1. Ogólna charakterystyka enzymów i mechanizm ich działania

Enzym - chiralny „rozpuszczalnik” określonego substratu (-ów), zapewniający środowisko reakcji odpowiednie dla optymalnego efektu katalitycznego

1. są to białka o masie 9-155 kDa, jeśli są zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego i do 6*10⁶ Da w przypadku enzymów oligomerycznych

2. Charakteryzują się strukturalną czułością, czyli specyficznością, tj. decydują o kierunku przemian substratu (-ów) o określonej strukturze. Ich specyficzność jest wyższa niż innych katalizatorów

3. Przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji o co najmniej 10⁶ razu, dzięki znacznemu obniżeniu swobodnej energii aktywacji. Jest to efektem zmiany molekularnego mechanizmu reakcji względem reakcji niekatalizowanej (spontanicznej)

W trakcie katalizy enzymatycznej zachodzą zmiany konformacyjne zarówno w enzymie jak i w substracie. Właściwe związanie substratu przez enzym ma pierwszorzędne znaczenie.

2. Specyficzność enzymów

Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną substratu, działając wyłącznie na jedną z nich - tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie można dokonać w inny znany sposób.

Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję lub grupę ściśle spokrewnionych przemian chemicznych. Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji (do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu).

Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, drugą - izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzecią - fosfoglukomutaza.

Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. proteinazy, lipazy czy amylazy hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych α-glukanu niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej specyficzności (wysoko specyficzne).

Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, która przekształca bursztynian do fumaranu (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-1,2).

3. Enzymy jako białka globularne -hierarchiczna organizacja cząsteczki

Struktura I-rzędowa:

Sekwencja aminokwasów=sekwencja wiązań peptydowych, niektórzy za strukturę I rzędową uznają opis wszystkich wiązań walencyjnych, łącznie z disulfidowymi. Str. I rzędowa uwarunkowana jest ułożeniem wiązań peptydowych. Aminokwasy połączone są ze sobą za pomocą wiązań peptydowych, w których można wyróżnić grupę peptydową:Te cztery atomy zawsze występują w jednej płaszczyźnie. Pierwotne zwinięcie łańcucha polipeptydowego określają nam kąty rotacji psi i fi. Wiązanie peptydowe jest bardzo trwałe, gdyż może występować w formie obojętnej i formie dipolarnej.Następuje ciągła rotacja wiązania podwójnego. W sensie chemicznym wiązanie peptydowe jest wiązaniem amidowym, dzięki rotacji wiązanie C - N jest krótsze niż w innych amidach, a wiązanie C - O jest dłuższe niż w ketonach. Jednostka peptydowa to węgiel alfa, węgiel karbonylowy, oraz grupa iminowa. Reszta aminokwasowa to węgiel alfa wraz z podstawnikami i grupą iminową.

Struktura II-rzędowa:Konformacja krótkich fragmentów łańcucha polipeptydoewego, konformacja głównego łańcucha (bez reszt bocznych), stabilizują ją wiązania wodorowe (oddziaływania bliskiego zasięgu)

Przykład α-helisa Łańcuch polipeptydowy jest zwinięty prawoskrętnie i nawinięty na walec; płaszczyzny wiązań peptydowych są styczne do powierzchni walca. Tlen karbonylowy każdego wiązania peptydowego jest połączony wiązaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei amk. Na jeden obrót helisy przypada 3,6 reszt aminokwasowych, jest to struktura prawoskrętna, jest dipolem ( wewnętrzny niepolarny rdzeń, na zewnątrz polarne reszty aminokwasowe - wystawione na zewnątrz). Amk. helisotwórcze: Ala, asn, cys, his, leu, met, phe, trp, tyr, val; amk. zaburzające: arg, asp, glu, gly, lys, ser; amk. destabilizujące: pro, pro-OH. Po jednej stronie helisy występują reszty amk. hydrofobowych, a po przeciwnej przeważają reszty amk. Co 4 wiązanie peptydowe jest spięte wiązaniem wodorowym pomiędzy grupą NH a grupą C-O, powstaje mostek wodorowy (który jest w przybliżeniu równoległy do osi helisy). Hydrofilowych. Pralina i hydroksyproliny, glicyny w helisie nie ma są to łamacze helisy. Stabilizowane jest wiązaniami wodorowymi

Struktura β - fałdowa:

Wiązania wodorowe powstają pomiędzy wiązaniami peptydowymi różnych łańcuchów polipeptydowych lub różnych części tego samego łańcucha. Płaskie wiązanie peptydowe sprawia, że łańcuch polipeptydowy przyjmuje postać pofałdowanej kartki. Struktura ta utrzymywana jest przez mostki wodorowe, ale są to oddziaływania odległe od siebie (tzw. Dalekiego zasięgu) - co kilkadziesiąt reszt a nie tak jak w alfa-helisie co 4. Łańcuchy sąsiadujące ze sobą mogą być równoległe (mostki wodorowe są w przybliżeniu prostopadłe do osi) lub antyrównoległe (mostki wodorowe są równoległe do osi). Struktura B-fałdowa występuje częściej niż α-helisa w białkach enzymatycznych. Odległość między sąsiadującymi aminokwasami wzdłuż osi wynosi 0,35nm

Struktura kolagenu

Jest to struktura trójniciwej helisy, występuje wyłącznie u ssaków w tkance łącznej, występuje w kolagenie. Ponad 65% czasteczki tego białka stanowią trzy aminokwasy: Glicyna 33%, Pralina z Hydroksyproliną 21% i Alanina 11%, pojawiają się one z dużą częstością. Nie występują wiązania wodorowe w obrebie jednego łańcucha, mogą byś wiązania wodorowe pomiędzy sąsiadującymi aminokwasami każdego z łańcuchów.

Struktura III- rzędowa

Struktura naddrugorzędowa: uporządkowanie przyległych do siebie krótkich fragmentów polipeptydowych, o określonej strukturze II- rzędowej. Układy struktur naddrugorzędowych:Fałda Rossmana,Beta - meander,Klucz grecki,Domena białkowa: większy odcinek łańcucha wyodrębniony w samodzielna strukturę przestrzenną. Obok domen strukturalnych są też funkcjonalne.Białko globularne: konformacja cząsteczki jako całość.Wiązania stabilizujące strukturę naddrugorzędową i domeny białkowe to: wiązania wodorowe inne niż w strukturze II rzędowej, oddziaływania jonowe, elektrostatyczne, hydrofobowe, wiązania van der waalsa.

4. Budowa centrum aktywnego enzymów -ogólny model.

Centrum aktywne enzymów- obszar cząsteczki białka enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego przekształcenie w produkt (odpowiedzialny bezpośrednio za katalizę reakcji). Centrum aktywne jest zlokalizowane w głębi globularnej cząsteczki białka w kieszonce. Jest zbudowane głównie z aminokwasów hydrofobowych, czyli są tam warunki hydrofobowe.Centrum aktywne to najczęściej kilka aminokwasów z całej cząsteczki, które leżą w względem siebie w ściśle określonej konfiguracji przestrzennej. Nawet minimalne zaburzenie budowy centrum aktywnego może zaowocować brakiem aktywności enzymatycznej. Enzymy katalizujące określoną reakcję wyizolowane od różnych gatunków zwierząt cechują się z reguły różnicami aminokwasów w pozostałej części cząsteczki enzymu, jednak centrum aktywne u wszystkich tych gatunków pozostaje identyczne. Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego:

-pomocnicze- ich zadaniem jest utrzymanie konformacji centrum aktywnego

-wiążące lub kontaktowe- odpowiedzialne za odróżnienie substratu i wciągniecie go do kieszonki. Odpowiedzialne za specyficzność substratu

-bezpośrednio działające-odpowiedzialne za specyficzność kierunkową

-wspomagające-wspomaga w niektórych enzymach aminokwas bezpośrednio działający

W obszarze centrum aktywnego występują aminokwasy kontaktowe, wiążące i katalityczne (aminokwasy występujące w miejscu katalitycznym) - wszystkie znajdują się najbliżej cząsteczki substratu, zwykle w odległości 1 wiązania kowalencyjnego. Aminokwasy występujące w centrum aktywnym mają najczęściej charakter polarny, przez co ich oddziaływanie jest znacznie silniejsze.

Miejsce wiążące to miejsce w centrum akt., gdzie substrat wiąże się z enzymem. Oddział. pomiędzy substratem a amk. z miejsca wiążącego są szczególnie silne.

Miejsce katalityczne - miejsce w c.a. gdzie enzym oddziaływuje silnie z substratem. Umiejscowione są w nim amk. kontaktowe katalityczne.

W skład c.a. wchodzą najczęściej amk. polarne, choć nie zawsze zjonizowane; to m.in.: his, ser, asp, glu, cys, arg, lys, tyr, thr

5. Kinetyka reakcji enzymatycznych; stale kinetyczne, charakteryzujące przebieg reakcji.

Stała Michaelita - określa powinowactwo enzymu do substratu

charakteryzuje pierwszy etap reakcji katalitycznej (etap fizyczny łączenia enzymu z substratem)

jest to takie stężenie substratu które odpowiada połowie szybkości maksymalnej . stałą Michaelisa jest to takie stężenie substratu przy którym połowa cząsteczek enzymu obecnych w układzie jest związana w kompleksy z cząsteczkami substratu.

K_m= (K_kat+ k₁)/ k₁ V = V_max / [(K_m/s) + 1]

odwrotność K_m (1/K_m) liczbowo określa powinowactwo enzymu do substratu im niższa Km tym łatwiej powstaje kompleks ES

Stała katalityczna

określa zdolność osiągnięcia przez substrat stanu tranzycji.

oznacza się liczbą cząsteczek substratu przekształconą w ciągu jednej sekundy przez jedna cząsteczkę enzymu

Stała efektywności

Definiuje zdolność/wydajność lub specyficzność katalityczną enzymu

K_ef - stała efektywności K_ef = K_kat /K_m

Etapy reakcji enzymatycznej:

1. Rozpoznanie i związanie substratu w centrum aktywnym (powstaje kompleks enzym - substrat), dzięki oddziaływaniu reszt aminokwasów wiążących zlokalizowanych w kieszeni katalitycznej (etap charakteryzowany przez Km) - etap fizyczny

2. Oddziaływania pomiędzy atomami występującymi w centrum aktywnym a atomami pochodzącymi z substratu prowadzą do zdeformowania i polaryzacji wiązań. Cały układ staje się bardziej reaktywny, następuje spadek entropii układu. Jest to tzw. etap entropowy, kompleks ES osiąga stan tranzycji. Następuje wtedy spontaniczna przemiana substratu w produkt. (etap charakteryzowany prze k_kat) - etap chemiczny.

3. Uwolnienie produktu z kompleksu z enzymem

6. Klasyfikacja enzymów

Klasyfikacja i nomenklatura enzymów:

Nazwa enzymu składa się zazwyczaj z dwóch części. Pierwsza jest utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj. Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w reakcji np. oksydoreduktaza alkoholowa- EC 1.1.1.1. Każdy enzym ma nazwę oficjalną np. alfa-amylaza

Klasyfikacja enzymów:

Podział na klasy wynika ze specyficzności enzymów:

EC 1-oksydoreduktazy (prowadzą reakcje redukcji i utlenienia, które wiążą się z przenoszeniem atomów wodoru bądź też samych lektronów z donora na akceptor)

EC 2-transferazy (przenoszą grupy funkcyjne, większe reszty inne niż wodór)

EC 3-hydrolazy(hydrolityczne rozszczepienie wiązań kowalencyjnych, nie wymagają działania koenzymów)

EC 4-liazy (niehydrolityczne rozszczepienie wiązań kowalencyjnych)

EC 5-izomerazy (katalizują przemiany wewnątrz cząsteczkowe)

EC 6-ligazy (syntetyzujące wiązania kowalencyjne)

7. Metody oznaczania aktywności enzymów. Miarą czego jest aktywność? Aktywność enzymatyczna. Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu. Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne.

Metody oznaczania aktywności enzymów:

1. spektrofotometryczne

Stosowane gdy substrat lub produkt maja określone maksimum absorbancji w nadfiolecie

Widmo pochłaniania substratu i produktu musi się różnić

Mierzy się spadek lub wzrost absorbancji przy określonej długości fali

Często śledzi się przebieg reakcji w czasie

Dehydrogenaza alkoholowa

Miarą szybkości reakcji (aktywności enzymu) jest wzrost absorbancji zredukowanego koenzymu NADH2

2. fluorymetryczne

3. manometryczne

4. potencjometryczne

5. kolorymetryczne

6. wizkozymetryczne

8. Kryteria doboru metod oczyszczania białek enzymatycznych

1. Rozdział mieszanin białek w oparciu o różnice rozpuszczalności:

-Frakcjonowane wysolenie solami nieorganicznymi- nie prowadzimy wysolenia długo, najlepiej zbierać frakcje przy nasyceniu solą 50-80% (siarczan amonu, chlorek sodu)

-Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi np.: etanol, aceton- niskie temp procesu, wydajność musi być jak największa

-Frakcjonowanie rozpuszczalnymi polimerami niejonowymi np.: glikopolietylenowy

-Termiczna denaturacja białek towarzyszących- enzymy termofilne

-Wytrącanie białek w pI

-Specyficzne absorpcje w nierozpuszczalnym ekstrakcie np.: dla α-amylazy; substratem dla niej jest skrobia i jest ona nierozpuszczalna (wiązanie enzymów amylolitycznych, adsorpcja enzymów celulolitycznych)

-Krystalizacja- w ten sposób otrzymano trypsynę (bezpośrednio z surowych ekstraktów)

2. Metody chromatograficzne (najbardziej efektywne)

-Sączenie molekularne na sitach molekularnych (Sephadex, Bio-gel, Sepharose)

-Chromatografia jonowymienna na nośnikach naturalnych i syntetycznych- wykorzystuje się kationity (dla rozdziału białek, które przy danym pH występują w formie kationu) i anionity (występują w formie anionu)

-Chromatografia adsorpcyjna

-Chromatografia powinowactwa biologicznego- najbardziej efektywna

-Chromatografia hydrofobowa (wiązanie białka na zasadzie oddziaływań hydrofobowych ze złożem)

-Chromatografia kowalencyjna- białko wiąże się kowalencyjnie z jakimiś grupami matrycy

-Chromatografia na matrycach ze związanymi jonami metali ciężkich

3. metody immunochemiczne - oparte o oddziaływania białko-przeciwciało, przeciwciała specyficzne dla danego enzymu. metoda bardzo czuła.

9. Metody oznaczania aminokwasów N- i C-terminalnych w białkach

Analiza aminokwasów C-terminalnych

1. Metody enzymatyczne:

• Wykorzystanie arboksypeptydazy A- odszczepia C-końcowe aminokwasy aromatyczne i duże reszty alifatyczne

• Wykorzystanie karbksypeptydazy B- odszczepia C-końcowe aminokwasy zasadowe

Metoda chemiczna- hydrazynoliza białka (tetrapeptyd + hydrazyna-> hydrazydy)

Analiza aminokwasów N-terminalnych

1. Metoda Sangera z FDNB - następuje kondensacja z wolną grupą aminową - wydziela się fluorowodór.

• Stosuje się odczynnik FDNB, który łączy się specyficznie z ak. N-końcowym

• Białko poddajemy denaturacji

• Po hydrolizie otrzymujemy mieszanin ak., w tym ak. N-końcowy zabarwiony na żółto

• Mieszaninę poddajemy elektroforezie i porównujemy z mapą ak.

Metoda Edmana - metoda zautomatyzowana z fenyloizotiocyjanem (można oznaczyć około 15 aminokwasów)

• Odczynnik znakujący łączy się z aminokwasem N-końcowym w środowisku zasadowym

• Jeżeli obniżymy ph to nastąpi odszczepienie ak. N-końcowego z odczynnikiem

• Następuje cyklizacja ak. I powstaje jego pochodna

• Pozostałe białko można znów poddać alkalizacji, wtedy znakowany jest kolejny ak. od N-końca

3. Metoda Gray'a z chlorkiem dansylu

• Odczynnikiem znakującym jest chlorek dansylu

• Białko poddajemy hydrolizie w celu odszczepienia ak. N-końcowego

• Otrzymujemy fluoryzującą pochodną ak.

• Białko skrócone o jeden ak. można znów poddać kondensacji z chlorkiem dansylu

4. Metoda Starka z cyjanianem potasu

• Odczynnik znakujący- cyjanian potasu

Po hydrolizie otrzymujemy pochodną hydantoinową ak. N-końcowego. Oznaczanie aminokwasów N-końcowych jest bardzo ważne dla poszukiwania genów danego białka w DNA.

10. Metody oznaczania masy cząsteczkowej enzymów

1. Metody chemiczne

• Oznaczanie minimalnej masy cząsteczkowej

M_min= (m_at pierwiastka/ % pierwiastka w białku) *100%

Obarczona dużym błędem w przypadku białek oligomerycznych

• Wyliczenie na podstawie składu chemicznego sekwencji ak. (bardzo dokładna metoda).

2. Metody fizykochemiczne

• Pomiar ciśnienia osmotycznego

• Pomiar szybkości sedymentacji (rzadko stosowana, bo potrzeba dużej ilości białka)

• Filtracja żelowa- stosuje się molekularne sita

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym- o przesunięciu białka w żelu decyduje jego masa cząsteczkowa, jeżeli uzyskuje się różne wyniki dla różnych stężeń żelu oznacza to, że białko jest glikoproteiną. Należy wtedy wybarwić żel odpowiednim odczynnikiem reagującym na obecność cukrów. Elektroforeza w warunkach SDS (siarczan diacylu sodu) nadaje białkom ładunek ujemny.

11. Syntetaza kwasów tłuszczowych jako przykład kompleksu wieloenzymowego

Kw. tłuszczowe są syntetyzowane w cytozolu, natomiast acetylo-CoA w mitochondriach. Musi on być zatem przeniesiony do cytozolu, jednakże mitochondria są małoprzepuszczalne dla acetylo-CoA. Przeniesienie każdej cząsteczki acetylo-CoA z mit. do cyt. wiąże się z utworzeniem jednej cząsteczki NADPH2. Synteza kw. tł. zaczyna się od karboksylacji acetylo-CoA, co prowadzi do utworzenia malonylo-CoA., Syntezę malonylo -CoA prowadzi karboksylaza acetylo-CoA, enzym zawierający biotynę jako grupę prostetyczną.(rys2) Jest to kompleks wieloenzymatyczny. Biotyna wiąże się kowalencyjnie z niewielkim białkiem, zwanym nośnikiem karboksybiotyny. Karboksylacja związanej z tym białkiem biotyny zachodzi przy udziale karboksylazy biotytowej. Trzeci składnik kompleksu to transkarboksylaza, która katalizuje przeniesienie zaktywowanej grupy CO2 z karboksybiotyny na acetylo-CoA. Czynnik umożliwiającu przeniesienie grupy z jednego miejsca na drugie to długie i elastyczne ramie wiążące biotynę z nośnikiem białkowym. Aktywność karboksylazy acetylo-CoA jest regulowana allosterycznie.

Syntetaza kw. tł.: składa się z 7 podjednostek; kompleks wykazuje następujące aktywności:

1. 1.transacylazy acetylowej, przenosi reszty acetylowe, arylowe, wykazuje aktywność transacylową

2. transacylazy malonylowej,

3. syntetazy 3-ketoacylowej, aktywność enzymu kondensującego

4. reduktazy 3-ketoacyloACP,

5. dehydratazy 3-hydroksyacyloACP,

6. reduktazy enoiloACP,

7. ACP z fosfopanteiną.

W procesach syntezy biorą udział dwa rodzaje grup tiulowych: peryferyjne(reagują szybko) oraz centralne (reagują wolno).

Reduktazy w sprzężeniu ze zredukowanym NADP. U Eukariota Syntetaza kwasów tłuszczowych bskłada się z dwóch podjednostek. Każdy łańcuch jest tak zamknięty, że zawiera 3 funkcjonalne domeny, które są połączone elastycznymi rejonami:

• Domena I odpowiedzialna za wejście substratów i ich kondensację, zawiera aktywność transferazy acetylowej i malonylowej oraz syntezy beta-ketoacylowej.

• Domena 2 odpowiedzialna za redukcję, zawiera białkowy nośnik grup arylowych, reduktazę ketoacylową, dehydrogenazę oraz reduktazę enoilową.

• Domena 3 zawiera tioesterazę, stąd w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym znajduje się 7 różnych miejsc katalitycznych.

Syntetaza kwasów tłuszczowych zlokalizowana w cytoplazmie ma inny charakter u organizmów Eukariota i prokariota. Syntetaza kwasów tłuszczowych zachodzi w cytozolu. Reduktorem jest NADPH, enzymy katalizujące proces są zorganizowane w kompleksy multienzymatyczne. Fosfopantoneina - bierze udział w reakcji, u Prokariota ten enzym jest inny niż u Eukariota. U prokariota składa się z 6 podjednostek o różnych aktywnościach i z pałeczkowatego białka (ACP). Na jednym końcu tego nośnika grup arylowych jest Fosfopantoneina zakończona grupą SH. Grupa 3 wykazuje aktywność kondensującą, znajduje się dodatkowa grupa SH.

12. Szlak syntezy kwasów tłuszczowych

Synteza kwasów tłuszczowych zachodzi w cytozolu, w cytoplazmie. Substrat dla tej syntezy (reszta acetylolowa) powstaje w mitochondriach. Reszta acetylowa pochodzi z oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu.

• Faza elongacji rozpoczyna się od utworzenia acetylo-ACP i malonylo-ACP, Substratami są acetylo i malonylo-CoA. Substancją wyjściową dla syntezy kw. tł. o nieparzystej liczbie At. C jest propionylo-ACP, powstający z propionylo-CoA.

• acetylo-ACP reaguje z malonylo-ACP, dając acetoacetylo-ACP, reakcja jest katalizowana przez syntetazę, z jednej cząsteczki dwu-C i jednej 3-C, powstaje cząst. 4-C i uwalnia się CO₂

• następne 3 etapy w syntezie kw. tł. polegają na redukcji grupy ketonowej do grupy metylenowej:

1. acetoacetylo-ACP jest redukowany do D-3-hydroksybutynylo-ACP, czynnik redukujący NADPH;

2. D-3-.. ulega odwodnieniu, co prowadzi do powstania krotonylo-ACP;

3. redukcja krotonylo-ACP do butynylo-ACP, reduktor - NADPH. W drugim cyklu syntezy butynylo-ACP kondensuje z malonylo-ACP

W biosyntezie kwasów tłuszczowych wykorzystywane są dwa substraty:

• reszta acetylowa (czyli acetyloCoA)

• Reszta malonylowa (malonyloCoA)

W pierwszym etapie reszta acetylowa zostaje przyłączona do tiolu centralnego. Ramię molekularne przerzuca resztę acetylową do tiolu peryferyjnego i tiol centralny zostaje uwolniony. Reszta malonylowa przyłącza się do tiolu centralnego (reszta musi najpierw wejść do centrum aktywnego). Tiol centralny wprowadza ją do centrum aktywnego enzymu kondensującego. Następnie reakcja kondensacji.

13. Etapy enzymatycznej karboksylacji

Reakcje karboksylacji polegają na enzymatycznym przyłączeniu cząsteczki dwutlenku węgla do karboanionu, produktu pośredniego w tych reakcjach. Ważnym warunkiem jest stabilizacja karboanionu. Czynnikiem elektrofilowym w reakcjach jest cząsteczka dwutlenku węgla lub anion węglanowy.

• Etap 1 - karboksylacja biotyny (biotyna wiąże się w karboksylazach wiązaniem amidowym):

• Etap 2 - przerzucenie reszty na substrat

• Etap 3 - ???

Ze względu na różnice w przebiegu tych reakcji, katalizujące je enzymy można podzielić na cztery grupy:

• Enzymy karboksylujące kwas fosfoenolopirogronowy

• Enzymy wymagające obecności biotyny i ATP i karboksylujące α-ketonokwasy lub acetyloCoA

• Enzymy karboksylujące białka i wymagające obecności witaminy K

• Karboksylazy rybulozo-1,5-difosforanowe

Enzymy karboksylujące kwas pirogronowy:

Reakcja przyłączenia CO₂ do fosfoenolopirogronianu prowadzi do utworzenia kwasu szczawiooctowego. Reakcji tej towarzyszy rozerwanie wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego, a akceptorem grupy fosforanowej może być cząsteczka wody, nukleozydodifosforanu lub kwasu fosforanowego. Enzymem, który katalizuje przyłączenie jonu węglanowego, przenosząc jednocześnie grupę fosforanową substratu do cząsteczki wody, jest karboksylaza fosfoenolopirogronianowa. Jeden z możliwych mechanizmów reakcji katalizowanej przez ten enzym zakłada jednoczesny atak elektrofilowym jonu węglanowego na wiązanie podwójne substratu i atak nukleofilowy anionowego tlenu na atom fosforu z odejściem fosforanu. Możliwy jest również inny przebieg tej reakcji, w którym reszta fosforanowa stanowi aktywator węglanu, tworząc z nim mieszany bezwodnik i jednocześnie odrywając się z cząsteczki substratu. Oba produkty pośrednie bezwodnik i enolopirogronian reagują ze sobą i powstaje kwas fosfoenolopirogronowy.

14. Dehydrogenazy 2-oksokwasów (pirogronowego, alfa-ketoglutarowego) jako przykład kompleksów wieloenzymowych

Źródłem kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej jest acetylo-CoA:

Pirogronianu + CoA-SH + NAD → Acetyl-CoA + CO₂ + NADH + H⁺

Dekarboksylacja oksydacyjna zachodzi w macierzy, a glikoliza w cytoplazmie.

Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej składa się z 3 podjednostek:

1. dehydrogenaza pirogronianowa (E1) - koenzym TPP, witamina B1 (difosfotiamina)

2. acetylotransferaza dihydrolipoamidowa (E2) - koenzym - 2 cząsteczki kwasu limonowego

3. dehydrogenaza dihydrolipoamidowa (E3) - koenzym tej podjednostki jest FAD, współpracujące z NAD.

Reakcje kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej:

• pirogronian przy udziale dehydrogenazy pirogronianowej ulega dekarboksylacji do hydroksyetylowej pochodnej pierścienia tiazotowego difosfotiaminy

• pochodna ta reaguje z utlenionym... ???

Budowa i funkcjonowanie kompleksu

• podjednostka E2 składa się z dwóch cząsteczek kwasu liponowego

• w E1 znajdują się reszty z grup cysteiny HS - jest przerzucana z pirofsforanu tiaminy na kwas limonowy; mostek się otwiera, dołącza się wodór z reszty cysteiny.

Jak regulowany jest kompleks?

• Na drodze kowalencyjnej modyfikacji

Kinaza przekształca enzym w formę nieaktywną; jest aktywowana przez cytrynian i ATP (wzrost stężenia ATP świadczy, e jest dużo energii, więc zwalnia się metabolim). Sygnałem do defosforylacji (aktywacji) jest wzrost stężenia ADP. Jeżeli ADP/ATP > 1 tzn że są niedobory ATP więc trzeba przyspieszyć reakcję.

Niedobór dehydrogenay pirogronianowej:

• Wykrywany jest u dzieci

• Wykazują one wysoki poziom kwasu mlekowego, pirogronianu i alaniny

• Powoduje on rozległe defekty neurologiczne i w efekcie śmierć

We wszystkich kompleksach występują koenzymy, które muszą współdziałać z różnymi podjednostkami:

• Biocytyna

• Fosfopantoteina - w syntetazie kwasów tłuszczowych

• Część czynna kwasu liponowego znajdująca się na ramieniu - w dehydrogenazie pirogronianowej.

15. Rodzaje ogólnych mechanizmów, wykorzystywanych w katalizie enzymatycznej

Reakcja enzymatyczna zachodzi według jednej z czterech poniższych mechanizmów lub ich kombinacji:

1. kataliza przez zbliżenie reagujących grup i cząsteczek. Następuje takie zorientowanie reagujących grup aby były one maksymalnie zbliżone

2. kataliza przez utworzenie kowalencyjnych produktów pośrednich. Enzym tworzy kowalencyjne połączenie z substratem w pewnym etapie reakcji. Dzięki temu substrat łatwiej osiąga stan tranzycji, ułatwia to przejście w produkt.

3. kataliza kwasowo-zasadowa. W realizacji biorą udział jony wodorowe (kwasowe) lub grupy OH (zasadowe). Zwykle mechanizm jest mieszany, występuje zarówno kataliza zasadowa jak i kwasowa.

4. kataliza przez odpowiednią deformację cząsteczki substratu. Jest to wynikiem związania cząsteczki substratu w centrum aktywnym i takimi oddziaływaniami, które gwałtownie obniżają entropię, co powoduje deformację

5. kataliza z udziałem metali

Efekty katalityczne tych mechanizmów można szacować, korzystając z badań wpływu różnych czynników.

16. Ogólna charakterystyka enzymów proteolitycznych; peptydazy i proteinazy.

Stanowią 60% całej światowej produkcji enzymów. S wykorzystywane w przemyśle spożywczym, mleczarskim, do produkcji detergentów, w garbarstwie. Hydrolizują one wiązania peptydowe w polipeptydach bądź białkach. Są bardzo różnorodne, charakteryzują się wysoką specyficznością działania. W klasyfikacji tych enzymów przyjęto trzy kryteria:

• Typ katalizowanej reakcji

• Jak jest zbudowane centrum aktywne

• Ewolucyjny związek ze strukturą

Dzielimy je na:

• Egzopeptydazy - na zewnątrz działają

• Endopeptydazy - wewnątrz działają

Podział ze względu na koniec łańcucha, przy którym działa:

• Aminopeptydazy - odcinają końcowy aminokwas od końca N (aminokwas z grupą karboksylową)

• Karboksypeptydazy - odcinają aminokwas od końca C

Proteazy to enzymy z grupy hydrolaz oznaczone kodem EC 3.4, które dokonują hydrolizy wiązań peptydowych. Z proteazami związane są dwa inne terminy, wymagające dodatkowych wyjaśnień:

-peptydaza - jest pojęciem będącym właściwie synonimem Proteazy i oznacza enzym dokonujący rozbicia dowolnego wiązania peptydowego. Peptydazy mogą być podzielone na dwie grupy:

1. endopeptydazy - które rozcinają wiązania peptydowe wewnątrz łańcucha peptydowego

2. egzopeptydazy - które odcinają pojedyncze aminokwasy od końców łańcucha peptydowego

proteinaza - pojęcie to oznacza zwykle endopeptydazę

Powyższe terminy mogą być traktowane jako synonimy: proteaza = proteinaza = peptydaza.

Wśród proteaz ze względu na mechanizm katalizy wyróżniamy 4 klasy enzymów:

• Proteazy serynowe

• Proteazy cysternowe

• Proteazy aspartylowe

• Metaloproteazy

• Proteazy treoninowe

Hydrolazy peptydowe są zróżnicowaną grupą enzymów - enzymy trawienne, biorą udział w krzepnięciu krwi, w modyfikacjach potranslacyjnych, w procesach rozmnażania; dla morfogenezy - przemiany morfogenetyczne, procesy odnowy tkanek, udział w tworzeniu naczyń krwionośnych, rola w przekazywaniu informacji, w tworzeniu bariery immunologicznej.

17. Mechanizm działania proteinaz serynowych

Peptydazy serynowe mają serynę w centrum aktywnym oraz podobny mechanizm katalizy.

Gly-X_aa-Ser-Y_aa-Gly

X,Y - dowolne aminokwasy

Peptydazy serynowe są aktywne w pH 7-11, wykazują dość szeroką specyficzność substratową. Hydrolizują wiązania estrowe, peptydowe, amidowe inne niż wiązania peptydowe. Punkt izoelektryczny w granicach pH 4-6.

Wśród peptydaz serynowych wydzielono ponad 30 rodzin. Za kryterium podziału na rodziny przyjmuje się ułożenie sekwencji aminokwasowej w centrum aktywnym. Rodziny grupuje się w klany. Klany grupuje się na podstawie podobieństw strukturalnych. Na podstawie homologii w rodzinach wyodrębniono podrodziny.

Wśród peptydazy serynowej jest przynajmniej 7 klanów:

SA - chymotrypsyny

SB - subtylizyny

SC - karboksypeptydazy

STRUKTURA CHYMOTRYPSYNY: składa się z 250 aminokwasów, kształt cząsteczki elipsoidalny, enzym zawiera system przeciwbieżnych struktur β, jedynie przy C końcu występują dwie krótkie α-helizy, struktury β tworzą 2 cylindryczne domeny przedzielone kieszonką katalityczną.

Chymotrypsyna zaliczana jest do klanu SA i ma taką sekwencję aminokwasową:

57 102 195

His…Asp… Ser

Chymotrypsyna jest to enzym trawienny ssaków, prowadzi trawienie w jelicie cienkim, składa się z 3 łańcuchów polipeptydowych połączonych 2 mostkami disiarczkowymi.

BIOSYNTEZA: Chymotrypsyna wytwarzna jest w postaci nieczynnego podbiałka - chymotrypsynogenu dojrzewającego na drodze organicznej proteolizy według schematu:

W efekcie proteolizy N-koniec łańcucha B przemieszcza się do wnętrza cząsteczki i oddziaływuje z Asp 194. Met 192 przemieszcza się na powierzchnię białka, a reszty 187 i 193 rozsuwają się. Dzięki tym zmianom tworzy się miejsce wiążące substrat, specyficzne względem Phe, Trp, Tyr (reszty aromatyczne) oraz Met i Leu (duże reszty apolarne)

Centrum katalityczne chymotrypsyny:

Występują 4 wnęki: katalityczna, hydrofobowa, wiążąca resztę N-acylową, ...

Bardzo łatwo sprawdzić, czy dany enzym jest enzymem serynowym. Przeprowadza się znakowanie reaktywnej Ser specjalnymi odczynnikami:

1. znakowanie ser 195 diizopropylofluorofosforanem(DIFP);

2. znakowanie His 57 przez TPCK

Mechanizm:

• Substrat dochodzi do enzymu w pobliże wnęki wiążącej, która ma powinowactwo w stosunku do R1 reszty substratu (gł. phe, tyr, trp, met, leu) - wiązania w sąsiedztwie tych amk. ulegną rozszczepieniu.

• Reakcja hydrolizy zaczyna się od ataku atomu tlenu grupy -OH w Ser 195 na karbonylowy atom C hydrolizowanego wiązania peptydowego. Zmianie ulega konformacja w substracie wokół C karbonylowego, zaczyna się tworzyć dziura anionowa.

• Substrat zostaje kowalencyjnie związany z enzymem - powstaje kowalencyjny intermedia. Zmienia się układ wodorowy w triadzie katalitycznej. Po związaniu substratu tworzy się dziura anionowa. Aminowa część substratu wiąże się wodorowo z His 57 a część kwasowa pozostaje zestryfikowana z Ser 195. W ten sposób kończy się etap acylacji.

• W wyniku przemian wiązanie peptydowe ulega pęknięciu. Tlen, który był oksyanionem, wraca do poprzedniej formy. Powstaje pierwszy produkt oraz acyloenzym.

• Do reakcji wchodzi cząsteczka wody, która zajmuje pozycję w miejscu aktywnym. Powstaje drugi intermedia, ponownie powstaje dziura anionowa.

• Powstaje tetraedryczny związek pośredni, tlen wraca do postaci =O.

Uwolnienie kwasowej części substratu. Kwasowy składnik ulega dysocjacji i enzym jest gotowy do następnego cyklu katalizy.

18. Mechanizm działania proteinaz cysteinowych

Do rodziny proteinaz cysteinowych należy szereg proteinaz roślinnych - papaina, aktynidyna, bromelalna oraz proteaz ssaczych: katepsyny lizosomalne u ssaków, kapaliny w cytozolu, a także wiele proteaz parasit.

Mechanizm katalizy proteinaz cysteinowych:

• Jak u serynowych kataliza przebiega poprzez utworzenie kowalencyjnego intermediatu oraz uczestniczą w niej reszta Cys oraz His.

• Aktywna katalitycznie cysteina oraz histydyna w papainie odgrywają analogiczne role jak odpowiedniki Ser195 i His57 w chymotrypsynie.

• Nukleofilem jest jon tiolanowy, który jest stabilizowany przez tworzenie pary jonowej z sąsiadującą w CK histydyną (grupą imidazolową His)

• Atakującym bardzo silnym Nukleofilem jest zatem faktycznie para jonowa tiolan - imidazol (cząsteczka wody nie odgrywa znaczącej roli ale jest zużywana jako drugi substrat w hydrolizie).

19. Mechanizm działania proteinaz aspartylowych

Większość proteaz aspartylowych należy do rodziny pepsyny, do której zaliczane są enzymy trawienne tj. pepsyna, chymozyna, lizosomalne katepsyny D, renina. Druga rodzina tych enzymów zawiera proteazy wirusowe tj. proteaza wirusa AIDS (retropepsyna).

Są to dwudomenowe Białka (lub dimeryczne) z centrum aktywnym ulokowanym między tymi homologicznymi domenami. Każda domena zawiera jedną resztę kwasu asparaginowego, które tworzą katalityczną parę. Te dwie reszty Asp leżą symetrycznie w centrum katalitycznym enzymu i jedna jest zjonizowana (-COO-) a druga jest niezjonizowana (-cooh) w pH optymalnym dla działania proteaz aspartylowych wynoszącym 2-3.

Mechanizm hydrolizy wiązania amidowego przez proteazy aspartylowe:

• w przeciwieństwie do proteaz serynowych i cysteinowych w trakcie katalizy przez proteazy aspartylowe nie są tworzone wiązania kowalencyjne między enzymem a kompleksem przejściowym (mimo, że powstaje tetraedryczny kompleks przejściowy).

• Nukleofilowy atak na grupę karbonylową wiązania peptydowego jest uzyskiwany dzięki równoczesnemu przeniesieniu protonów: jednego z cząsteczki wody do zjonizowanej grupy COO- enzymu, a drugiego z grupy -COOH drugiego Asp enzymu na grupę karbonylową substratu zaangażowaną w tworzenie wiązania (-CO-NH-).

• Jest to zatem kataliza kwasowo - zasadowa, cechująca się powstawaniem produktu przejściowego nie związanego kowalencyjnie z enzymem.

20. Mechanizm działania metaloproteinaz

Metaloproteinazy są obecne w bakteriach, pleśniach i organizmach wyższych. Mają zróżnicowaną sekwencję aminokwasów, ale większość zawiera jon cynku w katalitycznym centrum enzymu. Niekiedy cynk zastepowany może być przez Ni, Co bez straty aktywności.

Mechanizm katalizy przez Metaloproteinazy:

• W trakcie katalizy tworzony jest tetraedryczny intermediat niekowalencyjnie związany z enzymem. Powstaje on w wyniku ataku cząsteczki wody związanej z jonem Zn²⁺ (tym samym aktywowanej do postaci nukleofilowej) na grupę karbonylową rozcinanego wiązania amidowego (estrowego).

• W kolejnym etapie intermediat rozpada się w efekcie przeniesienia protonu z kwasu glutaminowego na opuszczającą miejsce katalizy grupę aminową rozszczepionego substratu (koniec C-terminalny z nowo powstałą grupą aminową).

• Natychmiast po wejściu kolejnej cząsteczki wody uwalniany jest produkt drugi (z nowo powstałą grupą karboksylową, N-terminalny fragment substratu).

Atom cynku jest koordynacyjnie związany z aktywnym enzymem oraz cząsteczką wody - ZAWSZE!!!

21. Mechanizm działania hydroliz glikozydowych na przykładzie alfa-amylazy i beta-galaktozydazy

Mechanizm działania beta-galaktozydazy:

Beta-galaktozydaza rozkłada wiązanie glikozydowi. Najlepiej poznana jest u E. coli - jest tetrametrem, białko oligomeryczne. Centrum aktywne zawiera: reszty kwasu glutaminowego, oraz tyrozyny. Znajduje się w mleku matki a największa jego synteza jest u dzieci i niemowląt.

Transglikozylacja - zmiana wiązania beta-1,4 w laktozie na wiązanie beta-1,6 - przekształcenie laktozy w allolaktozę. Allolaktoza jest właściwym substratem, do reakcji wchodzi woda, odszczepia się glukoza, a galaktoza zostaje związana z enzymem wiązaniem kowalencyjnym - jest to galaktozylacja enzymu. Tlen z grupy hydroksylowej kwasu glutaminowego atakuje nukleofilowa wiązanie kowalencyjne i następuje degalaktozylacja laktozy.

Koncepcja mechanizmu:

• Odrzuca konieczność przekształcenia laktozy w allolaktozę

• Od razu następuje odszczepienie cząsteczki glukozy od laktozy.

• Galaktozylacja - woda nie bierze udziału a reszta glutaminy

• Degalaktozylacja enzymu - bierze udział cząsteczka wody lub reszta alkoholu (w Transglikozylacja - reszta glukozy jest przerzucana na alkohol)

• Jeśli występuje woda to następuje pęknięcie wiązania i odszczepia się galaktozydaza.

Beta-galaktozydazy katalizują nie tylko galaktozylacja ale też transglikozylację.

Mechanizm działania alfa-amylazy:

Nazwa właściwa tego enzymu to 4-glukanohydrolaza alfa-1,4-glukanu, która atakuje wiązanie między pierwszym a czwartym atomem węgla. Jest endoenzymem - rozkłada wewnętrzne wiązanie. Substratem jest alfa-1,4-glukan czyli skrobia. Produktami rozkładu skrobi są maltooligosacharydy. Alfa-amylazy rozkładają co 6 wiązanie w alfa-amylazie:

• Maltoheksoza przeważa jako główny produkt końcowy

• Maltotetraoza, maltoza, niewielkie ilości glukozy.

Domena katalityczna tworzy alfa/beta-monobeczułkę. Struktura: naprzemiennie beta-alfa-helisa połączone pętlami, odcinki beta-fałdowe w środku. Centrum wiążące składa się z 10 podmiejsc, numerowanych od 0 do 9. Aby zaszła hydroliza, do miejsca wiązania musi się przyłączyć glukopiranoza zawierająca 10 reszt. Atak występuje między 7 a 8 resztą. Pętla, która bierze udział w reakcji składa się z 2 reszt kwasu asparaginowego i 1 reszty kwasu glutaminowego, natomiast łańcuch przeniesień ładunku składa się z kilku reszt, a zakończony jest argininą.

1. Woda od razu wchodzi do reakcji w miejsce katalityczne

2. Tlen z cząsteczki wody działa jak nukleofil i atakuje węgiel C1 w rozkładanym wiązaniu glikozydowym.

3. Jednocześnie następuje protonacja z argininy (łańcucha kończącego) na kwas asparaginowy. Efekt - otwarcie pierścienia piranozowego.

4. Do tlenu w pierścieniu przyłącza się wodór, do C1 przyłącza się grupa -OH z cząsteczki wody.

5. Następuję rotacja wiązania przy C1 tak, że grupa -OH przyłączona do węgla C1 zmienia swoją konfigurację, przechodzi i tworzy mostek wodorowy z resztą kwasu asparaginowego. Efekt - pęknięcie wiązania glikozydowego, odszczepienie pierwszego produktu reakcji.

6. W ostatnim etapie następuje zamknięcie łańcucha i odszczepia się drugi proton.

Alfa-amylazy są enzymami procesującymi - rozkładają polimery; przyłącza się enzym do substratu w odpowiednim miejscu, następuje w tym miejscu pęknięcie wiązania i odszczepienie pierwszego produktu; enzym ten posuwa się dalej po substracie i znów następuje pęknięcie itd. Podobnie działają celulazy, oraz rybonukleazy.

22. Drobnoustroje ekstremofilne jako producenci biomolekuł o znaczeniu użytkowym.

Mikroorganizmy środowisk ekstremalnych:

• Pyrococcus furiosis - wysoka temperatura, optymalne warunki wzrostu 100°C

• Bacillus + A (41) - niska temperatura ~4°C, tlenowy heterotrof

• Methanococcus Janach - wysokie ciśnienie, 250 atm, 85°C.

• Clostridium paradocsum - pH 10, 50°C

• Metallosphaera - pH 2, 75°C.

Ekstremofile - mikroorganizmy zaadoptowane do życia w:

• Wysokich temperaturach (hipertermofile - Topt > 80°C, Tmax hodowli In vitro do 113°C.

• Niskich temperaturach (Psychrofile Topt ≤ 15°C, Tmax < 20°C.

• Niskich lub wysokich (acydofile 0-3, alkalofile 10-12)

• Wysokich ciśnieniach (> 1 atm - bazofile; piezofile - w głębinach oceanów)

• Radiacja - radiofile, wysoki poziom radiacji, radioaktywne ścieki, skażona gleba.

• Aktywność wody - kserofile - a_w < 0,8; powierzchnie skał, zasolone organiczne ciecze, np. oleje.

• Jony metali ciężkich - metalofile, wysokie stężenia metali ciężkich np. Cu, Hg, Pb; miejsca skażone związkami organicznymi, odporne na ksenobiotyki.

• Endolity - żyją w częściach dennych skał, pod powierzchnią ziemi (nawet pod powierzchnią 3km).

Podstawowe przystosowania drobnoustrojów do ekstremalnych środowisk:

• Specyficzne mechanizmy akumulacji energii

• Utrzymanie homeostazy środowiska wewnątrzkomórkowego i metabolizmu

• Stabilność komponentów funkcjonalnych (w tym enzymów) i strukturalnych (białek, kwasów nukleinowych, lipidów, membran);

• Dostosowanie kinetyki reakcji biochemicznych do warunków środowiska

• Odpowiednie tempo obrotu białek.

23. Enzymy adaptowane do niskich temperatur - właściwości i znaczenie gospodarcze

PSYCHROZYMY - Są to enzymy wytwarzane przez drobnoustroje psychrofilne. Natywne są termostabilne. W laboratorium sa bardziej stabilne w wyższej temp. niż naturalne.

Wpływ temp. na właściwości enzymów:

• Struktura I-rzędowa = wrażliwość minimalna

• Struktura II-rzędowa = wrażliwość niewielka

• Struktura III-rzędowa = wrażliwość wyraźna

• Struktura IV-rzędowa = wrażliwość bardzo duża

( mała stabilność wiązań hydrofobowych w niskich temp. )

• Interakcje z membranami = wrażliwość bardzo duża

• Stabilność substratu lub produktu = wrażliwość możliwa

• Wiązania ligandów = wrażliwość bardzo duża

• Funkcja katalityczna = wrażliwość bardzo duża

• Regulacja katalityczna = wrażliwość bardzo duża

Właściwości kinetyczne psychrozymów.

• obniżona o co najmniej 15-20ºC T opt. w porównaniu z mezofilami i

• stosunkowo wysoka aktywność poniżej 20ºC a często również w 0ºC i poniżej. ( krzywa aktywności w funkcji temp. przesunięta w stronę niższego zakresu )

• w zakresie 0-30ºC reaktywność enzymu ( K_cat) i jego fizjologiczna skuteczność (stała specyficzności Kcat/Km) wyższa niż u mezofilnych. Energia aktywacji reakcji - niższa

• najintensywniejsza synteza następuje w środowisku - tam w porównaniu z hodowlami In vitro powstaje najwięcej enzymu, mimo że proces rozpoczyna się później.

• ograniczona stabilność termiczna, co przejawia się szybko denaturacją w umiarkowanych temp. i co jest kinetyczna konsekwencją gęstości strukturalnej psychrozymów

• psychrozymy bardzo trudno wykrystalizować ze względu na bardzo duża giętkość cząsteczki

Struktury przestrzenne psychrozymów poznano jedynie u 8 enzymów. 5 z nich pochodzi z drobnoustrojów - bakterii antarktycznych; a 3 wyizolowane z ryb zyjących w zimnych akwenach.

Enzymy te to:

• £-amylaza - Alteromonas haloplanitis

• Synteza cytrynianowi - z bakterii antarktycznych

• Izomeraza trifosforanowa - Vibrio marines - dehydrogenaza mleczanowa

• Dehydrogenaza jabłczanowa - Aquaspirillum arctium

• Trypsyna - z łososia atlantyckiego

• Pepsyna - z dorsza atlantyckiego

• Elastora - z łososia atlantyckiego

• Metaloproteinoza Zn ²⁺- Ca²⁺ - Pseudomonas aeruginosa  

Enzymy adaptowane do zimna mają giętkie cząsteczki w porównaniu z mezofilami. Na utworzenie kompleksu E - S i jego aktywacje potrzebna jest energia, dlatego cząsteczki muszą być gięte, bo gdyby były sztywne to kompleks ES nie zostałby utworzony. Poznanie struktury przestrzennej psychrozymów jest trudne , ze względu na duża giętkość - trudniej podlegają badaniom krystalograficznym.

Właściwości strukturalne ( w odniesieniu do mezofili)

1. zmniejszona ilość interakcji hydrofobowych - rdzeń hydrofobowy enzymu adaptowanego do zimna zawiera większą objętość co prowadzi do obniżenia spójności cząsteczek.

2. niższa zawartość proliny - usztywnia ona łańcuch polipeptydowy.

3. niższy udział argininy w puli aminokwasów zasadowych (niższa wartość stosunku Arg/Arg + Lys)

4. obniżona ilość mostków solnych ( par jonów)

5. niższy współczynnik kohezji (obniżona spójność molekuły)

6. wyższa zawartość reszt glicyny ( w niektórych lipazach antarktycznych bakterii), które są korzystniejsze energetycznie ponieważ ułatwiają konformacyjne modyfikacje białka podczas katalizy w niskich temp. - reszta glicyny prowadzi do zwiększenia entropii (stanu sfałdowania) a więc zwiększa giętkość

7. większa liczba oddziaływań z rozpuszczalnikami na powierzchni molekuły spowodowane wzrostem liczby reszt polarnych w tym obszarze

8. wysoka giętkość stanu sfałdowania bez istotnych zmian w strukturze II-rzędowej , za to z licznymi zmianami pętlach łańcucha polipeptydowego często dłuższych niż w mezofilnych odpowiednikach

Najlepsze enz. Psychrofilne - z organizmów pochodzących ze środowisk o ustalonej niskiej temp.

Wykorzystanie.

1. Ochr. Środowiska (kultury drobnoustrojowe)

• Biodegradacja polutantów w zimnym i umiarkowanym klimacie

• Produkcja biogazu w zimnym i umiarkowanym klimacie

• Rekultywacja zanieczyszczeń gleby In situ (kioremediacja)

2. Przemysł spożywczy (enzymy)

• Serowarstwo (zimna podpuszczka, lipazy - zapachy aromaty)

• Piwowarstwo (zacieranie na zimno - proteazy, £-amylazy)

• Mleczarstwo (rozkład laktozy w schłodzonym mleku i serwatce- ß - galaktozydaza)

• Konserwacje żywności (różne enzymy)

• Przetwórstwo owoców (klarowanie soków - pektynazy )

• Tyndalizacja mięsa (Proteazy)

3. Chemia gospodarcza (enzymy)

• Produkcja śr. Piorących (proteazy, lipazy, amylazy)

4. Biotransformacja w niskich temp. (enzymy)

• Modyfikacje antybiotyków (tetracyklina)

• Otrzymywanie nienasyconych estrów i wosków (lipazy)

• Synteza nienasyconych triacylogliceroli (masła kakaowe - lipazy)

• Stereospecyficzna synteza estrów, peptydów i innych (lipazy)

• Synteza i modyfikacje lotnych związków

5. Biologia molekularna (zimna fosfataza Vibrio) - restryktazy

6. Inne

• Odzysk srebra i błon rentgenowskich (proteazy)

• Produkcja lotnych związków i/lub ich modyfikacje (różne enzymy)

24. Enzymy hipertermofili -termozymy

Enzymy adaptowane do wysokich temp. Wytwarzane sa przez hipertermofile, których optymalna temp. wzrostu jest powyżej 80ºC

Kinetyczne właściwości.

Wrodzona, tj. wynikająca ze struktury termostabilność podwyższana czasem przez czynniki środowiska (sole, glikozylację białka, poliaminy) np.

- ferrodyksyna - jest stabilna 24h w 95ºC

- amylopululanaza i Pyrococcus furiosus w obecności Ca²⁺zachowuje aktywność do 145ºC

• Przesunięcie krzywej aktywności w funkcji temp w stronę wyższych temp. Topt powyżej 65º a dla enzymów i hipertermofilów nawet w zakresie 90-115ºC. Średni zakres aktywności to 60-125ºC

• Wysoka Kcat/Km - powyżej 60ºC. £-amylazy drobnoustrojów hipertermofilnych są cenne dla przemysłu spożywczego gł. w procesie scukrzania skrobi do glukozy. Niewiele znanych jest enzymów mogących rozłożyć skrobię natywną. Większość działa na skrobię skleikowaną

Strukturalne właściwości

• Wzrost hydrofobowości prowadzący najczęściej z dodatkową lokalną siecią wiązań wodorowych w rdzeniu cząsteczki do spadku zawartości i objętości wewnętrznych jamistości w molekule, czyli do bardziej efektywnego upakowania łańcucha polipeptydowego, spada wartość stosunku powierzchnia/objętość; zwykle nieco większy hydrofobowy rdzeń cząsteczki. Mogą się pojawiać dodatkowe miejsca wiązania jonu metali.

• Obniżenie naprężeń konformacyjnych w białkach zawierających lewoskrętne odcinki helikalne poprzez zwiększenie zawartości Gly (ponieważ Gly nie zawiera beta-węgla, mniej jest oddziaływań beta-węgiel - tlen karbonylowy, powodujących naprężenia)

• Redukcja entropii rozfałdowania łańcucha przez wzrost zawartości proliny i spadek glicyny

• Wzrost liczby mostków solnych , trwałych nawet w bardzo polarnym środowisku. Stabilizują one II-rzędowe struktury po ß- skręty. Towarzyszy temu wzrost zawartości argininy w cząsteczce, która ze względu na obecność grupy δ - guanidynowej ma więcej możliwości oddziaływania z innymi resztami - są one bardziej stabilne

• Stabilizacja £ - helisy przez zwiększenie zawartości alaniny i kompensacje ładunków na N i C końcu przeciwnie naładowanymi resztami.

• Wzrost liczby wiązań wodorowych

• Stabilizacja pętli łączących odcinek o regularnej strukturze II-rzędowej poprzez ich skrócenie a nawet eliminacje.

• Odporność na kowalencyjną destrukcję, którą mogłaby spowodować podwyższona temp. np.

deaminacje Asn i Gln, utlenianie cys, hydrolize wiązań peptydowych Asp- Xad ( w warunkach kwaśnych)

25. Metody immobilizacji enzymów. Dlaczego stosujemy tę technikę otrzymywania preparatów enzymatycznych?

Immobilizowane białka

Przeprowadzenie enzymu ze stanu rozpuszczalnego do nierozpuszczalnego najczęściej prez związanie go z mechanicznym nośnikiem. Cechy dobrego nośnika:

• Trwałość mechaniczna i biologiczna

• Duża powierzchnia czynna, pojemność i porowatość

• Możliwość otrzymywania różnych form (np. włókna, kulki)

• Łatwość aktywacji

• Wysokie powinowactwo do biokatalizatora i środowiska reakcji

• Łączenie z wybranymi grupami funkcyjnymi białka

• Nie powinien ograniczać działania enzymu

• Niska cena i dostępność

• Łatwość w izolacji ze środowiska reakcji

• Możliwość regeneracji

Zalety immobilizacji:

• Wielokrotne i powtarzalne wykorzystanie enzymu

• Możliwość szybkiego zatrzymania reakcji przez usunięcie enzymu ze środowiska reakcji

• Stabilizacja enzymu poprzez związanie z matrycą

• Produkt nie jest zanieczyszczony enzymem

• Łatwość izolowania enzymu ze środowiska

• Możliwość prowadzenia reakcji wieloenzymatycznych

Parametry immobilizowanego biokatalizatora:

• Stabilność operacyjna - czas, w którym w trakcie prowadzenia procesu preparat traci 50% aktywności wyjściowej

• Stabilność w trakcie przechowywania - czas, w którym w trakcie przechowywania preparat traci 50% aktywności wyjściowej.

Klasyczne metody immobilizacji:

1. Adsorpcja - siły jonowe, wiązania wodorowe, stałe oddziaływania fizykochemicznego.
   -Przykładowe nośniki: drewno, celuloza, jonity, krzemionka, węgiel aktywny.
   -Uwagi: często stosuje się sieciowanie po procesie adsorpcji, nadaje się do reakcji prowadzonych w środowiskach organicznych.
   -Zalety: niski koszt, łatwość wykonania, niewielkie opory dyfuzyjne, wysoki stopień zachowanej aktywności po immobilizacji.
   -Wady: nietrwałe wiązanie.

2. Wiązanie kowalencyjne - wiązania estrowe, peptydowe, C-C, C-N.
   -Przykładowe nośniki: szkło porowate, chitozan, materiały ceramiczne, CM-celuloza.
   -Uwagi: najczęściej stosowana.
   -Zalety: silne związanie białka z nośnikiem, możliwe zmiany parametrów enzymu.
   -Wady: nietrwałe wiązanie.

3. Pułapkowanie - membrany, kuleczki żelu.
   - Przykładowe nośniki: alginian sodu, karacen, żelatyna, kolagen, agar, żywice.
   - Zalety: duża pojemność nośnika, możliwość unieruchomiania komórek, możliwość namnażania komórek, możliwość prowadzenia reakcji wieloenzymatycznych.
   - Wady: wymywanie biokatalizatora, opory dyfuzyjne.

4. Kapsułkowanie

5. Sieciowanie przestrzenne

6. Samo - agregacja - nadaje się do unieruchomiania komórek, pleśnie wykazują naturalną zdolność do agregacji tzw. Pellets.
   - Zalety: łatwa procedura, możliwość prowadzenia reakcji wieloenzymatycznych.
   - Wady: zanieczyszczenie środowiska reakcji, opory dyfuzyjne.

Nowoczesne metody immobilizacji:

1. CLEAs - sieciowane agregaty białek enzymatycznych. Zalety: łatwość wykonania immobilizacji, możliwość prowadzenia reakcji wieloenzymatycznych. Wady: duża wrażliwość agregatów na bodźce mechaniczne.

2. CLECs - sieciowane kryształy białek enzymatycznych

3. biokatalityczne plastiki.

26. Kataliza w środowiskach niewodnych

Wykrycie możliwości stosowania takich niekonwencjonalnych środowisk niewodnych (np. rozpuszczalniki organiczne, ciekły CO₂) do prowadzenia reakcji chemicznych katalizowanych enzymatycznie znacznie rozszerzyło zakres zastosowania enzymów (lub komórek mikroorganizmów będących ich źródłem) w procesach biotechnologicznych (biokonwersji, biotransformacji).

Powstał nowy kierunek nauki: enzymologia niekonwencjonalna nazywana również enzymologią środowisk niewodnych.

Enzymologia niewodna - dziedzina biotechnologii zajmująca się przemianami katalizowanymi przez enzymy oraz komórki drobnoustrojów i roślin w środowisku niewodnym.

W środowiskach reakcji innych niż woda, jako katalizatory wykorzystuje się zarówno preparaty enzymatyczne, jak i całe komórki mikroorganizmów (biokatalizatory).

Enzymy nie wykazują aktywności katalitycznej w środowisku całkowicie pozbawionym wody. Obecność cząsteczek wody jest bardzo ważna dla stabilizacji 3D struktury oraz aktywności białek.

W środowisku rozpuszczalników organicznych, siła związania, rejony występowania i grubość warstwy „wody niezbędnej” jest cechą indywidualną, charakterystyczną dla danego białka enzymatycznego, uzależnioną od jego struktury przestrzennej oraz usytuowania i rodzaju grup funkcyjnych znajdujących się w strefie powierzchniowej.

Inżynieria rozpuszczalnikowa inaczej Inżynieria środowiska reakcji:

• Dostarcza alternatywnych rozwiązań dla inżynierii białkowej

• Poszukuje nowych zastosowań dla handlowych preparatów enzymatycznych, w tym w środowiskach niekonwencjonalnych.

Zaleta - niski koszt i prostota wykonania.

Wada - niewielki, jak dotychczas, poziom wiedzy teoretycznej.

Zalety katalizy enzymatycznej w środowisku niewodnym:

• Możliwość prowadzenia biotransformacji związków, które są nierozpuszczalne w wodzie

• Możliwość uzyskania produktów o określonej konfiguracji

• Optymalne wykorzystanie surowców

• Prowadzenie procesu w warunkach energooszczędnych

• Ograniczenie produktów ubocznych

• Zabezpieczenie przed zakażeniami mikrobiologicznymi

• Nieduże nakłady inwestycyjne

• Prowadzenie procesów ciągłych lub zawracanie enzymu

Wady katalizy enzymatycznej w środowisku niewodnym:

• Aktywność enzymów w środowiskach niewodnych (szczególnie w polarnych rozpuszczalnikach organicznych) jest często wielokrotnie niższa niż w wodzie;

• Utrudniona jest regeneracja i zawracanie kofaktorów enzymów oraz ograniczona jest możliwość stosowania żywych komórek drobnoustrojów, dla których środowisko rozpuszczalników organicznych jest często silnie toksyczne;

• Prowadzenie procesów w płynach nadkrytycznych oraz pod wysokim ciśnieniem w znacznym stopniu ogranicza wykorzystanie do katalizy całych, żywych komórek drobnoustrojów i konieczne jest stosowanie barofili

Środowisko katalizy enzymatycznej :

• Rozpuszczalniki organiczne

• Ciekłe substraty

• Gazowe substraty

• Płyny nadkrytyczne (CO2)

• Wysokie ciśnienie

• Układ dwufazowy (woda-rozpuszczalnik)

• Odwrócone micele

Rozpuszczalniki organiczne mogą w różnorodny sposób oddziaływać z molekułą białka:

• Specyficznie wiązać się z enzymem nie dopuszczając do utworzenia kompleksu enzym-substrat

• Zmieniać stan równowagi katalizowanej reakcji

• Wchodzić w reakcję z enzymem

• Stabilizować lub destabilizować enzym

• W inny sposób wpływać na szybkość katalizowanej reakcji

W rozpuszczalnikach apolarnych pojęcie pH środowiska reakcji nie ma sensu fizycznego. Nie oznacza to, że ładunek elektryczny polarnych grup czynnych białka enzymatycznego nie wpływa na szybkość przemian katalizowanych przez enzymy w środowisku niewodnym.

27. Możliwości wykorzystania enzymów w gospodarce

Enzymy znalazły zastosowanie w technologiach przemysłowych (np. przy hydrolizie skrobi i białek) i spożywczych, a także analizie chemicznej. Szeroko stosowane są m.in. w gentyce, np. w metodzie PCR, gdzie konieczne stało się wykorzystanie enzymów pochodzących od archebakterii, ze względu na ich stabilność w wysokich temperaturach.

Amylazy znajdują zastosowanie:

• W gorzelnictwie rolniczym - przy zacieraniu i cukrowaniu surowców skrobiowych, głównie ziemniaków, żyta, kukurydzy;

• W browarnictwie - przy scukrzaniu skrobi zawartej w samym słodzie, w wyniku czego otrzymuje się brzeczkę;

• W piekarstwie - w celu wytworzenia pewnych ilości cukrów ze skrobi w cieście, co ułatwia fermentację ciasta (podnosząc pulchność pieczywa) oraz przedłuża trwałość;

• W przetwórstwie krochmalniczym, przy modyfikowaniu cech fizycznych mączki ziemniaczanej oraz niekiedy przy produkcji syropów;

• W produkcji różnego typu odżywek, szczególnie dla dzieci;

Zastosowanie enzymów celulolitycznych:

• Rozkład hemicelulozy we wstępnej obróbce ziarna kawowego;

• Rozkład celulazy przy produkcji sosów (łącznie z preparatami amylolitycznymi), do intensyfikacji ekstrakcji z białek z roślin (m.in. z zielonej herbaty) oraz jako preparaty ułatwiające przyswajanie pasz (celulazy z preparatami pektolitycznymi)

• Szerokie zastosowanie w przemyśle owocowo-warzywnym

• W przemyśle winiarskim, farmaceutycznym, podnosząc zawartość cukrów fermentujących

• W piwowarstwie do rozkładu beta-glukanu w jęczmieniu ( ułatwiona filtracja piwa i zapobieganie zmętnieniom)

Zastosowanie enzymów proteolitycznych:

• W przemyśle mleczarskim, np. dojrzewanie serów

• W przemyśle rybnym

• W przemyśle mięsnym, np. dojrzewanie mięsa

• W przemyśle piwowarskim

Zastosowanie enzymów lipolitycznych:

• Odtwarzanie zapachu mlecznego w niektórych produktach spożywczych

• Poprawa cech organoleptycznych (smaku i zapachu) serów (istotne podczas dojrzewania)

• Produkcja koncentratów zapachowych z tłuszczu mlekowego, mających zastosowanie podczas produkcji sosów i przypraw do zup

• Skracanie czasu dojrzewania serów

• Do odtłuszczania skór i kości

• Polepszanie smaku w wyrobach cukierniczych (cukierki, czekolada), w których zmiany lipolityczne tłuszczu mlekowego okazały się korzystne dla aromatu i smaku gotowego produktu

• Produkcja pełnego mleka w proszku, przeznaczonego do produkcji pełnych czekolad

• Syntezy substancji powierzchniowo-czynnych

• Syntezy substancji smakowo-zapachowych




---