metody, znanym i ustalonym w porównaniu z metodami referencyjnymi, błąd nie większy niż 3-5%

Błąd systematyczny:

1.zakres normy dla sodu wynosi 135-145 mmol/l - wartość średnia - 140. jeżeli przyjmiemy że błąd systematyczny wynosi 10% to u ludzi zdrowych otrzymywalibyśmy wyniki od 126 do 154, czyli znacznie wykraczające poza zakres normy

2.dopuszczalny błąd dla oznaczeń sodu wynosi 4%

3.4% od 140 mmol/l to 5,6 dlatego zakres normy jest ustalony od 135 d0 145 mmol/l

4.jeżeli zamiast wyniku 140 damy 142 to błąd tylko 1,4%

Dopuszczalny błąd całkowity

*dostęp do informacji o zmienności biologicznej umożliwia samodzielne wyznaczenie dopuszczalnego błędu precyzji i poprawności. Oba te rodzaje błędów wyznaczają dopuszczalny błąd całkowity

*jest to możliwa do zaakceptowania różnica pomiędzy wynikiem a wartością rzeczywistą mierzonej wielkości

TE_A = [k*0,5*C_VW]+[0,25*pierwiastek z C_VW+C_VM ]

↓ ↓

dopuszczalny błąd dopuszczalny błąd poprawności

precyzji

K-1,65 dla 95% (zmienia się jeśli stosujemy inny poziom istotności)

Zewnętrzna kontrola jakości wyników laboratoryjnych → program prowadzony przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Laboratorium (COBJwDL):

1.program centralny

2.program powszechny

Program centralny

-uczestnikami tego programu są największe laboratoria (250) dobrze wyposażone.

-cykl składa się z 12 sprawdzianów po 2 materiały kontrolne w jednym miesiącu

-każde laboratorium otrzymuje numer kodowy

-programem objętych jest 25 składników z zakresu chemii klinicznej

Program centralny:

-materiały są dostarczane przez COBJwDL

-laboratorium wykonuje oznaczenia w określonym czasie, opisuje stosowane metody, używane odczynniki wg wzoru (arkusz odpowiedziowy programu centralnego- cyklu nr)

-COBJwDL opracowuje wyniki i przekazuje do laboratorium, opracowanie wyników programu centralnego- cykl nr . ..

!!!!-ostateczną oceną jest Δ% X2-odchylenia procentowe wyników nadesłanych przez uczestnika w stosunku do wartości średniej danego zbioru korygowanego. Zbiór korygowany to zbiór powstający po dwukrotnym obciosaniu tj: odrzuceniu wyników odbiegających o 2SD danego zbioru!!!!

-laboratoria które spełniły określone kryteria jakości otrzymują Certyfikat Uczestnictwa natomiast pozostałe tylko Zaświadczenie Uczestnictwa

Program powszechny

-oceniamy 25 składników z zakresu chemii klinicznej

-4 sprawdziany rocznie po 2 materiały kontrolnego-zima, wiosna, lato, jesień - łącznie 8 materiałów kontrolnych

-uczestnik otrzymuje raport oceniający jego wyniki

Dodatkowo organizowane są sprawdziany tematyczne:

1.sprawdzian parametrów RKZ (3 poziomy, zima, jesień)

2.sprawdziany hematologiczne (wiosna, jesień)

3.sprawdzian koagulologiczne (2 materiały, wiosna, jesień)

4.sprawdziany immunochemiczne (wiosna, jesień)

5.sprawdziany immunochemiczne powszechne (3 poziomy, zima, lato)

6.sprawdzian markerów kardiologicznych

Ocena wartości diagnostycznej testu

rysunek

jeśli się zmienia wartość graniczna to zmienia się czułość i ….......(specyficzność), jedno rośnie to drugie maleje

Wartość diagnostyczna a częstość występowania choroby

rysunek

krzywa ROC

przesuwając wartość graniczną znajdujemy nową porę czułości i swoistości diagnostycznej

rysunek

PD- wynik prawdziwie dodatni

PU- wynik prawdziwie ujemny

FD- wynik fałszywie dodatni

FU- wynik fałszywie ujemny

najgorzej jeśli test przebiega jak 0 bo wtedy jest tyle samo PD, PU, FD, FU, test bezwartościowy.

WYKŁAD HORMONY 17 II 2010

Diagnostyka laboratoryjna w ostrych zatruciach lekami, alkoholem, CO, grzybami i ołowiem.

Salicylany

-aspiryna może być przyczyną zatruć. Wchłania się łatwo w stanie niezmienionym z przewodu pokarmowego: po 24 godzinach stężenie salicylanów w osoczu osiąga maksimum wartości, stężenie spada po następnych 8 h. Podobnie po podaniu kwasu salicylowego maksymalne stężenie w osoczu po 24h, ale także po kwasie salicurowym, teroglikuronianie kwasu salicylowego. Aspiryna ulega w ustroju hydrolizie do kwasu salicylowego, dlatego dalsze jej przemiany są identyczne jak kwasu salicylowego. Większa część podanej dawki kwasu salicylowego wydala się z moczem w postaci niezmienionej. Szybkość wydalania różnych metabolitów jest jednakowa.

Po doustnym podaniu salicylanu sodowego 50% dawki wydala się z moczem w ciągu 24h.

-często zatrucia salicylanami są błędnie rozpoznawane jako encefalopatia, upojenie alkoholowe, zaburzenia sercowo-płucne.

-metody oznaczania kwasu salicylowego w moczu według Lapiera.

Zasada : po kwaśnej hydrolizie moczu ekstrahuje się chloroformem. Do oddzielonej warstwy chloroformowej dodaje się 10% roztwór pirydyny oraz odczynnik złożony tj: roztwór siarczanu miedziowego z pirydyną. Powstaje zielononiebieskie zabarwienie, i jest ono proporcjonalne do ilości kwasu salicylowego w próbce.

-pobieranie moczu: pobiera się między 3-4h od przyjęcia kwasu salicylowego (dwukrotnie, aby obliczyć szybkość wydalania) a następnie w miarę potrzeby w okresie późniejszym

Interpretacja wyników:

-w zatruciach kwasem acetylosalicylowym możemy tą metodą oznaczać całkowity kwas salicylowy na który składa się kwas salicylowy otrzymany z estrów w czasie hydrolizy oraz kwas salicylowy występujący w moczu w postaci niezmienionej. Jest zależnść między szybkością wydalania całkowitego kwasu salicylowego w maksimum wydalania (3-4h od przyjęcia dawki kwasu salicylowego) a przyjętą dawką.

-dawce 500mg odpowiada średnia szybkość wydalania ok 22 mg/h, dla 1000mg-45mg/h, a dla 2000mg-90mg/h

-stężenie całkowite kwasu salicylowego w moczu w maksimum wydalania również rośnie z przyjętą dawką kwasu salicylowego osiągając dla dawki 500mg ok. 500mg/l przy 1000mh- ok. 800mg/l, przy 2000mg- ok 1100mg/l

-wydalanie całkowite kwasu salicylowego jest prawdopodobnie wielofazowe: przy dawce 500mg kończy się w zasadzie w ciągu 24h, przy większych dawkach np.: 2000mg po 24h wykazuje się ok.300mg/l

Oznaczanie salicylanów we krwi metodą fotometryczną , metodą Trindera

Zasada metody: salicylany dają z jonami żelazowymi (odczynnik Trindera- trucizna) barwny kompleks. Używamy w niżej podanej metodzie odczynnik azotanu żelazowego, chlorku rtęciowego oraz kwasu solnego. Wytrąca się równocześnie białko surowicy. W środowisku słabo kwaśnym powstaje purpurowe zabarwienie w wyniku utworzenia chelatu z Fe i resztą ******fenolową. Trwałość barwy -60 min. odczytywać E przy 546 nm.

mg% = E_a * E_cl\Ew^a - E_cl *25mg ??????????????????????

Metoda ta umożliwia dokonanie oznaczenia w 50 μl krwi lub surowicy. U ludzi nie przyjmujących salicylanów stwierdza się pozorne stężenie salicylanów we krwi, surowicy, osoczu i dochodzi do 2mg/100mg???

-stężenie lecznicze we krwi, surowicy, osoczu u dorosłych 20-40 mg/dl

-stężenie lecznicze w moczu u dorosłych 20-50 mg/dl

-w zatruciach obserwuję się stężenie do 120 mg/dl kwasu salicylowego. W ustroju szybko rozkładany jest przez esterazę na CH₃COOH, salicylany. Z metabolitów daj*******ących wynik dodatni znaczenie ma kwas acetooctowy.

-salicylany reagują z odczynnikiem Folina (odczynnik fenolowy) w środowisku silnie zasadowym do związku o barwie błękitnej. Reakcja ta ma wynik dodatni z surowicą ludzi nie leczonych salicylanami. Poziom tych związków może wynosić do 8mg% i stanowi wartość próby ślepej.

-salicylany można oznaczać w PMR i wysiękach

-metoda immunofluorescencyjnej polaryzacji (FPIA) -aparat TDX, FLX, AxSYM

Uszkodzenia ścian naczyń krwionośnych powodują salicylany i barbiturany

-aspiryna (kwas acetylosalicylowy) działa przeciwbólowo, przeciwgorączkowo i ogólnie uspokajająco. W leczeniu stosowane są pochodne kwasu salicylowego tj: salicylan sodu, kwas acetylosodowy, salicylen metylowy, kwas gentyzynowy, salicylamid.

-dawka śmiertelna dla ludzi 30-40mg

-zatrucia ostre- metabolity- prowadzą do śpiączki wskutek nagromadzenia się kwaśnych metabolitów

-alkaloza oddechowa u 20% chorych kompensowana wzrostem wydalania HCO₃^- oraz Na⁺ i k⁺ co prowadzi do spadku wodorowęglanów w osoczu.

-zaburzenia mieszane u 60% chorych

-zaburzenia krążenia spowodowane zahamowaniem środka naczynioruchowego, skaza krwotoczna, hipoglikemia

-zatrucia przewlekłe- ból głowy, zawroty, zaburzenia słuchu i wzroku, osłabienie, nudność, wymioty

Barbiturany

Są szeroko stosowane w lecznictwie, w użyciu jest ok. 40 barbituranów

-leki te są syntetycznymi pochodnymi kwasu barbituranowego, ze względu na czas działania dzielimy je na :

+długodziałające - działają nasennie przez 8-12 h np.: luminol

+krótkodziałajce - do 2-8h np.: cyklobarbital

+ultrakrótkodziałajace - 5-30 minut np.: tiopental

-barbiturany wchłaniają się szybko i prawie całkowicie z żołądka, górnych części jelita cienkiego, odbytnicy, pęcherza

-poziom barbituranów we krwi zależy od:

+szybkości resorpcji

+rozpuszczalności w wodzie i tłuszczach

+metabolizmu

-największe stężenie leków pojawia się w wątrobie i śledzionie, niższe w płucach, sercu, mózgu, najniższe w mięśniach

-tiobarbiturany gromadzą się w tkance tłuszczowej

-leki te łatwo przechodzą przez łożysko

-szybkość ich usuwania zależy od rodzaju barbituranów i dawki

-metabolity barbituranów mogą wydalać się zarówno w postaci wolnej jak i sprzężonej z kwasem glukuronowym.

-w osoczu są one powiązane z białkami głównie globulinami i erytrocytami. Postać związana z białkami jest niedostępna dla tkanek efektorowych, jednak jest to połączenie które może ulec rozerwaniu w wyniku zachowania stanu równowagi dynamicznej, między frakcja wolna a uwalnianą z białek. Uwolnione cząsteczki działają leczniczo i swobodnie mogą pzrenikać do tkanek. Metabolizm ich zachodzi głównie w wątrobie. Fenobarbital (luminol) wpływa depresyjnie na ośrodek oddechowy i naczynioruchowy co ma znaczenie toksykologiczne. Wywiera działanie przeciwdrgawkowe, nasila uwalnianie ADH i jednocześnie hamuje wchłanianie Na i glukozy w kanalikach nerkowych.

-działanie barbituranów na OUN- spadek zdolności utleniania glukozy, kwasu mlekowego i pirogronowego oraz utrudniają rozpad ATP. Leki te mogą być stosowane w leczeniu padaczki i w anestezjologii. Używane w celach samobójczych (szczególnie z alkoholem)

-barbiturany nasilają aktywność układów enzymatycznych wątroby co przyspiesza ich biotransformację a także związków endogennych (np.: hormonów kory nadnerczy), oraz osłabia działanie doustnych leków przeciwzakrzepowych, cyklosporyny, tyroksyny i innych. Przyspiesza również własny metabolizm- fakt wytwarzania swoistej tolerancji na barbiturany u osób długotrwale ich używających

Zatrucia:

-senność, zaburzenia równowagi, początkowo źrenice szerokie, później zwężone, mowa bełkotliwa, tętno zwalnia się w miarę upływu czasu, spadek RK, oddech płytki, powoli ustaje perystaltyka jelit

Oznaczanie barbituranów we krwi metodą kolorymetryczną

-krew lub mocz ekstrachuje się za pomocą chloroformu. Warstwę chloroformową zawierającą barbiturany wytrząsa się za pomocą buforowanego azotanu rtęciowego. Jony rtęciowe łączą się z barbituranami. Do chloroformowego roztworu kompleksu barbituranowo-rtęciowego dodaje się dwufenylokarbazonu. Nasilenie powstającego zabarwienia jest proporcjonalne do ilości jonów rtęci związanych z barbituranami.

E próby badanej/E próby standardowej * stężenie wzorca = mg% barbituranów (w pzreliczeniu na luminolum natrium). Odczytujemy wobec wody przy 550nm.

-barbiturany możemy również oznaczać jak szereg innych leków na chromatografie gazowym.

-otrzymujemy wtedy rozdział poszczególnych barbituranów w postaci oddzielnych pików

-do oznaczeń barbituranów próbę moczu ekstrachuje się 3-5 cm³ chloroformu, ekstrakt po przefiltrowaniu reekstrahuje się 5cm³ 0,5 N roztworu NaOH. Po zakwaszeniu do pH=4 HCL ekstrachuje się barbiturany ponownie 15 cm³ chloroformu i filtruje. Po zagęszczeniu ekstraktu pozostałość suszy się w próżni i rozpuszcza w małej ilości ciepłego acetonu. Wprowadza się na kolumnę za pomocą mikrostrzykawki.

Benzodiazepiny.

Główny przedstawiciel -diazepam (relanium), klonazepam. Leki te działają przeciwdrgawkowo, przeciwlękowo i uspokajająco. W zwiększonych dawkach powodują zahamowanie aktywności psychoruchowej, senność, wpływają rozluźniająco na mięśnie szkieletowe. Leki te mogą powodować uzależnienia o charakterze psychicznym. Są szczególnie niebezpieczne w połączeniu z opioidami, barbituranami i alkoholem. Benzodiazepiny dobrze wchłaniają się z przewodu pokarmowego. Początek działania po 20-40 minutach i utrzymuje się 6-12h. Leki te są metabolizowane w wątrobie, wydalane przez nerki w tym tylko 0,5% w postaci niezmienionej, wydzielane są także z mlekiem matki.

-metoda immunologiczna (FPIA) - aparat TDXF FLX i AxSYM

Metoda imunoenzymatyczna - test Multigen

-oznaczanie barbituranów i benzodiazepin

-jest to homogenna metoda immunoeznymatyczna, w której wykorzystuje się przeciwciala monoklonalne, których zastosowanie pozwala na wykrywanie narkotyku w moczu.

-znakowany enzymem lek oraz lek obecny w moczu badanym konkurują ze sobą o stałą liczbę przeciwciał wiążących się z lekiem znakowanym dehydrogenazą glukozo-6-fosforanową, w efekcie czego działanie enzymu zostaje zahamowane.

-w reakcji obserwuje się bezpośrednią zależność pomiędzy stężeniem leku w moczu a aktywnością enzymatyczną.

-wartość aktywności G6PDH jest mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 340/312 nm. Pomiar oparty jest na przekształceniu NAD w formę zredukowaną NADH

-metoda wykorzystywana w ARCHITEKT

Digoksyna

-zatrucia ostre są najczęściej wynikiem przedawkowania leku w czasie terapii

-ze względu na występowanie zaburzeń elektrolitowych należy monitorować stężenie Na, K, Ca, Mg, we krwi

-potwierdzenie zatrucia to ilościowe oznaczenie leku we krwi

-stężenie toksyczne 3-5 ng/ml

-w terapi monitorowanej krew musi być pobierana po czasie minimum 8h od podania leku.

Metoda MEIA oznaczania digoksyny

-jest to test immunoenzymatyczny z wykorzystaniem mikrocząsteczek,

-polega na użyciu mikrocząsteczek opłaszczonych przeciwciałami skierowanymi przeciwko badanej substancji

-w drugi etapie tworzy się kompleks immunologiczny antygen-przeciwciało na powierzchni mikrocząsteczek.

-kompleks jest wiązany trwale z matrycą z włókna szklanego i dodawane jest drucie przeciwciało znakowane fosfatazą alkaliczną

-w ostatnim etapie dodawany jest substrat fluorogenny MUP który pod wpływem fosfatazy jest przekształcany do produktu MU*

-mierzy się szybkość z jaką powstaje MU* i jest ona proporcjonalna do stężenia antygenu w próbce.

Metoda turbidymetryczna ARCHITEKT

-jest to jednorodny test immunologiczny, oparty o pomiar turbidymetryczny

-badanie opiera się na współzawodnictwie pomiędzy antygenem w próbce badanej z antygenem opłaszczonym na mikrocząsteczkach skierowanymi przeciwko przeciwciałom monoklonalnym

-digoksyna na mikrocząsteczkach jest szybko aglutynowana w obecności przeciwciał anty-digoksyna przy barku digoksyny w próbce badanej. Szybkość absorpcji jest mierzona fotometrycznie i jest wprost proporcjonalna do szybkości aglutynacji cząstek

-kiedy w próbce jest digoksyna reakcja aglutynacji jest częściowo hamowana - spada szybkość aglutynacji

Metoda immunochemiczna z pomiarem fluorescencji w świetle spolaryzowanym FPIA

-metoda immunofluorescencyjnej polaryzacji wykorzystuje zjawisko wzrostu polaryzacji światła emitowanego przez fluoryzujący znacznik który zwiazany jest z przeciwciałem badanego związku. Badany lek czyli antygen ogranicza ilość połączeń znacznika z przeciwciałem. Wolny znacznik emituje światło o wysokiej polaryzacji która jest miarą stężenia badanego leku.

-metoda wykonywana w aparacie TPX FLX, i AxSYM

w organizmie w warunkach prawidłowych przebiega typowa reakcja red-oks, utleniania hemoglobiny do hemiglobiny ( nieczynna pochodna hemoglobiny -MetHb) w jednym kierubku, a redukcja hemiglobiny do Hb w drugim kierunku

Hb \Fe²⁺\ ← → \Fe³⁺\hemiglobina Enzymy → oksydaza, reduktaza

-warunkiem stanu równowagi jest obecność i aktywność reduktazy w erytrocytach. Mechanizm ten zapewnia to w organizmie w stanie zdrowia, że % zawartość MetHb w hemoglobinie całkowitej nie przekracza 0,1%. unieczynnienie enzymu lub spadek jego aktywności prowadzi do wzrostu stężenia MetHb we krwi. Wzrost poziomu MetHb może być wrodzony lub nabyty.

Nabyte zwiększenie poziomu MetHb we krwi może występować pod działaniem niektórych substancji chemicznych głównie azotany, azotyny, związki nitrowe np.: nitrobenzen, aminy aromatyczne np.: anilina, leki(polopiryna), fenancetyna, sulfonamidy. Obserwowano także przypadki MetHb przy zatruciach benzoiną i glutetmidem. W wyniku działania na Hb tych czynników Fe²⁺ w hemoglobinie ulega utlenieniu do Fe³⁺ wówczas wolna wartościowość koordynacyjna wiąże ujemny jon (najczęściej OH^-) powstały związek Hb(Fe³⁺)OH_- to MetHb . Brak zdolności przenoszenia tlenu.

Wrodzone postacie MetHb zależy od :

+niedoboru reduktazy MetHb przy czym poziom MetHb we krwi może dochodzić do 50% a podstawowym objawem jest sinica i różnego stopnia objawy niedotlenienia

lub:

+od obecności patologicznej Hb M. wysoki poziom MetHb w tej wadzie zależy od dużej wrażliwości Hb M na utlenianie niż powolnej redukcji MetHb. Objawy- sinica. Zawartość Hb M - nawet kilkadziesiąt %.

Wykład Hormony 24 II 2010

Metoda spektrofotometryczna

Zasada metody: w razie obecności w badanej próbce dwóch substancji o dwóch różnych widmach absorpcyjnych z obliczenia ilorazu ekstynkcji oznaczanych przy dwóch różnych długościach fali można wnioskować o stężeniu obu substancji. W omawianym przypadku chodzi o % udział MetHb w Hb całkowitej. Obecna w próbie krwi Hb utlenowuje się w buforze fosforanowym do oksyHb, natomiast MetHb nie ulega przemianie. Wykonanie patrz załączona instrukcja (na serio tak było)

Metoda cyjanomethemoglobinowa

zasada: MetHb w środowisku kwaśnym (pH6,6) posiada przy długości fali 635 nm charakterystyczne maksimum absorpcji które zanika w czasie zmiany MetHb w cyjanoMetHb, na skutek zadania próbki krwi cyjankiem sodu. Różnica absorpcji przed i po podaniu cyjanku sodu jest miarą stężenia MetHb.

CO-oksymetria- oparta o spektrofotometrię z tym, że hemoliza krwi następuje w wyniku ultradźwięków. Następnie dokonywany jest pomiar stężenia różnych frakcji Hb w oparciu o pomiar absorpcji, w oksymetrach nowej generacji, pomiar każdej próbki odbywa się przy 10 długościach fal, rozpoznanie rodzaju badanego materiału przy 15 długościach fal. Oksymetry te posiadają system optyczny, który eliminuje interferencje ( pomiar w szerokim zakresie widmowym). Uzyskany wynik jest średnią z setek pomiarów. Możliwe jest oznaczenie różnych postaci Hb w obecności Hb płodowej, lipemii, bilirubiny, zmętnienia i barwników.

Tlenek węgla

-występuje bardzo często w warunkach przemysłowych- , kopalnie, gazownie, huty oraz w życiu osobistym. Gaz o masie właściwej nieco mniejszej od powietrza, bezbarwny, bez smaku i bezwonny co sprawia że jest gazem szczególnie niebezpiecznym.

-jest on produktem powstającym w procesie niecałkowitego spalania węgla i jego związków organicznych. Źródło CO : odlotowe gazy spalinowe i kominowe, gaz świetlny, gaz wodny, wybuchowy. CO jest wchłaniany przez płuca i w mniejszym stopniu przez skórę. Ilość wchłoniętego CO zależy od jego stężenia w powietrzu, czasu narażenia i są tym większe im większa wentylacja płuc.

CO łączy się łatwo z ugrupowaniem żelazo-porfirynowym enzymów oddechowych. Następstwem tego jest inaktywacja enzymów i hamowanie oddychania tkanek. W organizmie człowieka CO powstaje podczas endogennych przemian katabolicznych Hb z węgla α-metanowego pierścienia protoporfiryn. W konsekwencji u osób zdrowych można stwierdzić w granicach 1,0-10% HbCO a w niektórych chorobach nawet większych wartości. Jeżeli stwierdza się stężenie HbCO w granicach 10-30% mamy lekkie zatrucie, 30-40% średnio ciężkie, powyżej 40 % zatrucie ciężkie.

-objawy zatrucia: wzrost stężenia glukozy, spadek żelaza, hipoksemia, hipokapnia, spadek pH krwi spadek zasad (BE), leukocytoza w granicach 12-19 tys/ml. Powoduje to uszkodzenie śródbłonka naczyń, uczynnienie płytek krwi i w wyniku nadmiernej agregacji zmian zakrzepowych. Działanie toksyczne CO polega na łączeniu się z Hb w wyniku czego powstaje HbCO nie mające zdolności przenoszenia tlenu. CO łączy się z atomem żelaza w cząsteczce hemu. Powinowactwo CO do Hb jest około 210 razy wyższe niż powinowactwo do tlenu.

HbO₂ + CO → HbCO +O₂

-reakcja jest odwracalna, lecz dysocjacja HbCO jest 10 razy wolniejsza od oksyhemoglobiny. Hb uwolnione od CO odzyskuje zdolność przenoszenia O₂.

-krytyczne stężenie CO w powietrzy ma wartość 0,1%. przebywanie w takim stężeniu powoduje po kilku godzinach zatrucie śmiertelne przy czym stężenie HbCO we krwi przekracza 60-80% przy niższych stężeniach CO w powietrzu ustala się równowaga Hb tlenowęglowej we krwi na poziomie zależnym od stężenia CO w powietrzu. Szybkość łączenia się CO z Hb jest początkowo bardzo duża, maleje w miarę zbliżania się do stanu równowagi. Na przyspieszenie dysocjacji HbCO wpływa wzrost stężenia CO₂ we krwi, wywołujący wzrost stężenia H⁺ i przyczyniający się do szybkiego wydzielania CO z krwi.

-CO wydala się głównie przez płuca. Małe ilości są utleniane do CO₂. Wydalanie można przyspieszyć jeżeli do oddychania daje się tlen lub powietrze z dodatkiem CO₂ lub tlenu. W miarę wzrostu zawartości HbCO występuje nasilenie objawów niedotlenienia tj: uszkodzenie komórek OUN → po początkowym okresie pobudzenia ośrodka oddechowego i wzroście wentylacji płuc następuje zwolnienie oddechu przez wypłukanie z krwi pobudzającego oddychanie CO₂.

Metoda spektrofotemetryczna według Standard

-Hb krwi zostaje zamieniona na oksyHb przez dodanie roztworu amoniaku do próby badanej HbCO nie ulega zmianie. Oznacza się zawartość % HbCO w Hb całkowitej. Absorpcja próby badanej odczytywana jest przy trzech długościach fali 575,560, 498 nm. Wykonanie oznaczenia (patrz dołączona instrukcja)

-CO-oksymetria

Istnieje wiele klasyfikacji zatruć grzybami. Wyróżnia się np.: zatrucia o krótkim (do 4h) i długim (do 48h) okresie utajenia. Podział ten jest słuszny jeśli zatrucie nastąpiło jednym gatunkiem grzyba, mylący natomiast jeśli spożyto potrawę złożoną z wielu trujących gatunków

ze względu na mechaniczne działanie toksyn zawartych w grzybach można wyróżnić zatrucia:

1.wywołane grzybami jadalnymi

*grzyby jadalne (prawdziwki, podgrzybki, maślaki, kurki) a także lejówka, opieniek i gąska zaliczają się do pokarmów ciężko strawnych, długo zalegających w przewodzie pokarmowym, dlatego nie powinno się ich podawać dzieciom i starszym osobom.

2.spowodowane przez grzyby powodujące nieżyt żołądkowo-jelitowy

*w Polsce jest około 100 takich gatunków, są to między innymi: czubajki, gołąbki, maślanka, lisówka, pieczarki żółtawe (dziko rosnące), tęgoskór pospolity (purchawka kartoflana, fałszywa trufla), borowik grubotrzonowy (goryczak), borowik szatański.

Zatrucia przebiegają podobnie dp zatruć grzybami jadalnymi- nudności, wymioty, bóle brzucha- jednak są mocniej wyrażone. Niekiedy dochodzi do poważnego odwodnienia czy niewydolności nerek. Postępowanie jak w ciężkich zatruciach grzybami jadalnymi polega na płukaniu żołądka ….?

3.wywołane grzybami powodującymi zaburzenia psychoneurologiczne

*największa śmiertelność jest po spożyciu muchomora sromotnikowego i wynosi 12-52%

*substancje toksyczne to amatoksyna i falotoksyna z których najbardziej toksyczna jest α-amanityna. Uszkadzają wątrobę, dobrze wchłaniają się z przewodu pokarmowego, wiążą się z białkami krwi i wychwytywane są przez hepatocyty co powoduje martwicę wątroby.

*wolna amanityna wydalana jest z żółcią do przewodu pokarmowego, ulega resorpcji zwrotnej i dalej wydalana z moczem.

*α-amanityna wykrywana jest we krwi w niskich stężeniach 2-200 ng/ml do 48 godzin po spożyciu.

Ołów

-jest drugim obok rtęci ciężkim metalem który odgrywa rolę w toksykologii. Ze względu na częstotliwość zatruć przemysłowych i innych- zwykle wypadkowych.

-charakterystyka - dla zatruć ołowiem są tzw: kolki ołowicze, czyli napady silnych bólów w jamie brzusznej, a także nerwobólów. Na brzegach dziąseł widuje się w tych zatruciach czarny rąbek siarczanu ołowiu zwany rąbkiem ołowiczym. Opisano przypadek zatrucia ołowiem po wypiciu mleka i wody z naczyń ołowianych.

(PbC₂H₂)₂ jako tzw. płyn przeciwstukowy dodawany do benzyny i sam czterotlenek ołowiu jest silną trucizną wywołująca w zatruciach ostrych zaburzenia ze strony OUN (majaczenie i inne). Wydalanie zaś silników spalinowych ołowiu do powietrza atmosferycznego powoduje wytwarzanie się w niższych stężeniach niebezpiecznego dla zdrowia zwłaszcza w dużych miastach, o dużym nasileniu ruchu samochodowego.

Alkohol metylowy:

-aldehyd mrówkowy wytwarzany technicznie jako formalina czyli formaldehyd. Jest to znana trucizna bakteriobójcza. Dawka śmiertelna 10-100 gram.

-metanol przypomina zapachem etanol, toteż bywa omyłkowo konsumowany lub dodawany do wódki czy też potencjalnie sprzedawany jako „spirytus”. Jest to bardzo niebezpieczna trucizna uszkadzająca głównie nerwy, a zwłaszcza nerw wzrokowy i siatkówkę oka, tak że człowiek zatruty może całkowicie stracić wzrok (jeżeli w ogóle przeżyje). Do metabolitów należą: aldehyd mrówkowy i kwas mrówkowy.

Przemiany aldehydu:

*wchłanianie alkoholu

-szybko przechodzi z jamy ustnej do żołądka, jelita cienkiego (nieznaczna ilość ulega wchłanianiu do krwi przez błony śluzowe jamy istnej i żołądka). Alkohol jako związek chemiczny łatwo rozpuszczalny w wodzie przenika wprost przez ściany jelita do krwioobiegu już podczas picia, wzrasta więc jego stężenia we krwi i w powietrzu wydychanym także. Wyjaśnia to szybkość z jaką zauważalny jest efekt wypicia alkoholu zwłaszcza na tzw: pusty żołądek. Po spożyciu alkoholu jet on przez pewien czas obecny w przewodzie pokarmowym tak że trwa „faza wchłaniania”. Jeżeli żołądek i jelito cienkie nie zawiera treści pokarmowej wówczas zachodzi szybki transport alkoholu przez ściany jelita. W takich warunkach wchłanianie trwa do 30 minut od zakończenia picia. W przypadku gdy jest pokarm w żołądku wchłanianie ulega spowolnieniu i trwa 90 i więcej minut.

W fazie wchłaniania alkoholu zaproponowano hipotezę „2 zbiorników”. Zgodnie z tym konsumpcja alkoholu przy lub bezpośrednio po posiłku powoduje że część alkoholu zostaje w sposób fizyczny zaabsorbowana przez cząsteczki pokarmu. Ta część jest skutecznie powstrzymywana przed przejściem do krwi. Pozostała część alkoholu rozumowana jako drugi zbiornik jest natychmiast zdolna do absorpcji tak jakby była przyjęta na pusty żołądek. W efekcie mamy szybkie wchłanianie i szybki wzrost stężenia alkoholu.

*rozmieszczenie alkoholu w organizmie:

-alkohol przedostaje się przez ściany naczyń jelita cienkiego wraz z substancjami odżywczymi do krwi. Krew rozprowadza głównie do tkanek o dużej zawartości wody. Organy do których dostarczona jest duża ilość krwi- mózg, płuca osiągają początkowo najwyższe stężenie alkoholu.

*wydalanie w postaci niezmienionej zachodzi powoli. Około 96% alkoholu ulega przemianie w wątrobie. 4% wydalana jest w formie niezmienionej z moczem, powietrzem, śliną.

*czynniki wpływające na poziom stężenia alkoholu we krwi → przyjmuje się że im więcej alkoholu wypije osoba tym wyższe jest jego stężenie we krwi i powietrzu wydychanym. Stężenie alkoholu we krwi zależy od:

-rodzaju alkoholu- na szybkość wchłaniania wpływa zawartość alkoholu w napoju. 20% objętości alkoholu- wchłanianie najszybsze. Te które mają 40 % objętości mogą być wolniej wchłaniane gdyż takie stężenie spowalnia funkcję zwieracza odźwiernika. Piwo (ok 4%) jest również wolniej wchłaniane (rozcieńczenie)

-czas- picie alkoholu w niewielkich ilościach w dłuższym czasie powoduje że szybkość przyrastania stężenia alkoholu we krwi jest związana z szybkością jego eliminacji, zachodzi równoległe, w tym samym czasie.

-wpływ pokarmu i wypełnienia żołądka

-budowa ciała- alkohol w organizmie rozprowadzany jest do tkanek zawierających wodę. Tak więc ciałko o większej masie mięśni zawiera więcej wody więc w efekcie- spada stężenie maksymalne alkoholu we krwi. Dużo tkanki tłuszczowej- mało wody → szybciej się upija niż osoba muskularna.

*eliminacja alkoholu

-przemiana metaboliczna- enzym utleniający alkohol to dehydrogenaza alkoholowa. Zlokalizowany w wątrobie a niewielka ilość w nerkach, błonie śluzowej żołądka, jelit, trzustce. ADH katalizuje utlenianie alkoholu do aldehydu. Aldehyd z kolei utlenia się w obecności ALDH do kwasu octowego. Szybkość spalania alkoholu zależy od aktywności ADH i ilości NAD. W sytuacjach nadmiernego obciążenia alkoholem aktywowane są:

→ MEOS- mikrosomalny układ utleniania etanolu

→ układ katalaz

ADH

-enzym zlokalizowany głównie w wątrobie. Niewielkie ilości w nerkach, żołądku, trzustce, jelicie. Występuje w postaci kilku izoenzymów podzielonych na sześć klas wyodrębnionych na podstawie ruchliwości elektroforetycznej, właściwości kinetycznych i immunologicznych.

Działanie alkoholu na organizm:

etanol jest naturalnym produktem utleniania glukozy przez różne organizmy. Wykazuje on działanie fizjologiczne, farmakologiczne (nie stosowany jako lek). Działanie na OUN jest podobne do środków ogólnie znieczulających. Przyjmuje się że wpływ alkoholu polega na osłabieniu sprawności coraz to niższych struktur OUN.

Działanie alkoholu zależy od ilości spożytego alkoholu, czasu w jaki został wypity, wrażliwości osobniczej.

Dawka śmiertelna

200-400g czystego alkoholu

500-700g 40% wódki

Objawy:

(zaburzenia wywołane przez sam etanol i jego metabolity)

-zmiana stanu redox w wątrobie w czasie utleniania alkoholu. Spadek stosunku NAD\NADH hamuje proces glukoneogenezy, spadek zużycia mleczanów, kwasica mleczanowa.

-Hipoglikemia, hiperglikemia

-kwasica mleczanowa, kwasica ketonowa

Diagnostyka laboratoryjna (zwykle)

-poziom etanolu we krwi i w moczu

-kontroluje się parametry gospodarki RKZ

-stężenie mleczanów- kwasica mleczanowa

Elektrolity

ciężkie zatrucia- spadek pH 7,2-7,1

niedobór zasad 10 do-15 mmol/l

w konsekwencji alkoholowe uszkodzenie wątroby objawia się wzrostem GGTP, marskością wątroby, stłuszczeniem.

ADH

*katalizuje przemiany metaboliczne:

-kwasów tłuszczowych

-steroidów

-kwasów żółciowych

-digoksyn

-digitoksyn

reakcje katalizowane przez ADH są odwracalne a szybkość redukcji aldehydu 40 razy większa niż szybkość utleniania alkoholu.

MEOS

w sytuacji nadmiernego obciążenia organizmu alkoholem obok ADH aktywuje się MEOS powodując przyspieszenie spalania etanolu. Układ ten znajduje się w mikrosomalnych komórkach wątroby. Utlenia on etanol do aldehydu octowego, zużywając tlen i elektrolity oraz protony przenoszone przez koenzym NADPH + H⁺ (jednocześnie powstaje woda). Układ MEOS wymaga obecności zredukowanej formy NADPH, tlenu cząsteczkowego, cytochromu P-450, reduktazy NADPH cytochromu C oraz frakcji fosfolipidowej

CH₃CH₂OH + NADPH + H⁺ + O₂ ---MEOS → CH₃CHO + NADP⁺ + 2H₂O

Układ MEOS charakteryzuje się małą swoistością substratową- metabolizuje metanol i alkohole alifatyczne o dłuższych łańcuchach. maksimum aktywności systemu MEOS występuje przy

pH = 7,0 podczas gdy optymalne pH dla ADH wynosi 10,8. mikrosomalnym procesom oksydacyjnym towarzyszy powstawanie wolnych rodników hydroksylowych.

Układ katalazy

*układ ten znajduje się w

-peroksysomach (cytoplazmatycznych organellach odpowiedzialnych za tworzenie H₂O₂ i utleniania kwasów tłuszczowych)

-erytrocytach

Aktywność katalazy utleniającej etanol jest ograniczona dostępnością nadtlenku wodoru

CH₃CH₂OH + H₂O₂ ---katalaza → CH₃CHO + 2H₂O

Dehydrogenaza aldehydowa (ALDH)

aldehyd octowy jest szybko utleniany przez enzym mitochondrialny ALDH do kwasu octowego (reakcja odwracalna) dalej zaś metabolizowany np.: w cyklu kwasów trikarboksylowych.

Długotrwałe nadużywanie alkoholu prowadzi do uszkodzenia mitochondriów przez aldehyd przez aldehyd, oraz do upośledzenia aktywności ALDH I. Objawia się to hiperacetataldehydemią czyli nawet pięciokrotnie wyższym stężeniem aldehydu we krwi niż normalnie obserwowane po spożyciu alkoholu. Leki hamujące ALDH np.: disulfiran (antabus) stosuje się w terapi odwykowej u alkoholików. Po przyjęciu leku nie działa ALDH.

Tolerancja

wyróżnia się dwa typy:

-farmakologiczny- polega na osłabieniu działania leku w wyniku zmian wchłanianiu, rozmieszczeniu leku w organizmie, metabolizmie, wydalaniu.

-funkcjonalna- odgrywa w wypadku etanolu podstawową rolę i jest ??????

u osób uzależnionych od alkoholu często przy 2%₀ występuje brak objawów silnego upojenia. Pierwsza dawka alkoholu jest dla organizmu jak trucizna i organizm dąży do jak najszybszego jej wyeliminowania kosztem zaburzeń normalnych funkcji komórkowych przede wszystkim wątroby.

Jeśli mamy przewlekłe spożywanie- zmuszenie organizmu do metabolizmu etanolu, adaptuje się OUN i organizm usiłuje przystosować się do traktowania alkoholu jako normalny składnik pokarmowy (którym nie jest). Objawy kliniczne są bardziej wyraźne podczas fazy wchłaniania alkoholu z przewodu pokarmowego do krwi oraz wzrost jego stężenia w tkankach aniżeli w trakcie eliminacji z ustroju.

Alkohol działa jak środek depresyjny na CUN

Stężenie 0,3-0,5%₀ zaburzenia funkcji ruchowych, zmysłowych, intelektualnych

stężenie 0,5-0,7%₀ następuje nieuzasadniony wzrost zaufania do swoich umiejętności przy tym stężeniu nie występują wyraźne objawy zatrucia.

Z punktu widzenia przy stężeniu 0,2-0,4%₀ występują zaburzenia wzroku. Pojawia się zjawisko tzw: ciemnego tunelu (zwężenie pola widzenia). Przy stężeniu 0,4%₀ są trudności w rozpoznawaniu obiektów małych, zaburzenia zdolności adaptacyjnych.

WYKŁAD 3 III 2010

Oznaczanie substancji narkotycznych w płynach ustrojowych.

Opiaty:

*opiaty (morfina, kodeina) to naturalne alkaloidy opium stosowane jako środki przeciwbólowe. Heroina powstaje w procesie syntezy morfiny. Po spożyciu lub podaniu dożylnym heroina ulega metabolizmowi do postaci 6-monoacetylomorfiny, a ta podlega dalszej hydrolizie do morfiny

*opiaty ulegają natychmiastowemu metabolizmowi w wątrobie i zaledwie 10% dawki wydala si z moczem, obecność ich w moczu pozwala na wykrycie niedawnego zażywania morfiny, kodeiny i/lub heroiny.

*kodeina jest wydalana z moczem w ponad 95% pojedynczej dawki w ciągu 48h.

*heroina podlega natychmiastowej dezacetylacji do postaci 6-acetylomorfiny 1,3% i morfiny 4,2%, wydala się przez nerki w mniej niż 75% w postaci niezmetabolizowanej do 87% przyjętej dawki morfiny jest wydalanej. Morfina nie kumuluje się w organizmie

*czas wystąpienia działania po podaniu dawki 10 mg podskórnie lub domięśniowo wynosi 15-30 minut, czas maksymalnego działania 60-90 minut i utrzymuje się 4-5 h. Po dożylnym podaniu dawki 10 mg czas wystąpienia maksymalnego działania wynosi 20-30 minut i utrzymuj się 2h

*jako odtrutkę stosujemy naloxon o działaniu antagonistycznym w stosunku do morfiny.

Heroina szybko dostaje się do krwi, maksymalne stężenie po 1-5 minutach, metabolizowana do morfiny (daje więc te same efekty)

Marihuana ( kannabinole)

*środek otrzymywany z liści i szczytów roślin konopii indyjskiej. Zażywany w celu wywołania efektów psychotropowych. Głównym składnikiem psychoaktywnym jest THC, delta-9-tetra-hydrokannabinol od którego zależy efekt narkotycznych

*haszysz to żywica konopii

*marihuana szybko wchłania się z powietrza. Objawy pojawiają się po upływie 15-30 minut i trwają 4h.

*THC metabolizowany jest w wątrobie, hydroliza do aktywnego metabolitu 11-hydroksytetrakanabinol, wydalany jest z moczem 15-20%, z kałem 30-35%. metabolity są wykrywane do 8 dni po spożyciu pojedynczej dawki i do 4 tygodni u osób uzależnionych.

Kokaina

*zażywana donosowo, wstrzykiwana dożylnie, przez wdychanie wolnej zasady kokainy

*metabolizowana w wątrobie, częściowo do aktywnego metabolitu norkokainy

*wydalanie kokainy i jej metabolitów z moczem rozpoczyna się w ciągu 20 minut od zażycia donosowego, po podaniu doustnym 3-4h. Pojedyncza dawka zostaje wydalona z całodobowym moczem w postaci kokainy 1-9%, benzoiloekgininy???? 35-54%

*wydalanie kilka dni

Amfetamina ( metamfetamina)

*są to pochodne syntetycznej efedryny

*są to substancje przyjmowane najczęściej doustnie lub dożylnie, metabolizowane w wątrobie lub wydalane z moczem w formie niezmienionej. Amfetamina jest wydalana w 30% w DZM w zależności od jego pH. Pozostałość to metabolity.

*amfetaminy pojawiają się w moczu w ciągu 3h od zażycia narkotyku i są wykrywane do 24-48h od zażycia ostatniej dawki.

LSD

*półsyntetyczne pochodne sporyszu

*metabolizowane w wątrobie do nieaktywnego metabolitu, wydalane z żółcią i moczem . W postaci zmetabolizowanej zaledwie 1% wydalany z moczem w formie niezmienionej.

*maksymalne stężenie we krwi 30-60 minut, czas działania 8-12h

*obecność LSD w moczu 3-120h po spożyciu.

Metody oznaczania

1.immunoenzymatyczna /ARCHITEKT, AxSYM/ test Multigent

-metoda homogenna immunoenzymatyczna w której wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne, których zastosowanie pozwala wykryć narkotyki w moczu

-znakowany enzymem lek oraz lek w moczu badanym konkurują ze sobą o stałą liczbę miejsc wiązania swoistych przeciwciał. W przypadku nieobecności narkotyku w moczu swoiste przeciwciała wiążą się z lekiem znakowanym dehydrogenazą G6PDH, w efekcie czego działanie enzymu zostaje zahamowane

-w reakcji obserwuje się bezpośrednią zależność pomiędzy stężeniem leku w moczu a aktywnością enzymu 340nm

2.FPIA

-metoda FPIA wykorzystuje zjawisko wzrostu polaryzacji światła emitowanego przez fluoryzujący znacznik który związany jest z przeciwciałem badanego związku. Badany lek czyli antygen ogranicza ilość połączeń znacznika z przeciwciałem. Wolny znacznik emituje światło o wysokiej polaryzacji która jest miarą stężenia badanego leku.

3Metoda CBI

-immunochemiczna reakcja oparta o FPIA która wykorzystuje dwie techniki do określenia stężenia badanej substancji:

*kompetytywne wiązanie białek

*spolaryzowaną fluorescencję

-antygen znakowany związkiem fluorescencyjnym i antygen badany współzawodniczą o miejsce wiązania przeciwciał. Jeśli próba badana zawiera niskie stężenie antygenu badanego to po reakcji nie będzie w roztworze antygenu znakowanego i polaryzacja będzie wysoka. Odwrotnie jeśli koncentracja antygenu w badanej próbce wysoka- polaryzacja niska.

4.immunologiczny test do jakościowego wykrywania narkotyków

-jest jednoetapowym immunologicznym testem w którym skoniugowany narkotyk związany z błoną testu w miejscu oznaczanym jako linia testowa współzawodniczy z narkotykiem i jego metabolitami o wspólne miejsce na specyficznym przeciwciele oznakowanym barwnikiem. W czasie migracji wzdłuż błony próbki moczu bez narkotyku i przeciwciał oznakowanych barwnikiem wychwytywane są przez związane z błoną narkotyki w linii oznaczonej T. jeżeli w próbce jest narkotyk lub metabolity miejsce wiążące na przeciwciele wysyca się przez narkotyk znajdujący się w moczu co zapobiega wiązaniu przeciwciał w miejscu gdzie znajduje się narkotyk na błonie (linia T)

-w obu przypadkach przeciwciało kozie IgG oznakowane barwnikiem wiązane jest z linią kontrolną C przez anty-kozie przeciwciała królicze

-jeżeli stężenie narkotyku jest poniżej progu czułości metody, w okienku testu widoczne są dwie linie, C + T, jeśli wynik dodatni jedna linia C

37

---