Wykład II - 18.10.2011

Chemiczne mutageny - aktywacja metaboliczna promutagenów

Ksenobiotyki substancje obce dla organizmów żywych;

Metabolizm ksenobiotyków - procesy określające los substancji w organizmie;

Czynniki wpływające na rozlokowanie ksenobiotyków w organizmie.

Metabolizm ksenobiotyków

• Proces zmieniający charakter substancji z hydrofobowej na hydrofilową w celu ułatwienia eliminacji z organizmu

• Proces, w którym substancje obce (ksenobiotyki) ulegają w organizmach przemianom chemicznym metabolity o różnej aktywności

• Detoksykacje - w wyniku biotransformacji produkt o słabszym działaniu toksycznym; biologicznie nieczynne)

• Bioaktywacje - biotransformacja substancji biologicznie nieczynnej, wykazującej słabe działanie toksyczne powstanie silnie toksycznego metabolitu (aktywacja metaboliczna)

• Bezpośrednio mogą reagować z DNA (bezpośrednie mutageny)

• Wymagające aktywacji metabolicznej

• Główne drogi eliminacji:

• Odchody (żółć, mocz)

• Wydychane powietrze

Protokół biotransformacji

• Faza I (modyfikacja, przyłączanie grup funkcyjnych)

• Faza II (sprzęganie)

Chemiczne mutageny:

• Bezpośrednio mogą reagować z DNA (bezpośrednie mutageny)

• Wymagające aktywacji metabolicznej (protomutageny)

Klasa mutagenów	Przykład
Naturalne	Aflatoksyna B1
Policykliczne aromatyczne węglowodory	Benzapiren Benzoantracen
Aromatyczne aminy	Fenylenodiamina 2-naftyloamina
Nitrozoaminy	DNM (dimetylonitrozoamina) NNK
Nitrozomoczniki	ENU (etylonitromocznik) - bezpośredni mutagen MNU

• Faza I - Modyfikacja polarne metabolity

• Oksydacja

• Hydroliza

• Redukcja

• Faza II - sprzęganie hydrofilowe metabolity

• Glutation

• Kwas glukaronowy

• Aminokwasy

• Grupy metylowe

• Grupy acetylowe

• Grupy sulfonowe

Faza I

• Oksydacja (najważniejsza)

• Cytochrom P450, oksygenaza flawonowa, dehydrogenazy (alkoholowa, aldehydowa), oksydazy i inne

• Redukcja

• Reduktazy (reduktaza NADPH - cytochrom P450)

• Hydroliza

• Peptydazy, esterazy, hydrolazy (enzymy w siateczce śródplazmatycznej i cytozolu)

N - oksydacja
S - oksydacja
redukcja karbonylu
hydrolaza estru …

• Cytochrom P450 (wewnątrztkankowa lokalizacja)

• Membranowe związanie

• Gładkie retikulum endoplazmatyczne

• Obecność Cytochromu P450 w organizmach:

• Większość organów; wątroba - najwięcej

• Nerki, skóra, płuca, jelita - znacznie mniej niż w wątrobie.

Faza I P450 - monooksygenoza

• Hemoproteina; gr. Prostetyczna; żelazoporfiryna IX

RH + O₂ + NADPH + H₂ ROH + H₂O + NADP⁺

1 atom wiązany tlenu wiązany do substratu (R), 1 atom tlenu redukowany do wody (monooksygenaza) + NADPH jako kofaktor

+fosfolipidy - system monooksygenazy cytochromu P450

• Alternatywny 2 elektronowy : NADPH/NADH reduktaza NADPH/NADH - cyt b₅

Cykl kofaktorowy P450
1. Dodanie substratu do enzymu
2. Dodanie elektronu
3. Dodanie tlenu, przebudowa
4. Donacja kolejnego elektronu z wydzieleniem wody

Liczba znanych P450 6000 (2000 ssaki, ludzie ok. 60, bakterie >20)
nazwa: CYP, np. CYP3A4, CYP3A7 (27 rodzin, 18 u ssaków)

• CYP1A1

• Nadrodzina

• Rodzina ( > 40 % homologi )

• Podrodzina (55% homologi )

• Indywidualny enzym

Szeroka specyficzność substratowa

• Metabolizm ksenobiotyków

• Udział w biosyntezie przemian endogennych substancji np. steroidów, prostaglandyn, tromboksanów, pochodnych kwasów tłuszczowych

Najważniejsze ludzkie cytochromy P450

CYP	Lokalizacja	Substraty
1A1	Płuco, serce, przewód pokarmowy	PAH, benzopiren
1A2	Wątroba	Aminy aromatyczne
1B1	Skóra, mózg, serce, łożysko	PAH
2A6	Wątroba	Kumaryna, steroidy, nikotyna
2B6	Wątroba, serce
2C9/10	Wątroba
2D6	Wątroba, mózg, serce
2E1	Wątroba, płuca, mózg, serce, szpik
3A4	Wątroba, nerki, przewód pokarmowy, płuca, mózg
4A9/11	Nerki

Cytochrom 3A4 - odpowiedzialny za 52% metabolizmu wszystkich leków
Cytochrom 3D6 - odpowiedzialny za 30% metabolizmu wszystkich leków

Faza I

Metaboliczna aktywacja dimetylonitrozaminu (DMN)

Faza II - Sprzęganie

2 etapy:
I - aktywacja endogennego związku (przez ATP, UTP - kofaktory)
II - przeniesienie na akceptor (R)

• Enzymatyczna kataliza

• Enzymy (transferazy) - kofaktor

• Enzymy: transferaza glutationowa, acetylotransferaza, metylotransferazy, sulfotransferaza, UDP - glukuronaza i inne.

• Kofaktory: UDPGA (UDPGA (glukurotransferazy, kwas 5­-urydynodifosfoglukuronowy), PAPS (5'-fosfosiarczan 3' fosfoadenozyny, sulfotransferaza), acetylo-CoA (acetylotransferaza; aktywny octan), GSH (glutation, 3'-transferaza glutationowa)

• Reguła sprzęgania

R + GSH R-SG (transferazy glutationowe - acetylowe pochodne cysteiny)

R+UDPGA ROC₆H₉O₆ (glukuronid)

Alkohole, fenole, estry,
Związki z grupą sulfohydronylową (tiofenole) - S-glukorenidy
Aminy alifatyczne i aromatyczne, sulfonamidy - N-glukuronidy

PAPS (5-fosfosiarczan - 3'fosfoadenozyny);
Reagują z nim: alkohole, fenole, alifatyczne aminy
Reakcja z użyciem sulfotransferazy:
R + PAPS RSO3 + 5'fosforan-3'adenozyny

AcetyloCoA
Reagują z nim aminy aromatyczne, niektóre alifatyczne, sulfonamidy
Reakcja z użyciem acetylotransferazy
R+AcetyloCoA Acetylo-R + CoA

GSH (glutation - γ-glutamylo-cysteino-glicyna)
Reagują z nim węglowodory aromatyczne I nitroalkany
Reakcja z użyciem S-transferaz glutationowych
R+GSH R-SO kwasy merkapturowe (acetylowe pochodne cysteiny)

Faza III Biotransferacji

• Dalszy metabolizm związków powstałych w fazie II, np. konjugatów glutationu

• Produkty II fazy ulegają aktywacji metabolicznej np. do wolnych rodników

Metabolizm benzenu - forma epoksydowa (P450)

• Czynniki zewnętrzne:

• Dieta

• Używki

• Leki

• Ekspozycja na zanieczyszczenia środowiska

• Ekspozycja na koserwaty żywności, pestycydy

• Czynniki wewnętrzne

• Różnice narządowe

• Wiek

• Płeć

• Uwarunkowanie gatunkowe

• Uwarunkowanie genetyczne: polimorfizm genetyczny

Reakcje III fazy - uwarunkowanie gatunkowe - brak sprzęgania; (trudność w określeniu toksyczności w przypadku nowych związków):

• Kot z kwasem glukuronowym

• Świnia z kwasem siarkowym

• Świnka morska z glutationem (brak kwasów merkapturowych)

• Pies - brak acetylacji

Polimorfizm genetyczny - faza I
Metabolizm popafenonu (lek przeciwarytmiczny) - CYP2D6

• Wolna hydroksylacja (3 rodzaje fenotypów)

• Szybka hydroksylacja ( WT allele; mutacje nie mają wpływu na aktywność) zróżnicowanie dawek

Populacja kaukaska - 7% defektywnych genów
Populacja azjatycka - 50% defektywnych genów

Polimorfizm genetyczny - faza II
Różnice etniczne - N-aceetylotransferaza
Eskimosi -acetylacja szybka - 95-100%

Drogi prowadzące do uszkodzeń DNA i biologiczne wyniki uszkodzenia
Isoniazyd ( chemioterapie) - spadek uszkodzenia wątroby
Aromatyczne aminy - wzrost mutagenezy, karcenogenezy

Podstawy genetyczne i metaboliczne mechanizmów odpowiedzialnych za nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące

Podział promieniowania

• Jonizujące (wywołuje jonizację ośrodka, przez które przechodzi); źródło: przemiany jądrowe, zachodzące w jądrze atomowym, wyzwalającym energię)

• Korpuskolarne (odmiana jonizującego) - np. α, β

• Niejonizujące (promieniowanie radiowe, mikrofalowe)

Jednostki

• Natężenia

• Ci (kiur) - historyczne

• Bg - 1 Bg = 1 rozpad promieniotwórczy w ciągu 1 sekundy; 1 Ci = 3,7 x 10¹⁰ Bg

• Dawki pochłoniętej energii

• Gy - ilość pochłoniętej energii podzielona przez kg żywej materii; 1 Gy-100 Rad

• Jednostki dawki równoważnej (biologiczne skutki napromieniowania)

• Sv (sivert) - 1Gy = 1 Sv - X, γ, β; 1mSv = 0,001 Sv
  3-4 Sv to dawka letalna LD50130 (gdzie LD50 to populacja, a 130 to ilość dni)
  Promieniowanie jonizujące : 2,4 mSv to roczna dawka

Źródła promieniowania jonizującego

• Naturalne - występujące w warunkach naturalnych (glebach, żywności, roślinach oraz promieniowanie kosmiczne)

• 40,6% - radon

• 3% tryton

• 8,2% - źródła wewnętrzne

• 8,4% - promieniowanie kosmiczne

• 13,8% - gamma

• Sztuczne - izotopy promieniotwórcze, niewystępujące w przyrodzie, urządzenia jądrowe, opary rentgenowskie

• 25,4% - zastosowanie medyczne

• 0,2% - awaria czarnobylska

• 0,4% - inne

Biologiczne skutki u ludzi

• Somatyczne - występują bezpośrednio po napromieniowaniu całego ciała. Późniejsze skutki to białaczka, nowotwory kości, zaćma, bezpłodność

• WCZESNE

• Choroba popromienna

• Ostra

• Przewlekła

• Miejscowe uszkodzenia skóry

• ODLEGŁE

• Zmętnienie soczewek i zaćma

• Aberracje chromosomowe w komórkach somatycznych

• Nowotwory złośliwe

• Niepłodność

• GENETYCZNE

• Mutacje genowe

• Dominujące

• Recesywne

• Aberracje chromosomowe w komórkach rozrodczych

• Genetyczne - związane z mutacjami w obrębie materiału genetycznego. Duże dawki są najczęściej dawkami letalnymi. W wyniku promieniowania może wystąpić:

• Uszkodzenie DNA

• Zniszczenie lipoproteinowych składników błon komórkowych

• Zaburzenie syntezy białek

• Zmiana aktywności enzymatycznej

• Zaburzenie gospodarki elektrolitycznej

Mechanizmy ochronne przed ROS

• Zmiatacze rodników:

• glutation (GSH)

• witamina C

• kwas moczowy

• Enzymatyczne:

• Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD)

• Peroksydaza

• Katalaza

• Ochrona przez utlenowanie lipidów:

• Witamina E

• β-karoten

• Wiązanie metali:

• Transferryna (Fe)

• Ceruloplazmina (Cu)

Uszkodzenia DNA indukowane przez IR

1 Gy 600-1000 SSB

14-16 DSB

250 uszkodzenie zasad

Wpływ struktury chromatyny na indukowanie uszkodzeń DNA przez IR:
Usunięcie histonów: DNA jest 100x bardziej podatne na tworzenie SSB po naświetleniu przez IR

Aktywna chromatyna rozluźnienie bardziej wrażliwa na powstanie uszkodzeń w DNA

Podwójne pęknięcia DNA (DSB)

• Egzogenne

• X-Rays

• Endogenne

• Wolne rodniki

• Napięcia łańcucha DNA

• Zatrzymanie replikacji

• Zaprogramowane

• V(D)J rekombinacja

• „Class switching”

• „somatic hypermutation”

Mejoza, V(D)J rekombinacja, uszkodzenia DNA podczas replikacji podwójne pęknięcia DNA (DSB):

• śmierć komórki (apoptoza)

lub

• defektywna naprawa DNA nadwrażliwość, niestabilność genomu, nowotwory

Odpowiedź wczesna

Fosforylacja Ser 139 histonu H2AX przez ATM

Kompleks MRN (system rozpoznawania sensoru) i aktywacja ATM

Mre-11-Rad50-NBS1

ATM jako sensor

Białko ATM fosforyluje Ser 139 histonu H2AX; forma dimeru nieaktywna, połączenie się z NBS1 w MRN rozpad dimeru, kinaza ATM aktywuje się

---