sprawko 6i7, inżynieria genetyczna, laboratorium


Agnieszka Filemonowicz, 172332

Beata Korkuś, 172648

Grupa: II, piątek 8:15

Data zajęć: 8.04.2011r., 15.04.2011r.

Prowadzący kurs: mgr M. Kozłowska

Sprawozdanie z Laboratorium Inżynierii Genetycznej

Ćwiczenie nr VI i VII

Punkty 1-3 wykonane zostały przez asystenta.

  1. Z płytki po ligacji pobrano kilka kolonii, każdą z nich zainokulowano w 3 ml pożywki płynnej LB zawierającej karbenicylinę w stężeniu końcowym 100 μg/ml. Uzyskane w ten sposób kultury inkubowano w temp. 37 ºC przez 12 h na wytrząsarce rotacyjnej przy 182 obr./min. Wyizolowano plazmidowe DNA z 1,5 ml przygotowanych w ten sposób hodowli bakteryjnych (izolacja plazmidowego Dna w małej skali) oraz zidentyfikowano klony zawierające wektor z insertem wklonowanym w poprawnej orientacji wykorzystując trawienie klonów rekombinowanego plazmidu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i/lub PCR.

  2. Bakterie szczepu XL1-Blue transfekowane odpowiednim plazmidem, w który wklonowano pożądany fragment DNA, wysiano na płytkę LB z karbenicyliną w stężeniu końcowym 100 μg/ml i inkubowano w temperaturze 37 ºC przez 12h. Z płytki pobrano jedną kolonię i zaszczepiono nią 10ml pożywki płynnej LB zawierającej karbenicylinę. Kultury inkubowano w temp. 37 ºC przy 182 obr./min. Aż do pojawienia się wyraźnego zmętnienia, po czym wykorzystano bezpośrednio jako szczep do przygotowania hodowli właściwej.

  3. W analogiczny sposób przygotowano hodowlę XL1-Blue, transformowanych wyjściowym plazmidem pGEX-2T.

  4. Z przygotowanych przez asystenta hodowli starterowych pobrano 5 ml zawiesiny komórek XL1-Blue transformowanych wektorem pGEX-2T lub pGEX-2T/ EcRDBD i przeniesiono je do dwóch osobnych kolb zawierających każda po 50 ml świeżego medium LB z karbenicyliną w stężeniu końcowym 100 μg/ml. Kolby inkubowano w temp. 37 ºC przy 182 obr./min., aż gęstość optyczna hodowli mierzona przy λ=600 nm (OD600) osiągnie wartość 0,5-0,6.

  5. Po uzyskaniu odpowiedniej wartości OD600 z obu kolb pobrano po 1ml hodowli, odwirowano w wirówce Eppendorfa (1,5 min, ~ 14000xg), odrzucono supernatant, a osad bakterii zawieszono w 100 μl 2xSB. Przygotowane w ten sposób próbki NI/EcRDBD ( z hodowli z wektorem pGEX-2T/EcRDBD) oraz NI/K (z hodowli z wektorem pGEX-2T) zamrożono w -20 ºC.

  6. Następnie do obu kolb odano 26μl ZnCl2 w stężeniu końcowym 50 μM oraz 26 μl IPTG w stężeniu końcowym 0,25 mM i kontynuowano inkubację w temp.37 ºC przy 182 obr./min.

  7. W czasie trwania hodowli pobierano po 1 ml próbki wg poniższego schematu:

Czas (min)

P (próbka)

K (kontrola)

0

-

-

15

A

-

30

B

-

60

C

-

90

D

-

120

E1 EcR

E2K

  1. Do pobranych zawiesin komórkowych po odwirowaniu i usunięciu supernatantów dodano 2xSB zgodnie z powyższą procedurą podaną dla próbek NI/EcRDBD i NI/K.

  2. Wszystkie probówki z uzyskanymi próbkami zamrożono w -20 ºC.

  3. Próbki białek bakteryjnych poddano denaturacji przez pięciominutową inkubację w temp. 95 ºC w termomikserze, po czym odwirowano w wirówce Eppendorfa przy ~14000xg przez 10 min.

  4. Przygotowano żel poliakrylamidowy i aparaturę do przeprowadzenia elektroforezy.

  5. Na żel naniesiono 7 μl roztworu niskocząsteczkowych białek standardowych, przygotowany w 1xSB, w przypadku próbek pobranych przed dodaniem IPTG, na żel naniesiono 12 μl roztworu, natomiast z próbek indukowanych- po 10 μl roztworu.

  6. Elektroforezę przeprowadzono w żelu poliakrylamidowym o wymiarach 97x55x1,5 mm w układzie nieciągłym (żel 4% - gówny, zagęszczający, żel 12%- dolny, rozdzielający), w warunkach denaturujących.

  7. Elektroforezę prowadzono w 1x buforze do SDS-PAGE, przez ok 1h, przy stałym natężeniu 30 mA.

  8. Po przeprowadzeniu elektroforezy żel umieszczono dwukrotnie w roztworze do odbarwiania żeli na 10 minut.

  9. Następnie żel zabarwiono przy pomocy roztworu z Coomassie, po czym odbariwono tło przez moczenie z roztworze do odbarwiania żeli.

  1. OD600 odczytane po 34 minutach inkubacji:

ODEcRDBD = 0,612

ODK = 0,553

  1. Zdjęcie żelu po elektroforezie SDS-PAGE