Nowoczesne techniki cytogenetyczne

Anna Latos-Bieleńska

Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu

Metody cytogenetyki klasycznej

Zalety

• Duża dostępnośc badania (badanie szeroko stosowane we wszystkich ośrodkach genetyki medycznej

• Stosunkowo niski koszt badania

Wady

• Ograniczona rozdzielczośc badania (5-10 Mb w zależności od jakości preparatów cytogenetycznych)

• Wiarygodnośc badania zależy od doświadczenia cytogenetyka

• Badanie możliwe tylko na komórkach dzielących się

• Oczekiwanie na wynik od 5 dni do 3 tygodni

FISH - nowoczesna technika badania kariotypu podnosząca jakość diagnostyki cytogenetycznej

Zalety:

• Technika uzupełniająca metody cytogenetyki klasycznej poprzez identyfikację addycji, insercji oraz chromosomów markerowych.

• Dzięki dużej rozdzielczości (< 3 Mpz, nawet do 0,5 kbz) umożliwia wykrycie submikroskopowych aberracji chromosomowych. Metoda z wyboru w diagnostyce mikrodelecji

• Umożliwia szybką analizę setek komórek (ważne w przypadku kariotypów mozaikowych)

• Umożliwia badanie aberracji chromosomowych w komórkach nie dzielących się

• Pozwala na szybkie uzyskanie wyniku ( do 24 godz.)

• Umożliwia badanie materiału archiwalnego (kostki parafinowe)

• Pozwala na badanie pojedynczej komórki (ważne w diagnostyce genetycznej preimplantacyjnej!)

Wady:

• Nie pozwala na analizę całego kariotypu

• Wysoki koszt odczynników, zwłaszcza sond molekularnych

Zasada FISH

Odpowiednio dobrana sonda molekularna (fragment DNA) wyznakowana fluorochromem nałożona na preparat (chromosomy lub jądra komórkowe na szkiełku podstawowym) wiąże się z DNA materiału biologicznego w preparacie i w tym miejscu obserwujemy pod mikroskopem fluorescencję.

Sondy molekularne w FISH

• Specyficzne - komplementarne do określonego regionu chromosomu

• Centromerowe - komplementarne do centromerów

• Malujące - pokrywające cały chromosom lub poszczególne jego ramiona

Sonda malująca sonda centromerowa

FISH - widoczna translokacja insercyjna FISH do jądra interfazowego - triploidia

SKY-FISH - analiza widmowa kariotypu

Stosuje się jednocześnie 24 sondy molekularne (dla każdej pary chromosomów autosomalnych oraz dla X i Y inna) wyznakowane różnymi kombinacjami 5 różnych fluorochromów.

Komputerowa analiza widmowa obrazu po hybrydyzacji - ocena całego kariotypu w jednym badaniu.

CGH - Porównawcza hybrydyzacja genomowa

Potrzebne:

Preparat cytogenetyczny (chromosomy osoby o prawidłowym kariotypie)

DNA osoby badanej wyznakowany jednym fluorochromem (np. fluorescencja zielona)

DNA kontrolny - prawidłowy DNA wyznakowany innym fluorochromem (np.fluorescencja czerwona)

Cot1 DNA do wysycenia regionów zawierających sekwencje wysoko powtarzające się

Zasada metody:

Na preparat cytogenetyczny nakłada się DNA pacjenta i DNA kontrolny (1:1) i prowadzi hybrydyzację. Po hybrydyzacji analiza komputerowa obrazu. Interpretacja wyników:

Przewaga fluorescencji zielonej - duplikacja materiału genetycznego pacjenta

Przewaga fluorescencji czerwonej - delecja materiału genetycznego pacjenta

Zalety

• Umożliwia badanie całego genomu (wszystkich chromosomów)

• Nie wymaga hodowli komórek pacjenta

• Można wykorzystac materiał archiwalny (kostki parafinowe)

• Można zrobi badanie na podstawie pojedynczej komórki

Wady CGH

• Nie wykrywa aberracji zrównoważonych

• Nie wykrywa triploidii

• Wysoki koszt badania

Array CGH

Zasada techniki taka sama jak dla CGH (tzn. DNA kontrolny i DNA badany wyznakowane różnymi fluorochromami), ale sekwencja docelowa to małe odcinki DNA umieszczone na nośniku (mikromacierz). Olbrzymia rozdzielczośc badania. Obecnie jeszcze koszt badania bardzo wysoki, ale jest to technologia przyszłości.

1

---