Politechnika Wrocławska	INŻYNIERIA BIOREAKTORÓW Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji izomeryzacji izomeryzacji D-glukozy do D-fruktozy
		Piotr Cegła, 168657 Aleksandra Drozd, 168659	Prowadząca: Prof. Jolanta Bryjak Data ćwiczenia: 22.02.2011r.

1. Wstęp teoretyczny

Zasada działania reaktora przepływowego ze złożem stałym opiera się na przepływie roztworu badanej substancji przez rurę/kolumnę upakowaną katalizatorem. Reaktory tego typu mogą być zbudowane z jednego cylindra wypełnionego odpowiednim złożem lub z ułożonych równolegle kilku rur z katalizatorem [ Gavhane, 2009, Chemical reaction engineering I]. Reaktor ze złożem upakowanym jest bardzo często stosowany w laboratoriach i przemyśle chemicznym i biotechnologicznym, ponieważ użytkowanie jego nie jest zbyt drogie oraz nie bardzo skomplikowane. Reaktory te charakteryzują się łatwością we wprowadzaniu substratów i wyprowadzaniu produktów oraz czyszczenie nie zajmuje zbyt dużo czasu [ Rzążewska, 2005, tłumaczenie patentu europejskiego dla Reaktor oraz sposób fermentacji na podłożu stałym].

Badanym w czasie doświadczenia enzymem była izomeraza glukozowa, która odpowiedzialna jest za przeprowadzenie reakcji izomeryzacji glukozy do fruktozy oraz ksylozy do ksylulozy. Izomerazy glukozowe są aktywowane przez różne jony metali, m.in. przez jony kobaltu Co²⁺ lub jony magnezu Mg²⁺ [Polska Akademia Nauk. Komitet Mikrobiologiczny, 1978, Postępy mikrobiologii]. Reakcja izomeryzacji glukozy do fruktozy jest przykładem reakcji, w której stosowany enzym reaguje tak z glukozą, jak i z fruktozą. Spełnia ona założenia kinetyki Michaelisa-Menten, dzięki czemu możliwe jest wyznaczenie szybkości maksymalnej reakcji oraz stałej Michaelisa [Bryjak, 2011, instrukcja do zajęć laboratoryjnych z inżynierii bioreaktorów Reaktory przepływowe - kolumna ze złożem upakowanym].

2. Materiały i metody

Materiały:

• immobilizowana izomeraza glukozowa otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme,

• objętość całkowita złoża - 20 cm³,

• objętość wolna reaktora - 6,8 cm³,

• temperatura procesu - 40^oC,

• roztwory glukozy i fruktozy,

• 0,05M bufor tris-HCl + 3 mmol Mg, pH 7,8 w 40^oC,

• Odczynniki do enzymatycznego oznaczania stężenia glukozy.

Aparatura:

• spektrofotometr UV-VIS Shimadzu,

• termostatowane reaktory kolumnowe,

• pompy tłokowe Prominent.

Metody:

Oznaczenie stężenia glukozy testem enzymatycznym

Do suchych i czystych probówek wprowadzono po 1 cm³ roztworu roboczego. Przygotowano również 2 probówki na standard glukozy i kontrolę. Z probówek zawierających odpowiednio rozcieńczone próbki badane oraz z próbki zawierającej standard pobrano po 10 μl roztworu i wprowadzono do roztworów roboczych. Każdorazowo kilkakrotnie przepłukano końcówkę roztworem roboczym. Całość wstawiono na 5 min do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie zmierzono absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej. W przypadku fruktozy, jako substratu, pobranych próbek nie rozcieńczono. Stosując jako substrat glukozę, wykonano następujące rozcieńczenia:

Stężenie glukozy [mM]	Rozcieńczenie [-]	Objętość roztworu badanego [μl]	Objętość wody [ml]
50	2x	1000	1,0
100	3x	1000	2,0
200	10x	1000	9,0
400	20x	500	9,5
600	20x	500	9,5
800	40x	250	9,75
1000	40x	250	9,75
1250	50x	200	9,8
1500	50x	200	9,8
1750	100x	100	9,9

Wyznaczenie wartości K_eq reakcji izomeryzacji

Do 5 cm³ 0,05 M roztworu glukozy dodano 50 μl natywnej izomerazy glukozowej i umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C celem osiągnięcia stanu równowagi termodynamicznej. Pobrano próbki z wyjściowego roztworu substratu oraz z mieszaniny reakcyjnej, rozcieńczono próbki wodą destylowaną (podane w tabeli) oraz oznaczono stężenie glukozy metodą enzymatyczną.

Pomiar zmiany stężeń reagentów w warunkach początkowej szybkości reakcji

Przygotowano po 500 cm³ dwóch roztworów glukozy lub fruktozy o podanych przez osobę prowadzącą stężeniach. Do termostatowanych (40°C) reaktorów kolumnowych ze złożem upakowanym dozowano substrat z podanymi szybkościami przepływu (pompa „mała” - 60/120; 40/120; 20/120; 10/120 / pompa „duża” - 15/120; 7,5/120; 2,5/120; 0/120). Dla każdego przepływu zmierzono strumień (zmierzono czas napełnienia cylindra na 50 cm³), a następnie pobrano próbkę do analiz z wylotu z reaktora, zwracając uwagę na osiągnięcie stanu ustalonego. Pobrano również próbkę substratu na wejściu reaktora. Wszystkie próbki odpowiednio rozcieńczono i oznaczono stężenie glukozy testem enzymatycznym.

3. Obliczenia i wyniki:

1) Stężenia (C):

Z proporcji:

Abs_śr.stand - 15 mM

Abs_{śr -} x

Abs_śr.stand - absorbancja średnia standardu glukozy

Abs_śr - absorbancja średnia roztworu

R - rozcienczenie roztworu

2) Stężenia produktów (C_p):

- reakcja izomeryzacji glukozy do fruktozy:

C_p=C_0,rz,s - C_g = 43,48 - 42,34 = 1,14 mM

C_p - stężenie produktu (fruktozy),

C_0,rz,s - rzeczywiste początkowe stężenie substratu (glukozy),

C_g - stężenie glukozy na wylocie z bioreaktora

- reakcja izomeryzacji fruktozy do glukozy:
C_p - stężenie produktu (glukozy) na wylocie z reaktora

C_0,rz,s = C założone

3) Objętościowe natężenie przepływu (V):

50 - objętość roztworu zbierana do cylindra

t - czas pobierania 50 ml roztworu

4) Czas przebywania (τ) :

6,8 - objętość wolna reaktora

V - objętościowe natężenie przepływu

5) Stopień przereagowania (α):

C_p - stężenie produktu

C_0,rz,s - rzeczywiste początkowe stężenie substratu

6) Szybkość reakcji (r):

C_p - stężenie produktu

τ - czas przebywania

Tabela 1. Wyliczone wartości dla reakcji izomeryzacji glukozy do fruktozy

Na żółto zaznaczono wartości użyte do wykonania wykresów.

C=50 mM	R=2
Absśr.subs	Absśr.stand		t [s]		Absśr.g	Co,rz,s [mM]		Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,445	0,997		59,59		1,441	43,476		43,336	0,140	0,839	8,104	0,323	0,017
						75,71		1,408	43,476		42,343	1,133	0,660	10,297	2,606	0,110
						108,62		1,418	43,476		42,644	0,832	0,460	14,772	1,914	0,056
						222,50		1,333	43,476		42,740	0,736	0,225	30,260	1,694	0,024
C=100 mM		R=3
Absśr.subs		Absśr.stand	t [s]		Absśr.g	Co,rz,s [mM]		Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,885		0,936	34,18		1,823	90,673		89,688	0,985	1,463	4,648	1,086	0,212
						52,40		1,913	90,673		91,988	-1,315	0,954	7,126	-1,450	-0,184
						78,58		1,876	90,673		90,224	0,449	0,636	10,687	0,495	0,042
						186,30		1,853	90,673		89,118	1,555	0,268	25,337	1,715	0,061
C=200 mM		R=10
Absśr.subs		Absśr.stand	t [s]		Absśr.g	Co,rz,s [mM]		Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,220		0,955	87,00		BRAK	191,556
						107,00		1,122	191,556		176,169	15,387	0,467	14,552	8,033	1,057
						168,00		1,170	191,556		183,706	7,851	0,298	22,848	4,098	0,344
						258,00		1,108	191,556		174,023	17,533	0,194	35,088	9,153	0,500
C=400 mM		R=20
Absśr.subs		Absśr.stand	t [s]		Absśr.g	Co,rz,s [mM]		Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,246		0,972	68,00		1,133	384,568		349,794	34,774	0,735	9,248	9,042	3,760
						86,00		1,224	384,568		377,778	6,790	0,581	11,696	1,766	0,581
						117,00		1,319	384,568		406,996	-22,428	0,427	15,912	-5,832	-1,410
						273,00		1,284	384,568		396,296	-11,728	0,183	37,128	-3,050	-0,316
C=400 mM		R=20
Absśr.subs		Absśr.stand	t [s]		Absśr.g	Co,rz,s [mM]		Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,223		0,888	81,00			413,133
						112,00		1,196	413,133		403,790	9,343	0,446	15,232	2,262	0,613
						168,00		1,220	413,133		411,895	1,238	0,298	22,848	0,300	0,054
						243,00		1,200	413,133		405,253	7,880	0,206	33,048	1,907	0,238
C=1000 mM		R=40
Absśr.subs		Absśr.stand	t [s]		Absśr.g	Co,rz,s [mM]		Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,521		0,915	87,00		1,516	997,741		994,133	3,608	0,575	11,832	0,362	0,305
						124,00		1,514	997,741		993,149	4,592	0,403	16,864	0,460	0,272
						163,00		1,719	997,741		1127,624	-129,883	0,307	22,168	-13,018	-5,859
						253,00		1,488	997,741		976,093	21,647	0,198	34,408	2,170	0,629
C=1500 mM		R=50
Absśr.subs		Absśr.stand		t [s]	Absśr.g		Co,rz,s [mM]	Cg [mM]	Cp [mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α		r [mM/s]
1,820		0,891		38,57	1,817		1492,347	1489,477	2,870	1,296	5,246	0,192		0,547
								57,81	1,574		1492,347	1290,361	201,986	0,865	7,862	13,535		25,691
								97,39	1,840		1492,347	1508,473	-16,126	0,513	13,245	-1,081		-1,218
								218,35	1,790		1492,347	1467,748	24,599	0,229	29,696	1,648		0,828
																średnia		0,688

Tabela 2. Wyliczone wartości dla reakcji izomeryzacji fruktozy do gluzkozy

Na żółto zaznaczono wartości użyte do wykonania wykresów.

c = 50mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,968	50,52	0,017	0,258	0,990	6,871	0,517	0,038
		63,53	0,042	0,646	0,787	8,640	1,291	0,075
		97,23	0,073	1,131	0,514	13,223	2,262	0,086
		251,46	0,207	3,202	0,199	34,199	6,405	0,094
C=100mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,039	30,91	0,099	1,422	1,618	4,204	1,422	0,338
		49,21	0,152	2,194	1,016	6,693	2,194	0,328
		76,49	0,283	4,086	0,654	10,403	4,086	0,393
		217,69	0,729	10,529	0,230	29,606	10,529	0,356
C=200mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
1,017	34,52	0,136	2,006	1,448	4,695	1,003	0,427
		48,48	0,196	2,891	1,031	6,593	1,445	0,438
		73,22	0,372	5,487	0,683	9,958	2,743	0,551
		182,62	1,247	18,397	0,274	24,836	9,199	0,741
C=400mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,850	77,00	0,062	1,100	0,649	10,472	0,275	0,105
		110,00	0,467	8,238	0,455	14,960	2,059	0,551
		157,00	0,675	11,907	0,318	21,352	2,977	0,558
		233,00	1,071	18,898	0,215	31,688	4,725	0,596
C=600mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,851	84,00	0,498	8,784	0,595	11,424	1,464	0,769
		105,00	0,679	11,974	0,476	14,280	1,996	0,839
		155,00	1,004	17,703	0,323	21,080	2,950	0,840
		244,00	1,386	24,430	0,205	33,184	4,072	0,736
C=800mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,851	77,00	0,626	11,040	0,649	10,472	1,380	1,054
		107,00	0,700	12,344	0,467	14,552	1,543	0,848
		146,00	0,816	14,383	0,342	19,856	1,798	0,724
		241,00	1,502	26,469	0,207	32,776	3,309	0,808
C=1250mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,892	45,68	0,529	8,898	1,095	6,212	0,712	1,432
		59,68	0,408	6,853	0,838	8,116	0,548	0,844
		80,64	0,604	10,159	0,620	10,967	0,813	0,926
		186,72	1,017	17,096	0,268	25,394	1,368	0,673
C=1500mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,888	46,31	0,514	8,686	1,080	6,298	0,579	1,379
		59,11	0,492	8,320	0,846	8,039	0,555	1,035
		82,26	0,643	10,860	0,608	11,187	0,724	0,971
		190,52	1,517	25,635	0,262	25,911	1,709	0,989
C=1750mM
Absśr.stand	t [s]	Abs.śr.prod	Cp[mM]	V* [ml/s]	τ [s]	α	r [mM/s]
0,959	54,22	0,459	7,187	0,922	7,374	0,411	0,975
		70,23	0,426	6,666	0,712	9,551	0,381	0,698
		108,14	0,570	8,913	0,462	14,707	0,509	0,606
		253,09	1,467	22,949	0,198	34,420	1,311	0,667

Wykres 1. Wykres Lineweavera-Burka dla izomeryzacji glukozy do fruktozy.

Wykres 2. Wykres Lineweavera-Burka dla izomeryzacji fruktozy do glukozy.

Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji:

Dla równań linii trendu w postaci y = ax + b

Tabela 3. Obliczone parametry kinetyczne

	Vmax	Km
glukoza	0,91	312,34
fruktoza	1,17	349,32

I. Stała równowagi:

II. Obliczanie stałej równowagi ze stężeń równowagowych

Tabela 3.

Abs	Cg, o (G)	Cg* (G+E)	Keq
1	1,767	1,001	0,765
3	1,922	1,004	0,914
1	1,872	0,993	0,885
2	1,918	1,014	0,892
2	1,793	1,011	0,773
3	1,793	1,015	0,767
1	0,693	0,376	0,843
2	0,671	0,364	0,843
3	0,669	0,345	0,939
1	1,407	0,785	0,792
2	1,472	0,816	0,804
1	1,464	0,778	0,882
2	1,483	0,792	0,872
3	1,474	0,785	0,877
Średnie Keq:			0,846

Wyniki
Stała równowagi z równania kinetycznego:
K_eq = 0,869

Stała równowagi wyznaczona eksperymentalnie:
K_eq = 0,846

---