ANALIZA INSTRUMENTALNA

ĆWICZENIE Nr 1

CHROMATOGRAFIA GAZOWA - ANALIZA ILOŚCIOWA WĘGLOWODORÓW ALIFATYCZNYCH METODA NORMALIZACJI WEWNĘTRZNEJ, WZORCA WEWNĘTRZNEGO ORAZ DODATKU WZORCA

Celem ćwiczenia jest porównanie metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii gazowej. Próbka zawierająca węglowodory alifatyczne (heksan, heptan, oktan, nonan, dekan) o nieznanym stężeniu będzie analizowana metodą normalizacji wewnętrznej, dodatku wzorca oraz wzorca wewnętrznego. Zadaniem studenta jest porównanie wyników poszczególnych analiz oraz wskazanie przyczyn ewentualnych różnic.

Część teoretyczna

Chromatografia gazowa jest powszechnie wykorzystywana do wykonywania analizy

ilościowej nawet bardzo złożonych mieszanin. Warunkami wykonania poprawnych pomiarów są: zachowanie stałych warunków analizy (jak np. stały przepływ gazu nośnego, stała lub zmieniająca się o stałą wartość temperatura kolumny), możliwie dużą powtarzalność kolejnych analiz, znajomość sposobu, w jaki detektor reaguje na konkretne związki. Duże znaczenie ma zakres liniowości wskazań detektora (zakres mas lub stężeń, dla których odpowiedź detektora jest liniowa). W obrębie tego zakresu powierzchnia lub wysokość piku substancji jest wprost proporcjonalna do masy/stężenia związku. Najpowszechniej wykorzystywanym detektorem w analizach ilościowych jest detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID - Flame Ionization Detektor), dlatego też omawiane zagadnienia będą dotyczyły głównie tego detektora.

Najdokładniejszą metodą wyznaczania odpowiedzi detektora jest określanie powierzchni pików. Wysokości pików są mniej przydatne, gdyż w przypadku, gdy część sygnałów jest poszerzona, uzyskane wartości nie będą proporcjonalne do udziału poszczególnych substancji w mieszaninie (rysunek 1a).

Rys. 1. Chromatogramy mieszanin n-alkanów w: a) możliwie dobrze dobranej izotermie (zwróć uwagę na poszerzenie ostatnich pików), b) w izotermie w zbyt wysokiej temperaturze oraz c) w programie temperaturowym[1].

Obecnie powierzchnie pików są zwykle wyznaczane automatycznie przez komputer lub rejestrator. Jeśli chcemy obliczyć powierzchnię sygnału symetrycznego, możemy użyć jednego ze wzorów:

S = hw_1/2h (1a)

S  0,5hw_b (1b)

gdzie: S - powierzchnia piku, h - jego wysokość, w_1/2h - szerokość w połowie

wysokości, w_b - szerokość przy podstawie.

Powierzchnię sygnału niesymetrycznego obliczamy ze wzoru:

(2)

gdzie: w0,15 i w0,85 oznaczają szerokość piku na 15 i 85% jego wysokości.

Detektor FID nie reaguje jednakowo na takie same masy różnych substancji. Aby otrzymane wyniki analiz ilościowych odpowiadały rzeczywistości, wprowadza się współczynniki odpowiedzi (korekcyjne) f. Współczynnik f w chromatografii jest nazywany współczynnikiem korekcyjnym powierzchni piku albo współczynnikiem odpowiedzi detektora dla określonej substancji. Jego wartości zależą zarówno od zasady działania detektora, jak i od właściwości każdej oznaczanej substancji i najczęściej jego wartość wyznacza się eksperymentalnie dla każdej analizowanej substancji w stosunku do wybranego wzorca (względny współczynnik korekcyjny). Współczynnik korekcyjny jest liczbą, przez którą należy pomnożyć powierzchnię piku, aby uzyskać wartość wprost proporcjonalną do masy związku. Wartości te ustala się wobec głównego składnika próbki lub stosowanego wzorca (dla tego związku przyjmujemy f = 1). W takim przypadku:

(3)

stąd:

(4)

gdzie: m_s i m_w oznaczają masę substancji badanej i wzorca, f - współczynnik

odpowiedzi, Y_s i Y_w - powierzchnie lub wysokości pików substancji badanej i wzorca.

Różnice we wskazaniach detektora FID dla różnych substancji można zaobserwować,

analizując roztwór zawierający równe masy tych substancji. Odpowiedzi detektora (a zatem

powierzchnie pików) nie będą jednakowe. Analizując złożone mieszaniny związków pochodzenia naturalnego, dla których trudno zdobyć wzorce, często przyjmuje się, że wartości współczynników odpowiedzi są jednakowe (równe 1) dla wszystkich substancji. Jest to źródłem pewnego błędu. Aby zminimalizować jego znaczenie, stosuje się wzorce dla każdego szeregu homologicznego, z którego związki są obecne w próbce. Współczynniki odpowiedzi dla homologów, które nie różnią się zbytnio masą (liczbą atomów węgla w cząsteczce), są w przybliżeniu jednakowe.

Istnieje kilka metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii gazowej:

 metoda kalibracji bezwzględnej (wzorca zewnętrznego),

 metoda normalizacji wewnętrznej,

 metoda wzorca wewnętrznego,

 metoda dodatku wzorca (z dodatkiem substancji oznaczanej).

Metoda kalibracji bezwzględnej (wzorca zewnętrznego)

W metodzie wzorca zewnętrznego sporządza się wykres kalibracyjny wykorzystując znane stężenia pojedynczych wzorców. Pomiary powinny być przeprowadzone, dla co najmniej pięciu stężeń z trzykrotnym powtórzenia dla każdego stężenia. Każde stężenie powinno być przygotowywane oddzielnie, a nie poprzez rozcieńczanie roztworu o większym stężeniu. Krzywe wzorcowe powinny obejmować spodziewany i aktualny zakres stężeń dla próbek rzeczywistych.

Rys.2. Krzywa kalibracyjna (wzorcowa) w metodzie wzorca zewnętrznego dla pięciu poziomów stężeń dozowanych wzorców.

Dla krzywej wzorcowej należy podać: równanie prostej, wielkość zakresu liniowego, współczynnik korelacji linii, wartość współczynnika liniowości lub wariancji „R²”
i liniowości „R”.

Aby obliczyć stężenie badanego składnika należy posłużyć się następującymi równaniami:

(5)

C_x = f *A_x (6)

gdzie:

f - współczynnik korekcyjny; A_wz, A_x - odpowiednio powierzchnia piku wzorca oraz oznaczanego składnika; C_wz, C_x - odpowiednio stężenie wzorca oraz oznaczanego składnika. Stężenie może być określone w jakiejkolwiek z często stosowanych form, np. jako stężenie molowe, w ppm.

W idealnych warunkach krzywa wzorcowa powinna przebiegać idealnie przez początek układu współrzędnych oraz charakteryzować się małym rozrzutem punktów pomiarowych. Jeżeli wartość odciętej jest większa od zera, może to świadczyć o obecności związków przeszkadzających, pochodzących od tła ślepej próbki. Jeżeli wartość odciętej jest ujemna, świadczy to pewnej stracie próbki podczas przygotowywania jej do dozowania. W tym przypadku krzywa wzorcowa nie zapewnia dokładnej analizy dla próbek rzeczywistych.

Otrzymanie idealnej krzywej kalibracji nie zawsze jest możliwe. Najczęstsze błędy powodujące odstępstwa od idealnej krzywej:

• niewystarczająca liczba punktów - minimalna liczba punktów to trzy, pięć punktów jest przyjętą zasadą,

• krzywa nieliniowa - jeżeli nie można uzyskać krzywej prostoliniowej mimo sprawdzenia metody, można zastosować mniej korzystną krzywą,

• nieodpowiednie rozmieszczenie punktów - punkty pomiarowe powinny być rozmieszczone równomiernie wzdłuż osi X, w przeciwnym razie dużym błędem mogą być obarczone zakresy bez punktów,

• niekompletna krzywa kalibracji - niepokrywa zakresu stężeń w rzeczywistych próbkach, nie wolno ekstrapolować krzywej do zakresu, który nie był badany.

Metoda normalizacji wewnętrznej

Metoda ta polega na wyznaczeniu udziału procentowego wszystkich substancji w próbce. Wymagane jest, aby na chromatogramie znajdowały się rozdzielone piki wszystkich składników obecnych w próbce. Po 2-3 zadozowaniach mierzy się powierzchnie poszczególnych pików i sumuje je. Otrzymana suma stanowi 100%, a stosunek powierzchni poszczególnych pików do sumy powierzchni wszystkich pików wyraża zawartość procentową substancji (i) w próbce

(7)

gdzie: j - liczna wszystkich składników w próbce od 1 do n, w praktyce j nie jest mniejsze od 2.

Otrzymane wyniki obarczone są dużym błędem i można je przyjąć za prawidłowe tylko wtedy, gdy właściwości fizykochemiczne składników próbki (np.; członów szeregu homologicznego) są podobne i podobna jest reakcja detektora względem każdego. Przykładowo wskazania detektora płomieniowo - jonizacyjnego zależą od ilości tworzących się w płomieniu wodorowym termojonów węgla (im więcej termojonów, tym większy sygnał). Tak, więc powierzchnia piku uzyskana z jednego mola etanu będzie dwa razy większa niż powierzchnia otrzymana z jednego mola metanu. Wzajemne stosunki powierzchni poszczególnych pików nie będą odpowiadać wzajemnym stosunkom ilościowym związków. Tak, więc należy wprowadzić poprawki, które pozwolą na wzajemne porównanie powierzchni analizowanych składników.

Po obliczeniu za pomocą równania 7 przybliżonego składu próbki, sporządza się mieszaninę wzorcową zawierającą te same, co próbka, składniki (odmierzone w ilościach obliczonych). Mieszaninę wzorcową dozuje się na kolumnę i po otrzymaniu chromatogramu, korzystając ponownie z równania 7, oblicza się procentową zawartość składników, a następnie dla każdego składnika wylicza się współczynnik korekcyjny

(8)

gdzie:

%S_ip - obliczona pierwotna procentowa zawartość składnik (i) w próbce,

%S_iwz - obliczona pierwotna procentowa zawartość składnik (i) w próbce wzorcowej.

Wyznaczone współczynniki korekcyjne wykorzystuje się do ostatecznego obliczenia procentowej masowej zawartości składników w próbce zgodnie z równaniem 9:

(9)

Innym sposobem wyznaczania współczynników korekcyjnych jest sposób opisany przy metodzie wzorca wewnętrznego (równanie 10a).

Jeżeli analizujemy związki zbliżone strukturalnie, nie jest konieczne wyznaczanie współczynników odpowiedzi. Dla substancji o różnej budowie należy wyznaczyć, w przeciwnym wypadku otrzymamy tylko szacunkowe wyniki.

Metoda wzorca wewnętrznego

Metoda ta jest bardzo często wykorzystywana, ponieważ umożliwia ilościowe oznaczenie jednego lub kilku składników mieszaniny nawet, gdy nie wszystkie składniki są dobrze rozdzielone. W metodzie wzorca wewnętrznego stosuje się wzorzec przypominający badaną substancję w jak największym stopniu i dodaje się go do badanej próbki przed przygotowaniem do analizy. Wzorzec wewnętrzny, o znanej strukturze, powinien charakteryzować się właściwościami chemicznymi i chromatograficznymi zbliżonymi do analitu. Powinien być dostępny w wysokiej czystości. Stężenie wzorca wewnętrznego powinno być zbliżone do stężenia badanego składnika.

Przygotowujemy dwie próbki: pierwsza zawiera wzorzec wewnętrzny oraz wzorzec oznaczanej substancji, druga jest naszą badana próbką zawierającą wzorzec wewnętrzny i oznaczaną substancję. Współczynniki korekcyjne wyliczamy dla próbki pierwszej z zależności między stosunkiem stężeń wzorca badanej substancji i wzorca wewnętrznego a stosunkiem odpowiedzi detektora dla wzorca badanej substancji i wzorca wewnętrznego zgodnie z równaniem:

lub
(10)

po przekształceniu:

lub
(10a)

stężenie badanego składnika w próbce drugiej wyliczamy:

lub
(11)

gdzie:

f - współczynnik korekcyjny; A_std, A_w, A_i - odpowiednio powierzchnia piku wzorca badanej substancji, wzorca wewnętrznego oraz oznaczanego składnika; C_istd, m_istd, C_i, m_i, C_w, m_w - odpowiednio stężenie, masa wzorca oznaczanego składnika, oznaczanego składnika i wzorca wewnętrznego.

Metoda z dodatkiem substancji oznaczanej

Metoda z dodatkiem substancji oznaczanej jest odmianą metody wzorca wewnętrznego, w której wzorcem jest związek oznaczany. Analiza ilościowa tą metodą polega na chromatografowaniu próbki substancji badanej i próbki tej substancji z dokładnie znaną ilością dodanej substancji oznaczanej. Z otrzymanych dwóch chromatografów oblicza się zawartość oznaczanego składnika na podstawie równań:

A₀ = aC_i (12)

A_i = a(C_i + C_istd) (13)

Po rozwiązaniu układu równań stężenie oznaczanego składnika wyliczamy:

(14)

gdzie:

A_0, A_i - odpowiednio powierzchnia piku oznaczanego składnika w próbce bez dodatku wzorca i w próbce z dodatkiem wzorca, C_i - stężenie oznaczanego składnika w próbce, C_istd - stężenie wzorca w próbce.

Cechy metod ilościowych

Podstawowe cechy metod ilościowych to: dokładność, precyzja, czułość metody, wykrywalność, oznaczalność.

W celu określenia dokładności i precyzji metody należy rozpatrzyć wyniki uzyskane przy zastosowaniu czterech metod analitycznych za pomocą, których wykonano wielokrotne pomiary składnika w próbce. Metoda dokładna to taka, która daje wyniki blisko wartości prawdziwej. Wielkość rozrzutu wyników charakteryzuje precyzję. Metodę, której wyniki mało różnią się od siebie, określamy jako metodę o dużej precyzji. Precyzja i dokładność nie zawsze idą w parze. Z pojęciem precyzji i dokładności związana jest czułość metody.

Czułość metody jest to najmniejsza różnica (stężenia składnika) w wynikach, jaka może być określona za pomocą tej metody. Wielkość ta związana jest z przyrządem pomiarowym. Zależność dokładności wyniku od czułości pomiaru występuje dla wszystkich metod, w których otrzymuje się krzywą wzorcową obrazującą zależność pomiędzy wielkością mierzoną a stężeniem. Otrzymuje się proste o różnym kącie nachylenia od podstawy. Jeżeli kąt nachylenia wynosi 45° mówimy wówczas o największej czułości.

Wykrywalność dotyczy najmniejszego stężenia granicznego lub ilości wykrywanego składnika, jakie można jeszcze wykryć stosując tą metodę.

Oznaczalność określa najmniejsze stężenie składnika możliwe do oznaczenia daną metodą. Pojęcie wykrywalności i oznaczalności są ze sobą ilościowo powiązane. Zwykle wykrywalność jest liczbowo 2-3 razy mniejsza niż oznaczalność. Związane jest to z tym, że pierwsza zauważalna zmiana wielkości mierzonej jest wystarczająca do stwierdzenia obecności danego składnika, lecz zbyt mała, aby ją dokładnie zmierzyć.

Granica wykrywalności jest to najmniejsze stężenie analitu w próbce, które może być wykryte, niekoniecznie oznaczone w danych warunkach eksperymentalnych:

(Fleming et al. 1997)

gdzie:

- wartość średnia wyników oznaczeń danego składnika w próbkach ślepych

- odchylenie standardowe wyników oznaczeń danego składnika w próbkach ślepych

Granica oznaczalności jest to najmniejsze stężenie analitu w próbce, które może być dokładnie oznaczone (w warunkach eksperymentalnych):

(Fleming et al. 1997)

Przykład:

• wyniki oznaczeń cynku w próbkach zerowych [µg/dm³]:

10; 60; 50; 42; 44; 24; 20; 32; 21; 15; 14; 10; 28; 10; 10

• wartość średnia tych wyników:
  [µg/dm³]

• odchylenie standardowe:
  = 16,27 [µg/dm³]

• obliczenie granicy oznaczalności:

= 26 - 6*16,27 = 123,62 [µg/dm³]

Wybrane wielkości w statystycznej analizie wyników

Analiza statystyczna pozwala na ocenę uzyskanych wyników w kategoriach matematycznych. Poniżej wybrane, podstawowe wzory:

• Średnia arytmetyczna z n wyników:

, x_i - oznacza pojedynczy wynik.

• Odchylenie standardowe pojedynczego wyniku (SD, standard deviation) - jest to miara rozrzutu wartości indywidualnych wokół średniej:

• Błąd standardowy, zwany odchyleniem standardowym średniej arytmetycznej (SE, standard error):

• Względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (RSE, relative standard error) określa wielkość błędu standardowego wobec wartości średniej i wyrażone jest w %:

Część doświadczalna

1. Odczynniki i aparatura:

• heksan, heptan, octan, nonan, dekan, acetonitryl;

• chromatograf gazowy HP 4890 z kolumną kapilarną HP-1 o długości 30m, średnicy 0.53mm z osadzonym dimetylosiloksanem, gaz nośny hel, detektor FID;

• mikrostrzykawka 10 µl.

2. Wykonanie ćwiczenia:

• przygotować próbkę badaną zawierającą mieszaninę węglowodorów (próbka A),

• przygotować próbkę do wyznaczania współczynników odpowiedzi (zawiera po 20μl heksanu, heptanu, oktanu, nonanu w 10ml roztworu) (próbka B),

• przygotować próbkę z wzorcem wewnętrznym (próbka badana (heksan, heptan, nonan) + 36,5μl oktan/10ml roztworu) (próbka C),

• przygotować próbkę badaną o nieznanym stężeniu heksanu (próbka D),

• przygotować próbkę z dodatkiem wzorca (próbka D + 19.5 μl heksan/10ml roztworu) (próbka E),

• ustalić warunki chromatografowania:

Przepływ gazu nośnego	13,0 cm^3/min
Temperatura kolumny	65°C
Temperatura dozownika	250°C
Temperatura detektora	300°C
Profil temperatury

• wykonać analizę badanej mieszaniny węglowodorów (próbka A) dozując próbkę o objętości 0.2 µl, analizę powtórzyć 2-3 razy,

• 2-3 -krotnie wykonać analizę próbki do wyznaczania współczynników odpowiedzi (próbka B),

• wykonać analizę próbki z wzorcem wewnętrznym (próbka C) dozując próbkę o objętości 0.2 µl,

• wykonać analizę próbki badanej ( próbka D) dozując próbkę o objętości 0.2 µl,

• wykonać analizę próbki z dodatkiem wzorca ( próbka E) dozując próbkę o objętości 0.2 µl,

3. Opracowanie wyników:

1. Z otrzymanych chromatogramów odpowiednio dla każdej próbki odczytać czasy retencji składników oraz powierzchnie pików, wyniki zebrać w tabeli 1,

2. Na podstawie gęstości związków obliczyć masy węglowodorów w próbce B, masę wzorca wewnętrznego w próbce C oraz masę dodanego heksanu w próbce E, wyniki zebrać w tabeli 2,

3. Zidentyfikuj poszczególne związki na chromatografach,

4. Obliczyć procentową zawartość składników w próbce A, wyniki przedstaw jako średnie arytmetyczne. Wyniki umieścić w tabeli 3,

5. Dla każdej analizy próbki B obliczyć współczynniki odpowiedzi badanych składników względem oktanu (dla oktanu f = 1) (równanie 4),

6. Korzystając z wyników analizy próbki C obliczyć masy i stężenie analitów w próbce metodą wzorca wewnętrznego. Pamiętać o obliczonych na podstawie próbki B współczynnikach odpowiedzi! Wyniki umieścić w tabeli 4.

7. Korzystając z wyników analizy próbki D i E obliczyć stężenie heksanu metodą dodatku wzorca.

8. Porównaj wyniki uzyskane dla heksanu przy zastosowaniu metody wzorca wewnętrznego z wynikami dla metody dodatku wzorca (zestaw wyniki w tabeli). Z czego wynikają różnice w uzyskanych wartościach? Która metoda daje Twoim zdaniem bardziej wiarygodne wyniki i dlaczego?

Tabela1.

Związek	Czas retencji tR	Powierzchnia A
Próbka A
Próbka B
Próbka C
Próbka D
Próbka E

Tabela 2. Masy węglowodorów

Związek	gęstość	masa
Próbka B
Próbka C
Próbka E

Tabela 3. Procentowa zawartość składników w próbce A

Związek	Wynik I	Wynik II	Średnia

Tabela 4. Zawartość składników w próbce C metodą wzorca wewnętrznego

Związek	Współczynnik odpowiedzi	Masa oznaczanej substancji	Stężenie oznaczanej substancji

Literatura:

1. Z. Witkiewicz, J. Hepter, Chromatografia gazowa, WNT, Warszawa 2009.

2. W. Szczepaniak „Metody instrumentalne w analizie chemicznej” PWN, Warszawa 2005.

10

---