Chromatografia powinowactwa (AC)

• Rodzaj chromatografii adsorpcyjnej wykorzystujący wzajemne powinowactwo cząsteczki rozpuszczonej w fazie ruchomej i liganda unieruchomionego na nierozpuszczalnym nośniku (matrycy)

• Efektem jest specyficzne i odwracalne związanie obu elementów, bez utraty ich aktywności.

• Zastosowanie: izolacja i oczyszczanie wielu biologicznie aktywnych molekuł (białka, kwasy nukleinowe)

AC - zalety:

• brak ograniczeń co do objętości, stężenia próbki

• zachowanie aktywności biologicznej izolowanych cząsteczek

• bardzo wysoki stopień czystości izolowanych cząsteczek

• silne zatężenie izolowanych cząsteczek

• bardzo wysoka specyficzność

AC- wady:

• nietrwałość pewnych ligandów

• często konieczność samodzielnego przygotowania złoża

• trudności w uzyskaniu odpowiedniego liganda

AC - typy oddziaływań:

• enzym - substrat (lub analog substratu)

• enzym - inhibitor

• enzym - koenzym

• hormon - receptor (lub białko transportujące)

• przeciwciało - antygen

• przeciwciało z gr. IgG - dopełniacz

• kwasy nukleinowe - białka ( polimerazy - histony)

• kwasy nukleinowe zasad- komplementarna sekwencja zasad

• lektyny - glikoproteiny, polisacharydy

• jony metali - białka ( poprzez reszty His, Tyr, Trp, Cys)

• barwniki- białka

Dla każdej pary oddziałujących cząsteczek nie ma znaczenia, która z nich zostanie wybrana jako ligand (np. lektyna może być ligandem i służyć do wyizolowania glikoproteiny, ale i odwrotnie).

Strategie rozdziału:

• AC positive mode : z ligandem wiąże się cząsteczka docelowa, która nas interesuje (obejmuje izolację, oczyszczanie),

• AC negative mode: z ligandem wiążą się zanieczyszczenia

Etapy AC :

• Chemiczne związanie liganda ze złożem (immobilizajca liganda)

• Przepuszczenie przez kolumnę materiału zawierającego molekuły komplementarne do liganda

• Odmycie nieswoiście zaadsorbowanych molekuł

• Desorpcja powstałych kompleksów i elucja

Przygotowanie kolumny AC:

• Wypełniana złożem- biosorbentem (ligand obojętnie związany z nośnikiem wiązaniem kowalencyjnym)

• Nośnik (matryca)

• Obojętny fizycznie i chemicznie (niska adsorpcja niespecyficzna)

• Stabilny w stosowanych warunkach rozdziału chromatograficznego (odporność na niskie i wysokie pH, obecność detergentów itp.)

• O dużej powierzchni wiązania liganda (porowatość)

Nośniki w chromatografii powinowactwa: (nośnik musi być zaktywowany)

• żele agarozowe (np. Sepharose 4B)

• żele dekstranowe (Sephadex)

• żele poliakrylamidowe

• celuloza

Przygotowanie biosorbenta:

• aktywacja nośnika = derywatyzacja grup funkcyjnych nośnik celem umożliwienia kowalencyjnego związania liganda

• przyłączenie cząsteczki liganda w sposób warunkujący zachowanie jego aktywności biologicznej i kolumna gotowa do użytku

Odczynniki aktywujące nośnik:

1. Dla ligandów z grupą aminową:

• bromocyjan (CNBr)

• kwas 6-aminoheksanowy

• nadjodan

2. Dla ligandów z grupą OH- epichlorohydryna

3. Dla ligandów z grupą SH- tiole

Sposoby wiązania ligandów:

• białko: gr. aminowe, karboksylowe ( reszty Glu, ASP), sulfhydrylowe ( reszty Cys), hydroksylowe (reszty Tyr, Ser, Thr)

• kwasy nukleinowe : grupy enolowe zasad azotowych, reszty fosforanowe

• cukry lub reszty cukrowe glikoprotein: grupy hydroksylowe

Złoże zaktywowane ugrupowaniem epoksy- NH₂, COOH, SH, OH- można dzięki nim związać każdy typ liganda.

Grupa dystansowa (spacer)

Zwiększa się możliwość wiązania makromolekuł do niskocząsteczkowego liganda→eliminuje efekty steryczne reszt cukrowych nośnika podczas sorpcji makromolekuł + lepsze wiązanie liganda. Ligandem jest krótki peptyd (koenzymy, hormony), a substancja izolowana przy jego pomocy jest znacznie większa i może mieć przysłonięte miejsce wiążące ligand. Zazwyczaj to łańcuch alifatyczny nasycony 6-węglowy.

Rodzaje ligandów:

1. Ligandy monospecyficzne:

• Wiążą się tylko z jednym konkretnym związkiem (są strukturalnie i biologicznie dopasowane do związku, który ma być izolowany)

• Przykłady : antygeny, przeciwciała, hormony, receptory, enzymy.

• Idealna selektywność danej metody, są rzadko stosowane

2. Ligandy grupowospecyficzne:

• Wiążą się z określonymi grupami związków docelowych (o szerokim zakresie specyficzności; wykazują powinowactwo do grupy substancji podobnych strukturalnie lub funkcjonalnie)

Przykłady ligandów grupowospecyficznych:

• awidyna - białko wykazujące duże powinowactwo do biotyny (wiele związków może być łatwo biotynylowanych, z zastosowaniem ich aktywności biologicznej); biotynylowane przeciwciała

• lektyny - wysokie powinowactwo do wiązania komponenty cukrowej (oczyszczanie polisacharydów, glikoprotein i innych glikokoniugatów);

• węglowodany i ich pochodne - oferują skuteczny sposób oczyszczania białek, które rozpoznają i wiążą sekwencje węglowodanowe, np. lektyn, glikozydaz;

• heparyna(sulfonowany glikozoaminoglikan) - cukrowe sekwencje heparyny działają jako specyficzne miejsca wiążące dla wielu białek (np. oczyszczanie białek koagulacyjnych plazmy, białek osoczowych, enzymów, kwasów nukleinowych, lipaz, czynniki krzepnięcia krwi, czynniki wzrostu, proteazy, cytokiny);

• nukleotydy i koenzymy nukleotydowe - użyteczne do oczyszczania wielu białek;

• kwasy nukleinowe do oczyszczania polimeraz DNA i RNA, białek rybosomalnych i białek regulacyjnych;

• białko A i białko G - do oczyszczania immunoglobulin klasy G

• lizyna- do rRNA, DNA, plazminogenu

• poliuracyl- do m RNA

• barwnik Cibacron blue- do albumin, wiele enzymów

• kalmodulina- z regulowanymi przez nią kinazami, Cykladami, fosfatazami

• AMP- z kinazami zależnymi od AMP, enzymami, kofaktorem NAD

• Jony metali przejściowych- z białkami i peptydami zawierającymi dostępne reszty His

Lektyny:

• białka posiadające przynajmniej 2 miejsca wiążące, fragment cukrowy innych cząsteczek (oligo- i polisacharydy, glikoproteiny)

• konkanawalina A (z roślin strączkowych)

• hemoglutynina wirusa grupy (odpowiedzialne za przyleganie do komórki gospodarza i fuzję błon )

• selektywny zwierzęce (oddziaływania międzykomórkowe)

• aglutynina związków pszenicy

Glikoproteiny- przykłady

∙ białka strukturalne ( kolagen)

∙ substancje o właściwościach ochronnych i poślizgowych ( mucyny)

∙ białka błon komórkowych

∙ niektóre substancje grupowe krwi

∙ białka transportujące (transferryna, ceruplazmina)

∙ białka biorące udział w procesach odporności ( immunoglobuliny, antygeny układu zgodności tkankowej)

∙ hormony (gonadotropina kosmówkowa) hormony tyreotropowe)

∙ enzymy (fosfataza alkaliczna)

∙ białka biorące udział w oddziaływaniu komórka - komórka, wirus - komórka , bakteria - komórka, hormon komórka itp.

Etapy analizy AC:

1. kondycjonowanie kolumny- przemywanie buforem wiążącym (startowym) o parametrach (pH, siła jonowa) promujących adsorpcję cząsteczek docelowych

2. wprowadzenie próbki (adsorpcja)

3. odmycie niezwiązanych i związanych niespecyficznie składników próbki (buforem startowym)- chodzi o przemywanie kolumny- w kolumnie zostają tylko cząstki, które nas interesują

4. elucja (desorpcja)- prowadzona skokowo (oczyszczenie białka) lub gradientowo

1. niespecyficzna- wykorzystuje bufor eluujący O parametrach promujących desorpcję

1. bez zmian konformacyjnych liganda i cząsteczki docelowej; wzrost siły jonowej (NRCl), obniżenie polarności (glikol etylenowy)

2. zmiany konformacji: drastyczna zmiana pH, czynniki cheotropowe (4-8M mocznik)

2. biospecyficzna- bufor eluujący zawiera:

1. cząsteczki kompetytora o większym niż cząsteczka docelowa powinowactwie do unieruchomionego liganda

2. cząsteczki wolnego liganda (lub jego analogu), który współzawodniczy z unieruchomionym ligandem o miejsce wiążące cząsteczki docelowej

5. regeneracja kolumny

Warunek:

Warunki wiązania i elucji należy dobrać tak, aby te procesy zachodziły szybko i całkowicie oraz nie wpływały na aktywność biologiczną ligandu i cząsteczek docelowych

Odwracalną reakcję między ligandem, a cząsteczka docelową charakteryzuje siła dysocjacji wytworzonego kompleksu, która zależy m.in. od pH, siły jonowej, polarności i temp. środowiska

Optymalne wiązanie : 10^-4 do 10^-8 M

Optymalna elucja : 10^-1 do 10^-2 M

Kondycjonowanie kolumny

Przemywanie buforem wiążącym ( startowym) o parametrach (pH, siła jonowa) promujących adsorpcję cząsteczek docelowych.

Wprowadzenie próbki:

specyficzna absorpcja i oddziaływanie niespecyficzne

Przemywanie kolumny:

Elucja - wymywanie cząsteczek docelowych

1 i 2 - elucja niespecyficzna

3 i 4 - elucja biospecyficzna

Prowadzona skokowo lub gradientowo

Elucja niespecyficzna:

Bufor eluujący o parametrach promujących desorpcję:

1= bez zmian konformacyjnych liganda. i cząsteczki docelowej: wzrost siły jonowej (NaCl), obniżenie polarności (dioksan, glikol etylenowy)

2= zmiany konformacji: drastyczna zmiana pH, czynniki chaotropowe (6M chlorowodorek guanidyny, 4-8M mocznik).

Elucja biospecyficzna:

Bufor eluujący zawiera:

3= cząsteczki kompetytora o większym niż cząsteczka docelowa powinowactwie do unieruchomionego liganda

4= Cząsteczki wolnego liganda (lub jego analogu), który współzawodniczy z unieruchomionym ligandem o miejsce wiążące cząsteczki docelowej.

Frakcjonowanie IgG z surowicy

∙ Ligand = białko A produkowane przez Staphylococcus ureus wiąże fragment Fc IgG (protein A - Sepharose Cl 4B)

∙ Powinowactwo do liganda zależy od podklasy i pochodzenia gatunku IgG

∙ 1 etap : związanie całej puli IgG ze złożem (bufor fosforanowy pH=8)

∙ 2 etap : frakcjonowanie IgG za pomocą eluenta o malejącym pH (rosnąca siła rugowania - elucja gradientowa)

Frakcjonowanie glikoprotein z osocza

∙Ligand = konkanawalina A (ConA - Sepharose 4B)

∙ Powinowactwo do liganda zależy od liczby i umiejscowienia reszt cukrowych

∙ Bufor startowy: fosforanowy pH - 7,5

∙ Elucja gradientowa buforem fosforanowym zawierającym wzrastające stężenie kompetytorów (glukoza i mannoza)

Zastosowanie AC:

• Izolowanie tio-glikoprotein (białek zawierających wolne grupy SH)

• Frakcjonowanie podklas immunoglobulin G z surowicy z zastosowaniem białka A

• Izolowanie fragmentów F_ab i F_c immunoglobulin za pomocą białka A

• Frakcjonowanie glikoprotein osocza krwi z zastosowaniem konkanawaliny A

• Izolowanie białek wiążących jony metali

• Izolowanie enzymów od NAD⁺ i NADP⁺ z zastosowaniem złoża Blue Sepharose (z barwnikiem Cibacron Blue F36-A wykazującym wysokie powinowactwo do enzymów i białek)

• Izolowanie mRNA z zastosowaniem złoża zawierającego długie łańcuchy kwasów poliurydylowych tzw. poli(U) (wiąże w prawie każdym mRNA komplementarną sekwencję kwasu poliadenylowego poli(A)

• Badanie dynamicznej adhezji komórek na unieruchomionych białkach adhezyjnych

---